专利名称：参芪复方中药成分免疫增强剂的制作方法
技术领域：
本发明一种新型参芪复方中药成分免疫增强剂，简称为参芪增免剂，属于增强畜禽免疫功能的新型免疫增强剂或提高动物传染病疫苗免疫效果的新型免疫佐剂。
二、技术背景畜禽传染病一直是危害畜牧业发展的首要问题，尤其是当前流行的重大病毒性传染病，迄今尚无有效的治疗方法，疫苗预防仍是最主要的措施。由于种种原因，多数疫苗只有与免疫增强剂或免疫佐剂配合应用才能发挥良好的防疫效果。但是，目前国内外广泛使用的油乳类、铝胶类等化学性免疫佐剂常有副作用大、局部刺激强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊端。因此，研制高效、低毒的新型免疫增强剂已成为亟待解决的问题。研究表明，许多中药具有免疫增强作用，具备高效、低毒的优势，然而由于中药的传统组方多为大复方，传统剂型多为汤剂、散剂，给药不便；而且由于其所含成分复杂，很难控制质量。
发明内容
技术问题本发明针对当前动物疫病防制现有技术中急需高效、低毒免疫增强剂或免疫佐剂的问题，提供一种新型复方中药成分免疫增强剂，具备安全、高效、质量可控等优点。
技术方案本发明一种新型参芪复方中药成分免疫增强剂，简称为参芪增免剂，其特征在于，每1000ml药液含人参皂苷0.75g，黄芪多糖3.0g，其余为注射用水。
生产每1000ml药液的工艺流程为人参皂苷购自制药厂，用TLC分光光度法测定含量；黄芪多糖用水煎醇沉法提取，用硫酸-蒽酮法测定含量；然后按净含量取处方量中药成分加注射用水溶解，精滤，分装，高压灭菌。
有益效果本发明首先选择文献报道有较好的增强免疫作用的黄芪多糖(APS)、淫羊藿多糖(EPS)、蜂胶多糖(PPS)、蜂胶黄酮(PF)、人参皂苷(GS)等10种中药成分为研究对象，分别提取制备、测定含量，用细胞培养、PCR和动物试验法比较它们的增强免疫作用和量效关系，筛选出5种作用较好的中药成分及其最佳剂量。以5种中药成分分别组成多个复方，通过系列动物试验筛选出效果较好的2个中药成分复方(方2为参芪增免剂)及其最佳剂量，并与目前常用的油佐剂进行比较。结果表明，参芪增免剂的增强免疫效果较好，与油佐剂的效果相当，在某些时间点甚至显著强于油佐剂(表1～表5，图1)。
进一步研究了参芪增免剂增强免疫的机理，测定该方对雏鸡外周血T淋巴细胞IL-2mRNA和IFN-γmRNA表达的影响。结果表明，参芪增免剂的高剂量能显著提高IL-2mRNA的表达，高、中、低3个剂量均能显著提高IFN-γmRNA的表达(图2～图3)。
通过临床试验比较了参芪增免剂与相应的中药复方的免疫增强效果。结果表明，参芪增免剂与相应的中药复方均能显著促进雏鸡淋巴细胞增殖和提高血清抗体效价，效果与油佐剂相当，但参芪增免剂的效果稍优于相应的中药复方(表6～表7)。
同时测定了参芪增免剂的安全性，证明参芪增免剂对家兔眼结膜和局部肌肉无任何刺激性，LD50大于5000mg/kg、无毒性。
与现有技术相比，本发明优点如下1.与同类化学佐剂相比，参芪增免剂不仅效果可靠，而且来源于天然中药，无毒副作用，无药残隐患，符合绿色药品要求，保障动物源食品安全；生产无三废，对环境无污染，符合绿色环保的要求。
2.与传统的中药方剂相比，参芪增免剂处方精练，剂型先进，质量提高，给药方便。
3.与相应的中药复方相比，该方剂功效提高，成分明确，质量可控。本发明作为免疫增强剂单用能显著提高畜禽的细胞免疫和体液免疫功能，显著促进外周血T淋巴细胞转化、提高血清抗体效价和免疫器官指数；作为免疫佐剂与疫苗同用具有较好的增强免疫效果，与油佐剂的效果相当，在某些时间点甚至显著强于油佐剂，而且也优于相应的中药复方；药理试验证明，该制剂能显著促进淋巴细胞增殖，提高鸡外周血中IL-2mRNA和IFN-γmRNA的表达。
四
图1.参芪增免剂配合兔瘟疫苗免疫家兔血清抗体效价的动态变化。参芪增免剂组在免疫后第3～21天的抗体效价均高于对照组、在免疫后第17天的抗体效价显著高于对照组；在免疫后第3、10、17天的抗体效价稍高于淫蜂增免剂组。
图2.参芪增免剂影响T淋巴细胞IL-2mRNA表达的RT-PCR电泳图(a)和统计结果(b)。参芪增免剂高剂量(cCHMIs2H)能显著提高淋巴细胞IL-2mRNA的表达。
图3.参芪增免剂影响T淋巴细胞IFN-γmRNA表达的RT-PCR电泳图(a)和统计结果(b)。参芪增免剂的3个剂量(cCHMIs2H、cCHMIs2M、cCHMIs2L)均能显著提高淋巴细胞IFN-γmRNA的表达。
五具体实施例方式
(一)方剂的筛选和药效药理学研究1.雏鸡免疫试验(1)方剂筛选及其与白介素-2免疫协同作用的比较将通过系列试验筛选出的黄芪多糖、当归多糖、淫羊藿多糖、蜂胶黄酮和人参皂苷分别组成的多个复方，单独或与白介素-2配合注射13日龄雏鸡，连续3天，在末次注射的同时用ND-IV系苗免疫，分别在免疫后第7、14、21、28天每组随机抽取10只翼下静脉采血，检测ND-HI抗体效价的动态变化。结果表明，复方中药成分增强免疫作用的效果强于单味中药成分，APS-GS(参芪增免剂)和EPS-PF(淫蜂增免剂)的作用较好，可作为新型免疫增强剂的候选方(表1)。
表1中药成分不同组合及其与白介素-2合用对鸡血清ND-HI抗体效价的影响(Log2)
(2)功效验证及其量效关系的比较试验1将参芪增免剂(方2)和淫蜂增免剂(方1)分3种剂量配合ND疫苗免疫雏鸡，以另2个中药成分复方(方3，2味组合；方4，3味组合)和纯疫苗为对照，测定血清中ND-HI抗体效价的动态变化。试验2将方1、方2的3个剂量分别降低一半配合ND灭活苗免疫雏鸡，以油佐剂苗及蜂胶佐剂苗为对照，测定血清抗体效价和免疫器官指数的动态变化。结果证实，参芪增免剂的效果确实，与油佐剂的效果相当，优于蜂胶佐剂，低剂量的效果最好(表2～表3)。
表2试验1各组血清ND-HI抗体效价的动态变化(Log2)
表3试验2各组血清ND-HI抗体效价的动态变化(Log2)
为了进一步筛选最佳剂量，试验3将方2、方1的3个剂量再分别降低一半，与新城疫疫苗病毒混合制成中药佐剂苗免疫雏鸡，以无佐剂苗和油佐剂苗为对照，于免疫后第7、14、21、28、35、42d采血，分别用MTT法和微量法测定外周血T淋巴细胞转化和血清ND-HI抗体效价的动态变化；同时测定2个复方对培养的鸡脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明，参芪增免剂能显著促进外周血T淋巴细胞转化、提高血清抗体效价，在多数时间点与油佐剂的效果相当，中剂量(原低剂量)的效果最好，在某些时间点显著强于油佐剂；在一定的浓度显著促进脾淋巴细胞增殖(表4～表5)。
表4外周血T淋巴细胞转化的变化(OD570)
表5血清ND-HI抗体效价的动态变化
2.家兔免疫试验用参芪增免剂和淫蜂增免剂分别配合兔瘟灭活苗免疫家兔，对照组为生理盐水，于免疫后第3、7、10、14、21、28、35、42天用血凝抑制试验法测定血清抗体效价的动态变化。结果表明，参芪增免剂和淫蜂增免剂均能显著提高家兔的血清抗体效价，参芪增免剂在免疫后某些时间点、尤其是早期的效果优于淫蜂增免剂(图1)。
3.复方增强T淋巴细胞IL-2mRNA表达的比较为了研究复方中药成分增强免疫的机理，从ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞提取总RNA，扩增出469bp的IL-2基因片段，然后采用半定量RT-PCR方法测定了参芪增免剂和淫蜂增免剂对鸡外周血T淋巴细胞IL-2mRNA表达水平的影响。结果表明，参芪增免剂高剂量能显著提高淋巴细胞IL-2mRNA的表达水平(图2)。
4.复方增强T淋巴细胞IFN-γmRNA表达的比较为了研究复方中药成分增强免疫的机理，应用Primer Premier软件设计了一对干扰素-γ引物，从ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增出510bp的IFN-γ基因片段，然后采用半定量PCR法测定了参芪增免剂和淫蜂增免剂对鸡外周血淋巴细胞IFN-γmRNA表达水平的影响。结果表明，参芪增免剂的3个剂量均能显著提高淋巴细胞IFN-γmRNA的表达水平(图3)。
(二)与相应的中药复方增强免疫效果的比较分别用淫羊藿多糖(EPS)加蜂胶黄酮(PF)、人参皂甙(GS)加黄芪多糖(APS)制成2个中药成分复方(cCHMI1，cCHMI2)，同时用相应的淫羊藿加蜂胶、人参加黄芪的提取物制成相应成分含量相同的2个中药复方(cCHM1，cCHM2)。将4个复方分别与灭活的新城疫强毒混合制成疫苗免疫雏鸡，以油佐剂苗(OA)和无佐剂苗(NA)为对照，分别于免疫后第7、14、21、28、35、42天用MTT法和血凝抑制试验法检测外周血淋巴细胞增殖和血清抗体效价的动态变化。结果表明，4个复方均能显著促进雏鸡淋巴细胞增殖和提高血清抗体效价，效果与油佐剂相当，但中药成分复方的效果稍优于中药复方(表6～表7)。
表6鸡淋巴细胞增殖的动态变化
表7.鸡血清抗体效价的动态变化
(三)安全性研究用家兔点眼法和股四头肌注射法测定了参芪增免剂的局部刺激性，用小鼠腹腔注射法测定了参芪增免剂的急性毒性，结果表明，参芪增免剂对家兔眼结膜和局部肌肉无任何刺激性，LD50为8435.29±1379.28mg/kg，根据文献，5000mg/kg以上为实际无毒，因此该制剂对动物无毒性。
实施例1000ml参芪复方中药成分免疫增强剂药液人参皂苷购自吉林亚威制药厂，用TLC分光光度法(刘俭健等.黄芪注射液中黄芪总皂苷的含量测定.上海中医，1997，733～34)测定含量；黄芪多糖用水提醇沉法(刘小平等.黄芪多糖口服液的研究.中药材，1994，17(6)40～43)提取，用硫酸-蒽酮法(赵文等.伊犁黄芪和蒙古黄芪成分的比较及多糖含量的测定.中草药，2001，32(2)122～124)测定含量；然后按净含量取人参皂苷0.75g，黄芪多糖3.0g分加注射用水溶解，精滤，分装，高压灭菌，获得。
试验证明，参芪增免剂作为免疫增强剂单独应用，能显著促进淋巴细胞增殖，显著提高鸡外周血T淋巴细胞IL-2mRNA和IFN-γmRNA的表达；作为免疫佐剂配合兔瘟疫苗免疫家兔，在免疫后第3～21天的抗体效价均高于、免疫后第17天的抗体效价显著高于不用佐剂的对照组；与新城疫疫苗病毒混合制成中药佐剂苗免疫雏鸡，以无佐剂苗和油佐剂苗为对照，能显著促进雏鸡外周血T淋巴细胞转化、提高血清抗体效价，在多数时间点与油佐剂组的效果相当，在某些时间点的抗体效价显著高于油佐剂组，也优于用人参和黄芪制成的中药复方。
权利要求
1.一种参芪复方中药成分免疫增强剂，简称为参芪增免剂，其特征在于，每1000ml药液含人参皂苷0.75g，黄芪多糖3.0g，其余为注射用水。
2.权利要求1所述参芪复方中药成分免疫增强剂的制备方法，其特征在于，人参皂苷购自制药厂，用TLC分光光度法测定含量；黄芪多糖用水提醇沉法提取，用硫酸-蒽酮法测定含量；然后按净含量取权利要求1所述的处方量中药成分加注射用水溶解，精滤，分装，高压灭菌，获得。
全文摘要
本发明为一种新型参芪复方中药成分免疫增强剂，简称为参芪增免剂，属于增强畜禽免疫功能的新型免疫增强剂。每1000ml药液含人参皂苷0.75g，黄芪多糖3.0g，其余为注射用水。临床试验证明，该制剂作为免疫增强剂单用能显著提高畜禽的细胞免疫和体液免疫功能，作为免疫佐剂与疫苗同用有较好的增强免疫效果，与油佐剂的效果相当，在某些时间点甚至显著强于油佐剂，而且也优于相应的中药复方。药理试验证明，该制剂能显著促进淋巴细胞增殖，显著提高鸡外周血T淋巴细胞IL－2mRNA和IFN－γmRNA的表达。安全试验证明，该药对动物无刺激性、无毒性。因此，参芪增免剂具有高效、安全、质量可控等优点。
文档编号A61P37/04GK101019885SQ20071001934
公开日2007年8月22日 申请日期2007年1月17日 优先权日2007年1月17日
发明者胡元亮, 王德云, 张宝康, 孔祥峰, 孙峻岭, 李祥瑞, 刘家国 申请人:南京农业大学