小清咽颗粒质量检查方法与流程

本发明涉及一种药物质量检查方法，具体涉及一种用于急性咽炎及上呼吸道感染引起的咽喉疼痛的治疗的小清咽颗粒质量检查方法。

背景技术：

小清咽颗粒一种用于急性咽炎及上呼吸道感染引起的咽喉疼痛的治疗的药物，具有滋阴润肺，消肿利咽之效。主要用于急性咽炎及上呼吸道感染引起的咽喉疼痛的治疗，对内、外诸邪侵犯咽喉，如外感，风热寒湿，温邪时毒，内伤饮食，辛辣煎煿，内蕴痰热等搏结气血、蕴结成毒，引发的咽喉疾患，症见咽喉红肿疼痛，吞咽困难，广泛溃烂，呼吸不利，咽痒咳嗽，声音嘶哑，发热恶寒等症。

小清咽颗粒由以下数量份数的原料药制成：桑叶390.6 g、板蓝根390.6 g、射干260.4 g、玄参260.4 g、甘草260.4 g、薄荷素油 2.5 mL、可溶性淀粉 433~550 g；制成1000 g。

制法是：将处方五味饮片，加10倍量的水（第一次煎煮加水12.5倍），浸泡1小时，煎煮3次，每次0.5小时。合并煎液，滤过。滤液常压浓缩至相对密度为1.35~1.40（60 ℃）的稠浸膏，至于80℃减压干燥。干膏粉碎成细粉（过60目筛）与可溶性淀粉433~550 g混合均匀，95 %乙醇适量制软材，14目筛制粒，60 ℃干燥，12目筛整粒，喷入薄荷素油2.5 mL，混匀，制成1000 g颗粒，分装，即得。

目前没有适用小清咽颗粒的质量检测方法，为了保证制剂的稳定性和疗效，需要对该药物的质量检测进行研究。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题提供一种用于小清咽颗粒质量检查方法，以保证该小清咽颗粒的稳定性和疗效。

本发明的技术方案如下：

小清咽颗粒质量检查方法，该小清咽颗粒1000g由以下数量份数的原料药制成：桑叶390.6 g、板蓝根390.6 g、射干260.4 g、玄参260.4 g、甘草260.4 g、薄荷素油 2.5 mL、可溶性淀粉 433~550 g；

其质量检测方法包括如下各项：

性状：本品为颗粒剂，棕黄色至棕褐色，气芳香，味微甘，略苦；

鉴别：采用薄层色谱法鉴别；

检查：符合颗粒剂项下有关的各项规定（《中国药典》（通则0104））；

浸出物测定：包括稀乙醇浸出物含量测定；

含量测定：包括射干苷的含量测定。

其中，鉴别包括：

（1）取本发明制剂制备供试品溶液，取板蓝根对照药材制备对照药材溶液，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的斑点；

（2）取本发明制剂制备供试品溶液，取射干对照药材制备对照药材溶液，照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

其中，浸出物测定按照如下步骤进行：取供试品精密称定，在锥形瓶中加稀乙醇，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时；放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取续滤液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量。

其中，射干苷的含量按照高效液相色谱法测定；以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1 %磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱；流速1 mL·min^-1；柱温25 ℃；检测波长265 nm。

通过以上方法，能够制定出小清咽颗粒的质量标准，从而实现对小清咽颗粒的质量检测，经实验证明，以该方法为标准检测小清咽颗粒，可以很好的保证制剂的稳定性，从而保证其疗效。

附图说明

图1是小清咽颗粒中板蓝根薄层鉴别1.阴性供试品（缺板蓝根药材）；2.板蓝根对照药材；3、4、5小清咽颗粒供试品（批号：20110201，20110202，20110203）；

图2是小清咽颗粒中射干薄层鉴别1.阴性供试品（缺射干药材）；2.射干对照药材；3、4、5小清咽颗粒供试品（批号：20110201，20110202，20110203）；

图3是小清咽颗粒中桑叶薄层鉴别1.阴性供试品（缺桑叶药材）；2.桑叶对照药材；3、4、5小清咽颗粒供试品（批号：20110201，20110202，20110203）；

图4是小清咽颗粒中玄参薄层鉴别1.阴性供试品（缺玄参药材）；2.玄参对照药材；3、4、5小清咽颗粒供试品（批号：20110201，20110202，20110203）；

图5是小清咽颗粒中甘草薄层鉴别1.阴性供试品（缺甘草药材）；2.甘草对照药材；3、4、5小清咽颗粒供试品（批号：20110201，20110202，20110203）；

图6是小清咽颗粒中薄荷素油薄层鉴别1.阴性供试品（缺薄荷素油）；2.薄荷素油；3、4、5小清咽颗粒供试品（批号：20110201，20110202，20110203）；

图7是高效液相色谱图:A 射干苷对照品；

图8是高效液相色谱图:B 颗粒剂提取液；

图9是阴性浸膏对照溶液色谱图；

图10是阴性颗粒溶液色谱图；

图11是射干苷线性关系考察试验结果；

图12是颗粒剂中射干苷含量测定的精密度试验HPLC图谱；

图13是颗粒剂中射干苷含量测定的稳定性试验HPLC图谱；

图14是颗粒剂中射干苷含量测定的重复性试验HPLC图谱；

图15是颗粒剂中射干苷含量测定的回收率试验HPLC图谱上半部分；

图16是颗粒剂中射干苷含量测定的回收率试验HPLC图谱下半部分；

图17是颗粒剂色谱图(358 nm)；

图18是芦丁对照品色谱图；

图19是哈巴俄苷对照品叠加颗粒剂样品色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

实施例1：

组方小清咽颗粒，由以下原料药制成：桑叶 390.6 g、板蓝根 390.6 g、射干 260.4 g 、玄参 260.4 g、甘草260.4 g、薄荷素油2.5 mL、可溶性淀粉433~550g，制成1000 g。

制法将处方五味饮片，加10倍量的水（第一次煎煮加水12.5倍），浸泡1小时，煎煮3次，每次0.5小时。合并煎液，滤过。滤液常压浓缩至相对密度为1.35~1.40（60 ℃）的稠浸膏，至于80℃减压干燥。干膏粉碎成细粉（过60目筛）与可溶性淀粉433~550 g混合均匀，95 %乙醇适量制软材，14目筛制粒，60 ℃干燥，12目筛整粒，喷入薄荷素油2.5 mL，混匀，制成1000 g颗粒，分装，即得。

性状本品为颗粒剂，棕黄色至棕褐色，气芳香，味微甘，略苦。

鉴别

（1）取本制剂0.5 g，加稀乙醇20 mL，加热回流20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取板蓝根对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5~10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（19:5:5）为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的斑点。

（2）取本制剂1 g，加甲醇10 mL，加热回流30分钟，滤过，滤液浓缩至1.5 mL，作为供试品溶液。另取射干对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8:2:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

检查应符合颗粒剂项下有关的各项规定（《中国药典》（通则0104））。

浸出物测定

取供试品2 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加稀乙醇50 mL，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取续滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量。本品含稀乙醇浸出物含量不低于43 %。

含量测定

射干苷照《中国药典》高效液相色谱法（通则0512）测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基键合硅胶为填充剂（依利特Hypersil BDS C₁₈（250 mm × 4.6 mm，5 μm））；以乙腈-0.1 %磷酸水溶液为流动相（表1），梯度洗脱；流速1 mL·min^-1；柱温25 ℃；检测波长265 nm；理论板数按射干苷计算应不低于3000。

对照品溶液的制备精密称取干燥至恒定质量的射干苷对照品10.56 mg，加50%甲醇适量溶解，定容至50 mL，配制成0.2112 mg·mL^-1的对照品溶液，即得。

供试品溶液的制备精密称取小清咽颗粒1 g于锥形瓶中，加25 mL 50 %甲醇摇匀，静置30 min，称定重量，超声提取60 min，补重，滤过。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含射干苷不得少于0.22%。

功能主治滋阴润肺，消肿利咽之效。主要用于急性咽炎及上呼吸道感染引起的咽喉疼痛的治疗，对内、外诸邪侵犯咽喉，如外感，风热寒湿，温邪时毒，内伤饮食，辛辣煎煿，内蕴痰热等搏结气血、蕴结成毒，引发的咽喉疾患，症见咽喉红肿疼痛，吞咽困难，广泛溃烂，呼吸不利，咽痒咳嗽，声音嘶哑，发热恶寒等症。

实施例2：

1.鉴别

本品由桑叶、板蓝根等五味中药材组成，经提取、精制而成，成分较复杂。我们对各味中药材的成分进行了鉴别方法的试验研究，建立了板蓝根、玄参、射干的薄层鉴别方法。

（1）板蓝根的鉴别：取本制剂0.5 g，加稀乙醇20 mL，加热回流20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺板蓝根的阴性模拟制剂0.5 g，同法制备阴性对照溶液。另取板蓝根对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5~10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（19:5:5）为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。经3批中试样品验证，此方法重复性好，故将其收入质量标准草案正文（见图1）。

（2）射干的鉴别：取本制剂1 g，加甲醇10 mL，加热回流30分钟，滤过，滤液浓缩至1.5 mL，作为供试品溶液。取缺射干的阴性模拟制剂1 g，同法制备阴性对照溶液。另取射干对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8:2:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。经3批中试样品验证，此方法重复性好，故将其收入质量标准草案正文（见图2）。

（3）桑叶的鉴别：取本制剂2 g，加石油醚（60~90℃）30 mL，加热回流30分钟，弃去石油醚液，药渣挥干，加乙醇30 mL，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加热水10 mL，置60℃水浴上搅拌使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺桑叶的阴性模拟制剂2 g，同法制备阴性对照溶液。另取桑叶对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:2:1）的上层溶液为展开剂，置用展开剂预饱和10分钟的展开缸内，展开约至8 cm，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。因该方法重复性不佳，暂不列入质量标准草案（见图3）。

（4）玄参的鉴别：取本制剂2 g，加甲醇25 mL，浸泡1小时，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺玄参的阴性模拟制剂2 g，同法制备阴性对照溶液。另取玄参对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（12:4:1）的下层溶液为展开剂，置用展开剂预饱和15分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以5 %香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。因该方法重复性不佳，暂不列入质量标准草案（见图4）。

（5）甘草的鉴别：取本制剂5 g，加正丁醇25 mL，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺甘草的阴性模拟制剂5 g，同法制备阴性对照溶液。另取甘草对照药材5 g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5~10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。因该方法重复性不佳，暂不列入质量标准草案（见图5）。

（6）薄荷素油的鉴别：取本制剂1 g，加无水乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺薄荷素油的阴性模拟制剂1 g，同法制备阴性对照溶液。另取薄荷素油 0.1 g，同法制成对照药材溶液。照《中国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5~10 μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-（19:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。因该方法重复性不佳，暂不列入质量标准草案（见图6）。

浸出物测定

参考小清咽颗粒组成中药饮片在《中国药典》中的相关药材浸出物的溶剂选择，结合小清咽颗粒组成药材所含化学成分特性（主要为甾体类、三萜类、黄酮类、吲哚类生物碱等），综合考虑选择稀乙醇作为小清咽颗粒的醇浸出物溶剂。

测定方法

取供试品2 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加稀乙醇50 mL，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取续滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量。计算公式如下：

2.2通过对小清咽颗粒8个批次的的样品进行醇溶性浸出物测定，如下表所示，结果表明：其醇溶性浸出物平均含量为54.0%。以其醇溶性浸出物平均含量下浮20%为低限，质量检测应当要求小清咽颗粒的醇溶性浸出物的含量不低于43.2%。

含量测定

3.1材料

3.1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），安捷伦液相色谱系统化学工作站； AG135型电子天平（万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）；CSF-1B超声波清洗仪（上海超声波仪器厂）；DZ-2BC II真空干燥器。

试剂

甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；磷酸（遵义师范学院化学试剂厂）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其余试剂均为分析纯。

对照品

射干苷对照品(中国生物制品检定所，批号111632-200501) ；芦丁(中国生物制品检定所，批号：100080-200707)。

制剂样品

小清咽颗粒由于贵阳中医学院第二附属医院药学部制剂室生产。

方法与结果

3.2.1 色谱条件

依利特Hypersil BDS C₁₈（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1 %磷酸水溶液，梯度洗脱；柱温25 ℃；检测波长265 nm；进样量5 µL。结果表明，在此条件下能达到较好的分离效果，分离度大于1.5，拖尾因子为0.95。流动相梯度见表1，实验结果见图7，图8、图9和图10。

对照品溶液制备

精密称取燥至恒定质量的射干苷对照品10.56 mg，加50 %甲醇适量溶解，定容至50 mL，配制成0.2112 mg/mL的对照品溶液，即得。

供试品的制备

精密称取浸膏粉及射干饮片各1g于锥形瓶中，加 25 mL 50 %甲醇摇匀，静置30 min，称定重量，超声提取60 min，补重，滤过。

空白试验

取缺射干的阴性样品1 g，按“3.2.3”项下制备阴性对照溶液，按含量测定方法试验，阴性样品的HPLC 图谱中，未呈现与射干苷对照品保留时间相同的色谱峰，表明本法专属性良好。

射干苷测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积按外标法计算。

方法学考察

3.2.6.1 线性关系考察

精密吸取射干苷对照品溶液，配制系列浓度对照品溶液。即42.24，84.48，126.72，168.96，211.20ug·mL^-1，照“3.2.1”项下色谱条件测定峰面积，分别重复进样3次，以峰面积平均值（A）对进样量（X）作线性回归，得回归方程为：Y=4147.19044X+5.142816，r = 0.99989。结果表明，射干苷进样量在42.24~211.20 μg范围内与峰面积呈良好线性关系，见表3，图11。

精密度试验

精密吸取同一浓度射干苷对照品溶液5 µL，照“3.2.3”项下色谱条件，注入高效液色谱仪，重复进样6次，测定峰面积。RSD为0.49%，结果表明，仪器精密度良好，见表4，图12。

稳定性试验

取同一浸膏粉约1 g，精密称定，照“3.2.3”项下方法制备供试品溶液，照“3.2.1”项下色谱条件，分别于0，2，4，6，8，10，12 h 进样测定，每次进样5 µL，计算射干苷峰面积的RSD为0.36%，结果表明，小清咽颗粒剂供试品溶液在12h内稳定，见表5，图13。

重复性试验

取颗粒剂6份，每份约1 g，精密称定，照“3.2.3”项下方法制备供试品溶液，照“3.2.1”项下色谱条件依法测定，计算射干苷含量的RSD为0.83%，结果表明，本法测定的重复性良好，见表6，图14。

加样回收率试验

取已测定含量的小清咽颗粒9份，每份约1 g，精密称定，分别加0.8，1.0，1.2倍量射干苷对照品，照“3.2.3”项下方法制备供试品溶液，照“3.2.1”项下色谱条件依法测定，计算射干苷平均回收率分别为103.4%，99.60%，100.2%，RSD分别为 1.9%，1.6%，2.5%，结果表明，本法测定准确度较高，见表7，图15、图16。

水煎煮工艺含量测定指标选择

本处方由桑叶、射干、玄参等组成，其中桑为君药，均占处方的39.06%，射干占26.06%。最初尝试选用桑叶中芦丁，玄参中哈巴俄苷为测量指标，结果其中含量低于万分之一，均不能作为质量控制指标，因此最终确定射干苷为质量控制指标（见图17，图18，图19）。

色谱条件的选择

3.4.1 色谱柱的选择

分别采用了：依利特Hypersil BDS C₁₈（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Agilent SB-C₁₈（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱进行分析试验，结果表明依利特Hypersil BDS C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱分离效果最好，故选择该色谱柱。

流动相的选择

分别采用了乙腈-0.03%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，结果表明流动相为时，色谱峰分离效果及色谱峰形较好，故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相。

柱温考察

分别采用25℃和30℃柱温进行分析，25℃的柱温所得的分离效果最好，故选择25℃作为色谱柱温度。

供试品提取条件的选择

3.5.1提取溶剂的选择

分别采用了甲醇、50%甲醇、70%乙醇作为提取溶剂，超声提取30 min、45 min、60 min。结果表明以50%甲醇超声提取含量最高，故选择50%甲醇作为提取溶剂。

提取方式的选择

用50%甲醇，分别采用回流提取60 min，超声提取60 min。结果表明以超声提取60 min供试品溶液，故选择超声提取60 min。

提取时间的选择

用50%甲醇，分别比较了超声提取30 min、45 min和60 min。超声提取60 min射干苷含量较高，且峰形较好，故选择超声提取60 min。

当然，以上只是发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。