一种卷烟主流烟气中生物胺的测定方法与流程

本发明涉及卷烟烟气中成分的检测技术领域，具体涉及一种卷烟主流烟气生物胺的测定方法。

背景技术：

生物胺是一类具有生物活性的含氮的低分子量碱性有机化合物的总称，它们是生物体自身合成荷尔蒙、核苷酸、蛋白质的前体，可以看作是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后形成的低分子量生物碱。生物胺根据其结构可以分为三类：脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等)，芳香胺(酪胺、β-苯乙胺等)和杂环胺(组胺、色胺等)。

生物胺主要由氨基酸脱羧作用形成，少部分通过醛或酮的胺化作用形成，各种动植物组织细胞中都含有少量的生物胺，其产生的条件主要有三个：一是有可形成生物胺的游离氨基酸，二是存在可代谢产生氨基酸脱羧酶的微生物，三是适合该微生物生长的环境。生物胺普遍纯在于多种食品和含酒精的发酵饮料中。生物胺不仅是食物香气的重要来源，也是N-亚硝基化合物合成的前体。当人体摄入过量生物胺时，极易引起神经系统和心血管系统损伤，我国于2008年出台了相关标准对食品中的生物胺提出了限量要求。

目前生物胺的检测一般采用高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(GC)，上述的检测方法都需要对样品进行衍生，操作较为复杂。目前，高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)由于其不需要对样品进行衍生、且具有高灵敏度和准确性越来越多的应用于痕量高沸点物质的检测。

烟草作为一种特殊的食品，其也含有大量的蛋白质和氨基酸，且其生产过程中需要对原料进行纯化，容易产生生物胺。生物胺属于中等沸点化合物，在卷烟抽吸过程中，烟叶中的生物胺容易直接迁移进卷烟烟气中，且氨基酸的脱羧作用也容易产生生物胺，因此建立卷烟烟气中的生物胺的定性和定量的检测方法十分必要。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术中的缺点，提供一种卷烟主流烟气生物胺的测定方法，该方法是利用液相色谱-串联质谱法来同时测定卷烟主流烟气中的7种生物胺，能够快速有效的检测卷烟主流烟气中生物胺的含量。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种卷烟主流烟气中生物胺的测定方法，包括以下步骤：

(1)制备混合系列标准工作溶液：配制具有浓度梯度且含有内标的混合系列标准工作溶液；

(2)样品前处理：将烟支样品(重量在±0.02g范围和平均吸阻在±49Pa/支范围内)放置于21～23℃、相对湿度为58～62％的环境中平衡48～96h，采用转盘式吸烟机，按照每60秒抽吸一口，每口抽吸容量35ml，抽吸持续时间2s，用直径92mm的剑桥滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物，每张滤片收集20支卷烟的总粒相物，取收集20支卷烟的总粒相物的1张滤片置于250mL锥形瓶中，加入30mL2vol％甲酸水溶液，超声萃取30分钟；

(3)固相萃取柱净化：取步骤(2)得到的萃取液过混合型阳离子交换固相萃取柱(DIKMA ProElut PXC 150mg/6mL)，洗脱后，将洗脱液置于氮气下吹干，再采用2mL乙腈水溶液进行复溶，得到样品净化液；

(4)将步骤(1)得到的含有内标的混合系列标准工作溶液和步骤(3)得到的样品净化液在相同条件下进行HPLC-MS/MS测定；

(5)结果计算：由目标分析物峰面积和内标峰面积之比采用内标法进行定量。

所述步骤(1)制备混合系列标准工作溶液的具体过程如下：配制浓度梯度为0.5，1，2，5，10，25ng/mL的混合标准工作溶液，每个浓度的混合标准工作溶液的内标1,7-庚二胺的浓度为10ng/mL；浓度梯度为0.5，1，2，5，10，25ng/mL的混合标准工作溶液中，腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺、色胺七种生物胺的浓度分别均为0.5，1，2，5，10，25ng/mL(比如混合标准工作溶液梯度为0.5ng/mL时，混合标准工作溶液中腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺、色胺七种生物胺的浓度分别均为0.5ng/mL)。

HPLC-MS/MS测定的条件如下：

色谱条件：

选用亲水作用色谱柱，流速为0.2～0.5mL/min，进样量为5～10μL；分析时间为14min；柱温为40℃；流动相为A和B的混合体系，A为甲酸铵和甲酸的混合水溶液，其中甲酸与水的体积比为0.1:100，甲酸铵的含量15～25mmol/L；B为甲酸乙腈溶液，其中甲酸与乙腈的体积比为0.1:100；采用梯度洗脱，其中B在不同时间段的的体积百分比为：0～1min，95％；1～12min，95％～45％；12～14min，95％；

质谱条件：

离子源，电喷雾离子源(ESI)；扫描模式，正离子扫描；检测方式，多反应监测(MRM)；电喷雾电压，5500V；气帘气压力，0.124Mpa；辅助气1(N₂)压力，0.379Mpa；辅助气2(N₂)压力，0.345Mpa；离子源温度，600.00℃。

所述步骤(3)中洗脱过程如下：用2mL甲酸水溶液和2mL甲醇依次淋洗后用10mL氨水甲醇溶液洗脱，其中甲酸水溶液中甲酸的体积分数为1～2％，氨水甲醇溶液中氨水(25wt％)的体积浓度为3％～7％。

所述的亲水作用色谱柱为Agilent Hilic柱，规格为：3.5μm；2.1mm×100mm。

本发明产生的有益效果是：本发明先采用剑桥滤片对主流烟气进行捕集，应用固液萃取-串联固相萃取为前处理手段，采用高效液相色谱法-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定烟草中的七种生物胺(腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺和色胺)。本发明与文献相比，建立了一种适合于测定卷烟主流烟气中生物胺的方法，建立的方法简单可靠，可以应用于卷烟主流烟气中生物胺的检测；该方法对样品分析简单便捷，检出限低、灵敏度高、重复性和回收率好。

附图说明

图1为标样中腐胺的MRM图；

图2为标样中尸胺的MRM图；

图3为标样中组胺的MRM图

图4为标样中酪胺的MRM图

图5为标样中精胺的MRM图

图6为标样中亚精胺的MRM图；

图7为标样中色胺的MRM图；

图8为标样中内标1,7-庚二胺的MRM图。

具体实施方式

下将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种烟草中生物胺的测定方法，包括以下步骤，

(1)制备混合系列标准工作溶液：配制具有浓度梯度且含有内标的混合系列标准工作溶液；

(2)样品前处理：将卷烟样品放置于22℃，相对湿度为60％的环境中平衡48h，然后选其平均重量在±0.02g范围和平均吸阻在±49Pa/支范围内的烟支作为测试烟支。采用转盘式吸烟机，按照每60秒抽吸一口，每口抽吸容量35ml，抽吸持续时间2s。用直径92mm的剑桥滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物，每张滤片收集20支卷烟的总粒相物，取收集20支卷烟的总粒相物的1张滤片置于250mL锥形瓶中，准确加入30mL 2vol％甲酸水溶液，超声萃取30分钟后。

(3)固相萃取柱净化：将步骤(2)得到的萃取液取10mL过PCX阳离子交换固相萃取柱(DIKMA ProElut PXC 150mg/6mL)，用2mL甲酸水溶液(体积分数2％)和2mL甲醇依次淋洗后用10mL氨水甲醇溶液(氨水甲醇溶液中25wt％氨水的体积浓度为3％～7％)洗脱，洗脱液氮气吹干后溶解于2mL乙腈水溶液(乙腈和水的体积比为95:5)中，得到样品净化液；

(4)将步骤(1)得到的含有内标的混合系列标准工作溶液和步骤(3)得到的样品净化液在相同条件下进行HPLC-MS/MS测定；HPLC-MS/MS测定的条件如下：

色谱条件为：

选用亲水作用色谱柱(Agilent Hilic柱，规格为：3.5μm；2.1mm×100mm)，流速为0.3mL/min，进样量为10μL；分析时间为14min；柱温为40℃；流动相为A和B的混合体系，A为甲酸铵和甲酸的混合水溶液，其中甲酸与水的体积比为0.1:100，甲酸铵的含量25mmol/L；B为甲酸乙腈溶液，其中甲酸与乙腈的体积比为0.1:100；采用梯度洗脱，其中B在不同时间段的体积百分比为：0～1min，95％；1～12min，95％～45％(在1～12min时间段从95％线性连续变到45％)；12～14min，95％；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式，正离子扫描；检测方式，多反应监测(MRM)；干燥气(N₂)温度和流速：290℃，11L/min；雾化器压力，206.85kPa(30psi)；鞘气(N₂)温度和流速，400℃，12L/min；毛细管电压(Capillary voltage)，3500V；碎裂电压(Fragmentorvoltage)，380V；碰撞气：N₂。

(5)结果计算：由目标分析物峰面积和内标峰面积之比采用内标法进行定量；具体如下：以含有内标的混合系列标准工作溶液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，目标分析物的浓度为横坐标，绘制工作曲线，得到目标物的标准曲线回归方程及相关系数；根据样品净化液中目标分析物峰面积和内标峰面积之比，代入工作曲线，得到样品净化液的含量。主流烟气中杂环胺类化合物的释放量由下面公式计算得出：

式中：m----每支卷烟主流烟气杂环胺类化合物的释放量，单位为纳克每支(ng/cig)；A----样品净化液中杂环胺类化合物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。

所述步骤(1)制备混合系列标准工作溶液的具体过程如下：配制浓度梯度为0.5，1，2，5，10，25ng/mL的混合标准工作溶液，每个浓度的混合标准工作溶液的内标1,7-庚二胺的浓度为10ng/mL；浓度梯度为0.5，1，2，5，10，25ng/mL的混合标准工作溶液中，腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺、色胺七种生物胺的浓度分别均为0.5，1，2，5，10，25ng/mL(比如混合标准工作溶液梯度为0.5ng/mL时，混合标准工作溶液中腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺、色胺七种生物胺的浓度分别均为0.5ng/mL)。用HPLC-MS/MS进行测定。

7种生物胺(腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺、色胺)及其内标1,7-庚二胺的MRM参数见表1(图1－8为7种生物胺和内标1,7-庚二胺的MRM图)。

表1七种生物胺及内标1,7-庚二胺的MRM参数^①

注：①CE为碰撞能量；DP为去簇电压；*为定量离子。

以最低浓度含有内标的混合系列标准工作溶液进行10次测定，计算得到7种生物胺(腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺和色胺)的标准偏差，以三倍标准偏差作为检出限。结果表明(表2)方法线性好、检出限低。

表2七种生物胺的线性回归方程及线性相关系数和检测限

为了考察本发明方法的重现性，向烟草样品中加入加入七种生物胺的标准溶液，制备高(40ng/mL)、中(10ng/mL)、低(1ng/mL)三个水平的加标样，然后用本发明测定方法对其分析，扣除样品中空白试验生物胺的含量，计算其测定量，并由加标量和测定量计算回收率，每个浓度水平做三个平行(结果见表3)。结果表明，三个水平的回收率在88.3-106％之间。

表3七种生物胺的加标回收率

对上述的低浓度加标样(1ng/mL)按照本发明测定方法进行6次日内和日间平行测定。结果表明，各化合物测定的日内和日间相对标准偏差在0.8-4.1％之间，说明该方法的重现性和稳定性很好(结果见表4)。

表4七种生物胺的日内日间精密度

实施例3

取卷烟样品1-5#，按照本发明测定方法进行样品分析，样品分析结果见表5所示。

表5烟叶样品中生物胺的含量

注：“-”表示样品中未检出。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。