一种用于检测血脂的单层膜生化干片及制备方法与流程

本发明属于医疗器械技术领域，涉及一种临床体外检测试剂的改进。

背景技术：

血浆中所含脂类统称为血脂，主要包括胆固醇（或总胆固醇）（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。血浆脂类含量虽只占全身脂类总量的极小一部分，但外源性和内源性脂类物质都需经进血液运转于各组织之间。因此，血脂含量可以反映体内脂类代谢的情况。

流行病学与临床研究证实，血浆胆固醇和甘油三酯水平的升高与动脉粥样硬化的发生有关，动脉粥样硬化、冠心病的发生率与血清高密度脂蛋白胆固醇水平呈负相关，而与低密度脂蛋白胆固醇水平呈正相关。血脂代谢异常是造成动脉粥样硬化和脂肪肝等多种疾病的重要危险因素。近年来随着人们生活水平的提高，血脂代谢紊乱成日趋增高，成为严重影响人们健康水平的重要因素。

血脂分析对于临床高脂血症和异常脂蛋白血症的诊断及动脉粥样硬化、心血管病（如冠心病）的危险评估和防治具有重要意义，并已经渗透应用于其他诸多临床相关专业疾病的研究。因此血脂分析及其临床应用已越来越受到临床各学科的重视。

干化学又称为固相化学，是将一项测定中所需的全部或部份试剂预固定在干片载体中，根据Kubelka-Munk理论，其反射率与固相层厚度、单位厚度的光吸收系数及固相反应层的散射系数有关，当固相层厚度和固相反应层的散射系数固定时，反射率仅与单位厚度的光吸收系数有关，而单位厚度的光吸收系数大小与待测物浓度成正比，通过测定反射率，可计算出待测物浓度。测定时将液体样品如血清、血浆、全血、尿液、脑脊液等直接滴加到固定有试剂的生化干片上，以检测样品中的水分作为溶剂，引起待测物与干片中预固定的试剂发生化学反应并产生反应信号，最后通过目视或仪器检测，实现待测物浓度进行定性、半定量或定量检测。

与湿化学法相比，干化学分析法具有仪器小型便携、操作简单、干试剂易于保存、检测速度快、样本消耗量小、不需配置任何液体试剂，检验工作可随时随地进行，检测时间短，操作简便，准确度和精密度较高。该技术只需要仪器及其配套干片，不需要湿化学中所使用的液体试剂或任何溶液。干片为一次性使用，无任何废液产生，能够避免污染。并且能够应用在湿化学法无法触及的领域，如宇宙空间站、战场、野外或舰艇等临床检验，还可应用于食品安全、环境监测等领域。

目前，干化学产品大多数都依赖进口，如占市场份额最大的美国强生、瑞士Roche和日本京都等大公司，而国内干化学研究起步较晚，大多应用国外成熟技术，仅在外观结构上加以改进，除较简单的干化学尿液试纸和分析仪外，还没有更多的干化学仪器和试剂载体产品出现。这种局面造成了干化学法检验的成本升高，不利于干化学分析技术在我国医学检验中的推广和应用。多层膜结构干片的研制，存在制备复杂、成本高等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种用于检测血脂的单层膜生化干片及制备方法，解决了制备的干片操作复杂的问题，同时具有线性范围较宽，重复性、稳定性良好，检测限较低，检测速度快，操作简单的特性。

本发明的技术方案是：在直径为6 mm圆形厚度为0.3 mm、流速为130 mm/30 min、载水量为10 μL的单层层析滤纸上同时固定胆固醇检测试剂A（胆固醇酯酶，抗坏血酸氧化酶，ESPAS（ADPS））和检测试剂B（胆固醇氧化酶，4-氨基安替比邻林），该层析滤纸贴附在盖玻片上。

其中，所述的胆固醇检测试剂A中的胆固醇酯酶≥300 U/L，抗坏血酸氧化酶≥1000 U/L，ESPAS（ADPS）100 mg/L；检测试剂B中的胆固醇氧化酶≥500 U/L，4-氨基安替比邻林150 mg/L。

本发明的方法：

（1）将层析滤纸剪成直径为6 mm圆形，备用；

（2）将（1）中的长方形层析滤纸摆放在载玻片上，首先向载玻片上的层析滤纸喷涂9-11 μL胆固醇检测试剂B，超低温（-80 ℃）冷冻10 min，并在真空冷冻干燥机中-30 ℃冻干，冻干时间大约为30-40 min，该步骤重复3-5次；然后向同一层析滤纸喷涂9-11 μL胆固醇检测试剂A，超低温（-80 ℃）冷冻10 min，并在真空冷冻干燥机中-30 ℃冻干，冻干时间大约为30-40 min，该步骤重复3-5次；检测不同血脂指标，检测试剂加样量、冻干时间及加样次数各不相同；

（3）将（2）中固定有检测试剂的层析滤纸转移至24×24 mm盖玻片中央，即为胆固醇检测单层膜生化干片；

（4）上机检测：使用全光谱干式生化分析仪对（3）所制备生化干片进行检测，检测波长为550 nm，育温时间1 s，检测时间240 s，加样量10 μl，标准品为2倍连续稀释；

（5）制备干片的检测标准曲线及标准色阶

采用上述制备的血脂干片和全光谱干式生化分析仪，建立标准品浓度与反射光相对强度之间的函数关系，作为检测胆固醇浓度的依据。以标准品溶液生化干片反射光相对强度平均值为纵坐标Y，以标准品中待测物浓度（单位为mmol/L）为横坐标X，建立的胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）与高密度脂蛋白（HDL-C）的干式生化分析法测定标准曲线，如图2至图4所示，符合对数函数关系。所建立的干式生化分析法测定的三种单层膜干片的检测限分别为0.0517 mmol/L、0.113 mmol/L、0.249 mmol/L，线性范围分别为3.44~25.83 mmol/L 、2.46~12.3 mmol/L、1~3.24 mmol/L。用梯度稀释的标准品加入制备的生化干片，以血清为空白对照，胆固醇标准品为2倍梯度稀释加入血清中，样品混匀后滴加在所制备的干片上，待反应结束即制得不同颜色的标准色阶，可用于样品检测的半定量分析。

本发明的有益效果是：线性范围较宽，重复性、稳定性良好，检测限较低，检测速度快，操作简单，患者可自行检测，该生化干片为单层膜结构，能够有效降低成本，因此可用于临床快速检测，具有良好的经济效益和应用前景。

批内与批间精密度与准确度检测

应用上述方法一次制备三种血脂干片各20片，并检测血清样本，每样本同一天内重复测定20次，计算检测结果平均值、相对标准偏差及变异系数，所测数据的批内重复性如图6所示。

应用上述方法一次制备三种血脂干片各20片，并检测血清样本，每样本每天重复测定2次，共测定10天，计算检测结果平均值、相对标准偏差及变异系数，所测数据的批间重复性如图7所示。

由上述结果表明，分别制备的血脂三项单层膜生化干片的批内、批间不精密度和不准确度均小于5%，在允许范围内。

附图说明

图1是本发明制备方法的原理图；

图2是本发明干式生化分析方法测定胆固醇(TG)的标准曲线；

图3是本发明干式生化分析方法测定甘油三酯(TC)的标准曲线；

图4是本发明干式生化分析方法测定高密度脂蛋白(HDL-C)的标准曲线；

图5是本发明生化干片的结构图；

图6是批内重复性实验的平均值、相对标准偏差、变异系数表；

图7是批间重复性实验的平均值、相对标准偏差、变异系数表。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步描述：

实施例1

制备的生化干片采用直径为6 mm圆形厚度为0.3 mm、流速为130 mm/30 min、载水量为10 μL的单层层析滤纸。通过将血脂检测液体生化试剂固定到层析滤纸上，建立了血脂检测单层膜生化干片的制备方法，制备出血脂检测单层膜生化干片的标准色阶，并采用全光谱干式生化分析仪，建立干片反射光相对强度（Y）与血脂标准品浓度（X）的定量检测标准曲线，并确定了测定的相关参数，如温育时间，加样量等。至此建立了血脂检测单层膜干式生化测定方法。

下面以胆固醇为例进行说明；

（1）将层析滤纸剪成直径为6 mm圆形，备用；

（2）将（1）中的长方形层析滤纸摆放在载玻片上，首先向载玻片上的层析滤纸喷涂9-11 μL胆固醇检测试剂B，超低温（-80 ℃）冷冻10 min，并在真空冷冻干燥机中-30 ℃冻干，冻干时间大约为30-40 min，该步骤重复3-5次；然后向同一层析滤纸喷涂9-11 μL胆固醇检测试剂A，超低温（-80 ℃）冷冻10 min，并在真空冷冻干燥机中-30 ℃冻干，冻干时间大约为30-40 min，该步骤重复3-5次；检测不同血脂指标，检测试剂加样量、冻干时间及加样次数各不相同；

（3）将（2）中制备的固定有生化试剂的层析滤纸转移至24×24mm盖玻片中央，即为制备的胆固醇检测的单层膜生化干片。

（4）上机检测：使用全光谱干式生化分析仪对（3）所制备生化干片进行检测，检测波长为550 nm，育温时间1 s，检测时间240 s，加样量10 μl，标准品为2倍连续稀释；

（5）制备干片的检测标准曲线及标准色阶

采用上述制备的血脂干片和全光谱干式生化分析仪，建立标准品浓度与反射光相对强度之间的函数关系，作为检测胆固醇浓度的依据。以标准品溶液生化干片反射光相对强度平均值为纵坐标Y，以标准品中待测物浓度（单位为mmol/L）为横坐标X，建立的胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）与高密度脂蛋白（HDL-C）的干式生化分析法测定标准曲线，如图2至图4所示，符合对数函数关系。所建立的干式生化分析法测定的三种单层膜干片的检测限分别为0.0517 mmol/L、0.113 mmol/L、0.249 mmol/L，线性范围分别为3.44~25.83 mmol/L 、2.46~12.3 mmol/L、1~3.24 mmol/L。用梯度稀释的标准品加入制备的生化干片，得到对应干片标准色阶，可用于待检样品浓度进行半定量。