本发明涉及一种免疫化学发光法(ICMA)快速检测尿甾体激素的方法，属于分析化学和医学领域。
背景技术：
甾体激素主要包括肾上腺皮质激素和性激素(包括雄性激素及蛋白同化激素、孕激素和雌激素等)，对维持生命、机体发展、性功能调节、免疫调节和生育控制等方面发挥着极其重要作用。多年来，雌三醇(E3)、氢化可的松(HC)、17β-雌二醇(17β-E2)、睾酮(T)和孕酮(P)等血甾体激素已成为人类许多疾病如内分泌疾病等诊治的临床常用监测指标，但由于体内血甾体激素分泌波动较大，故其单次血样仅代表人体内瞬间甾体激素水平，且血样采集的有创性等缺点往往是影响临床诊治患者或流行病学调研人群依从性的主要原因之一。尿液收集具有无创便捷的优点，尿甾体激素能够反映体内一段时间内其血中的平均水平，以尿样采集替代血样采集可明显提高临床患者和流行病学研究人群的依从性，近年来，随着色谱-质谱联用技术和标记免疫测定技术的飞速发展，其检测效能极大提高，尿甾体激素检测临床和流行病学研究以及样本酶解与免疫化学发光法检测设备一体化的研发应用前景诱人。
目前第三代标记免疫测定技术如免疫化学发光法等已经普遍地应用于临床人血甾体激素的检测，但其在尿甾体激素的应用尚处于研究阶段。1969年Abraham等首次报道了采用放射性免疫分析法测定血浆中的雌激素，该方法具有灵敏性、特异性和精确性的特点，在随后的10年采用放射性免疫分析法测定了许多天然和合成类固醇，但该法具有繁琐耗时、需要样本量大、易出现抗体交叉反应及同位素污染等缺点。于是放射性免疫分析法逐渐被非放射性配体的方法替代，如化学发光法、酶催化法和荧光法等，这些方法不需要放射性免疫分析法所需的有机溶液萃取分离步骤，允许在自动化平台上直接进行免疫分析，能迅速测定甾体激素等，具有方便、简单、迅速、价格相对低廉及需要样本量较少等优点，给人血和尿甾体激素的检测带来了新的机遇。
近年来，ICMA检测尿总17β-E2、总E3等甾体激素已引起学者关注。Peper JS等用ICMA检测41例青春期女孩晨尿总17β-E2水平(检测范围150～9000pmol/L)，结果显示大脑灰质体积与尿17β-E2呈负相关。郑国金等建立了管式磁性微粒子ICMA检测尿总E3的方法，结果显示其线性范围为1～100μg/L，检出限为0.25μg/L，提示此法具有良好的稳定性和重现性。尽管尿甾体激素可反映其体内某时段平均水平，且尿样采集具有无创便捷等优点，但由于相关文献报道较少、所研究的甾体激素种类单一、检测繁琐或设备限制等，其在临床性发育异常等疾病诊治中应用受限。针对上述情况，本发明提出了酶解法结合ICMA检测尿5种临床常用甾体激素的方法。
技术实现要素：
本发明针对现有技术不足，提供一种酶解法结合ICMA快速检测尿E3、HC、17β-E2、T和P 5种甾体激素的方法，使其应用于人体尿液甾体激素，为了解机体的生理过程、疾病的发生发展机制及个性化治疗方案提供有效信息和依据。该方法快速、灵敏、准确，可满足人尿5种甾体激素同时检测的要求。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种免疫化学发光法快速检测尿甾体激素的方法，采用β-葡萄糖醛酸酶酶解法结合ICMA同时检测尿E3、HC、17β-E2、T和P 5种甾体激素，定量限为0.017～4ng/mL，即5种甾体激素质控校正品的最低浓度是0.017～4ng/mL并将其作为定量限，步骤为：
第一步：收集尿液，离心除杂质后保存；
第二步：取第一步得到的尿液0.5mL于5mL的玻璃刻度管中，加入1.0mL乙酸-乙酸钠缓冲液和1800～2200U的β-葡萄糖醛酸酶水溶液混匀后，盖上瓶盖密封，50～60℃水浴3h；
第三步：采用ICMA检测尿5种甾体激素。
上述第一步中的离心条件为：10,000rpm/min离心5min，尿液的保存温度为-20℃。
采用上述的检测方法后，尿5种总甾体激素的批内差为3.2～9.6％，批间差为3.5～12.4％，回收率为93.7％～117.9％，稀释度和尿各甾体激素相关系数均>0.99，尿液反复冻融3次后相对标准偏差小于10％。
采用本发明具有如下优点或者有益效果：
(1)本发明操作简单，快速，灵敏，可满足人尿5种甾体激素同时检测的要求，且所用试剂廉价易得，成本低；
(2)本发明验证了尿液基质对甾体激素检测的影响较小；
(3)本发明稀释倍数在2～32倍，检测范围广且准确。
(4)本发明有助于研发样本酶解与ICMA检测一体化设备。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但在本发明保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
利用本发明检测女性尿液5种甾体激素。
取女性新鲜过夜晨尿500μL，10,000rpm/min离心5min，取上清液于-20℃存贮。准确量取尿样0.5mL于5mL的玻璃刻度管中，加入1.0mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.0)和1800～2200U的β-葡萄糖醛酸酶水溶液混匀后，置于50～60℃水浴中酶解3h。将刻度管冷却至室温后，稀释至仪器检测范围内进行ICMA检测。测定尿样前分别用E3、HC、17β-E2、T和P校准品质控，使用ICMA仪自带的软件对数据进行处理。标准溶液基质S0作为零标准点。
实施例2
利用本发明检测男性尿液5种甾体激素。
取男性新鲜过夜晨尿500μL，10,000rpm/min离心5min，取上清液于-20℃存贮。准确量取尿样0.5mL于5mL的玻璃刻度管中，加入1.0mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.0)和1800～2200U的β-葡萄糖醛酸酶水溶液混匀后，置于50～60℃水浴中酶解3h。将刻度管冷却至室温后，稀释至仪器检测范围内进行ICMA检测。测定尿样前分别用E3、HC、17β-E2、T和P校准品质控，使用ICMA仪自带的软件对数据进行处理。标准溶液基质S0作为零标准点。
实施例3
利用本发明检测尿总甾体激素的加标回收率评价。
在本法确定的实验条件下，将5种甾体激素经过预处理步骤后，检测酶解后总甾体激素浓度；不同尿样加入不同浓度的某一甾体激素标准品溶液检测某一浓度甾体激素的回收率，即不同尿样中分别加入低、中、高不同浓度的甾体激素标准品溶液，用ICMA检测加标样的浓度，并与已知量的标准品相比较，重复试验6次，计算得到尿样平均加标回收率见表2。E3、HC、17β-E2、T和P平均回收率范围在93.7％～117.9％之间，表明本发明方法的准确性高。
表2 ICMA检测尿总甾体激素的平均回收率(n＝6)
实施例4
利用本发明检测尿总甾体激素的稀释实验。
稀释实验是用于考察标准品溶液与样品之间是否具有同质，检验方法测定的结果可靠性。用标准溶液基质S0逐级倍比稀释E3、HC、17β-E2、T和P高值的酶解后尿样，得到稀释度分别为1/2、1/4、1/8、1/16和1/32的尿样后，用ICMA分别检测5种甾体激素的浓度。以稀释度作为x轴，尿样中各甾体激素测定值为y轴，得到各拟合直线方程和相关系数如表3所示，结果表明，相关系数均>0.99，即稀释度的线性关系良好。
表3 ICMA检测尿总甾体激素的稀释度
实施例5
利用本发明检测尿总甾体激素的稳定性评价
分别取低、中、高三种不同浓度的尿样，采用本发明的ICMA前处理后，反复冻融3次检测，计算5种总甾体激素的相对标准偏差均在10％以下，结果表明尿结合态甾体激素酶解稳定性良好。
实施例6
ICMA与超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对比检测尿总甾体激素。
ICMA与UPLC-MS/MS检测尿总甾体激素的均值和标准差结果见表4。ICMA检测尿5种总甾体激素的浓度较UPLC-MS/MS高0.96～1.15倍，两种方法分别检测男、女性尿检结果比较差异均无统计学意义。由于成年男女性腺不同，女性P、E3和17β-E2平均浓度较男性高，而男性T较女性均值高。部分男性的17β-E2、E3和P及女性T因低于检测限而未被检测出。
表4 ICMA与UPLC-MS/MS对比检测尿总甾体激素的结果
以ICMA检测尿总甾体激素的结果为横坐标，UPLC-MS/MS的检测结果为纵坐标，做线性回归方程曲线，得出的斜率均小于1，表示ICMA检测值总体稍偏高于UPLC-MS/MS，HC、T和P的斜率分别为0.9598、0.9525和0.9790，反映两者总体结果近似，而E3和17β-E2的斜率为0.8702和0.7727，ICMA对尿雌激素检测值稍偏高。除HC为正态分布，计算Pearson相关系数为0.930，余均不符合正态分布，计算Spearman相关系数，E3、17β-E2、T和P的相关系数分别为0.939、0.905、0.971和0.957。两种方法对比检测的ICC(95％可信区间)分别为0.931(0.8577；0.9668)，0.941(0.8945；0.9679)，0.893(0.8027；0.9446)，0.964(0.9268；0.9825)和0.947(0.9002；0.9720)，表示ICMA和UPLC-MS/MS检测尿甾体激素的一致性很高。表5为ICMA与UPLC-MS/MS检测尿甾体激素线性回归方程斜率、截距和线性、组内相关系数。
表5 ICMA与UPLC-MS/MS检测尿甾体激素线性方程斜率、截距和线性、组内相关系数
本对比实验显示ICMA与UPLC-MS/MS检测尿5种总甾体激素具有高度一致性。ICMA和UPLC-MS/MS检测尿5种甾体激素结果无统计学差异，但就绝对值而言，ICMA检测的尿5种总甾体激素的浓度似乎高于UPLC-MS/MS检测的结果，尤其是尿E3和17β-E2，提示可能ICMA检测尿5种甾体激素时存在一定程度的免疫交叉反应等非特异反应可能；从两种检测方法检测的尿5种甾体激素的结果一致性来看，两种检测方法检测尿5种甾体激素的相关系数为0.905～0.971，ICC为0.893～0.964，提示ICMA与UPLC-MS/MS金标准一样，均可准确检测尿5种总甾体激素，提示ICMA检测过程中出现的这种非特异反应等不影响结果的分析。