蛋白保护剂的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及肿瘤标志物Hsp90α的蛋白保护剂。

背景技术：

热休克蛋白90α(Heat shock protein 90α，Hsp90α)是真核细胞胞质中含量最为丰富的伴侣蛋白之一，约占正常细胞内总蛋白含量的1-2％。在肿瘤细胞中，Hsp90α的含量可高达胞内蛋白总量的2-7％(Whitesell,L.and S.L.Lindquist.,2005,Nat Rev Cancer.5(10),761-772)，对提高肿瘤发生和发展过程中相关蛋白质因子的稳定性和辅助其行使功能都是必需的。研究显示，Hsp90α在许多肿瘤细胞的表面高表达，包括小细胞癌，黑色素瘤，和肝癌细胞株(Ferrarini et al.,1992,Int.J.Cancer.51,613-19)。另有文章报道，分泌到血清中的Hsp90α与非小细胞肺癌的临床分期相关(Xu et al.,2007,J.Cancer Mol.3,107-112)。

2013年，我国科学家首次发现并证明血浆中的Hsp90α是一个全新的肿瘤标志物，自主研发的Hsp90α定量检测试剂盒(酶联免疫法)于2013年4月获得了国家第三类(最高类别)医疗器械证书，并通过了欧盟CE认证，获准进入中国和欧盟市场。这是人Hsp90α被发现24年来，世界首个获批用于临床的产品，对于提高肿瘤患者的病情监测和疗效评价水平、实现肿瘤个体化治疗具有重要推动作用。

在Hsp90α定量检测试剂盒中，Hsp90α蛋白是抗原标准品，其质量直接决定着试剂盒的各项检测性能，因此对质量要求极高。但是，Hsp90α蛋白质分子极易受到物理或化学因素的影响而发生构象和其性质的改变，如：发生变性。蛋白质一旦变性，伴随着1)稳定性下降；2)生物活性的丧失；3)一些侧链基团的暴露；4)物理化学性质的改变；5)生物化学性质的改变。并且，蛋白质浓度越低，其稳定性越差，越容易发生变性。因此，在蛋白质药物和诊断试剂研发及产业化领域，制备结构稳定、活性高的蛋白质样品是保障产品质量的重要核心技术。

Hsp90α蛋白的空间构象柔性极强，富于变化，其晶体结构至今尚未获得。该蛋白理化性质独特，不稳定(见图1)，且其稳定性随着温度升高而显著降低，即使在常温下也会很快形成聚体，(Minami et al.,1993)，特别是在蛋白质浓度低的条件下更易变性而失去活性。目前，临床中使用的Hsp90α定量检测试剂盒的保质期也仅为12个月，主要受Hsp90α蛋白抗原标准品稳定性的限制。

工业上有多种方法来防止蛋白质变性，如：冷冻干燥技术、加入蛋白质保护剂等。常用的蛋白质保护剂有多羟基化合物、糖类、蛋白质、聚合物、氨基酸、表面活性剂、胺类等。

多羟基化合物用作蛋白的保护剂由来已久，常见的有甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇等。

氨基酸是一类常见的蛋白质保护剂，通过降低缓冲盐结晶的速度和程度来保护蛋白质冻干药品，减轻其活性丢失。例如，在冷冻过程中，甘氨酸可通过抑制磷酸缓冲盐结晶所致pH值改变而阻止蛋白质药物变性。常用做蛋白质保护剂的氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸等。

一些蛋白质也可被用作保护剂，如：牛血清白蛋白就是一个经典、优良的蛋白保护剂。1％牛血清白蛋白可以使兔肌肉乳酸脱氢酶的活性在冷冻时不受损失。

此外，吐温80、十二烷基环酸钠等表面活性剂也可对冷冻及干燥过程中的蛋白质起到一定的保护作用。

由于蛋白质的稳定机制非常复杂，实际操作中很难用单一保护剂实现对蛋白质的有效保护，有些保护剂甚至会在蛋白质的不同形态或条件下起到完全相反的作用(Chang et al.,1993,J.Pharm Res.10(10),1478-1483)。因此，为了增强保护效果，通常需要多种保护剂搭配使用。但由于蛋白质性质各异，很难针对不同的蛋白质建立通用的保护剂配方，所以开发更优的蛋白保护剂仍然是现今生物医药研发领域关注的一个重点。以往未见有Hsp90α蛋白质长期储存的报道。

技术实现要素：

本发明提供蛋白保护剂，所述蛋白保护液在传统蛋白保护剂的基础上，加入其它保护剂成分，所述其它保护剂成分选自磷酸腺苷(AMP)、肝素钠、MgCl2、聚乙烯吡咯烷酮40(PVP40)、茶多酚、环糊精和K₂SO4。本发明的蛋白保护剂可有效保护Hsp90α蛋白的活性，提高Hsp90α的稳定性，在纳克级的浓度下不变性。

根据本发明的一方面，提供蛋白保护剂，其含有酸碱调节剂、表面活性剂、蛋白质类型的保护剂和其它保护剂，或者由它们组成；其中所述其它保护剂是选自肝素钠、MgCl₂、AMP、PVP40、茶多酚、环糊精和K₂SO₄的一种或多种成分。

在一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂和肝素钠的重量比是5:0.01-1。

在一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是茶多酚，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂和茶多酚的重量比是5:0.1-5。

在一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是环糊精，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂和环糊精的重量比是5:0.5-5。

在另一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂的重量比是：5:1-20:0.1-5:0.69-3.47:0.48。

在另一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄的重量比是：5:0.01-0.1:1-20:0.1-5:0.69-3.47:0.48:0.87-8.71。

在另一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:1-20:0.1-5:0.69-3.47:0.48:0.87-8.71:0.5-5。

在另一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:0.01-0.1:1-20:0.1-5:0.69-3.47:0.48:0.87-8.71:0.5-5。

在更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂的重量比是：5:1:0.1:0.69:0.48。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂的重量比是：5:20:5:3.47:0.48。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂的重量比是：5:10:0.5:1.74:0.48。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄的重量比是：5:0.01:1:0.1:0.69:0.48:0.87。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄的重量比是：5:0.1:20:5:3.47:0.48:8.71。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:1:0.1:1.74:0.48:0.87:0.5。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:20:5:3.47:0.48:8.71:5。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:0.01:1:0.1:1.74:0.48:0.87:0.5。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:0.1:20:5:3.47:0.48:8.71:5。

在最优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述蛋白保护剂中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:0.1:20:5:1.74:0.48:0.87:0.5。

优选地，所述蛋白保护剂中所含的酸碱调节剂的量是使所述蛋白保护剂在水中形成含蛋白质类型的保护剂0.5％浓度的溶液时该溶液的pH值为约6.5的量。

本发明的蛋白保护剂中表面活性剂的含量可以是任何适当的量，适当的表面活性剂的量可以由本领域技术人员根据常规技术确定。优选地，在所述蛋白保护剂中，表面活性剂和蛋白质类型的保护剂的体积重量比是2:5(ml:g)，表面活性剂和其它成分之间的比例可以按此比例计算。

前述蛋白保护剂可以是任何适当的形式。在一些实施方案中，本发明的蛋白保护剂是溶液的形式，即蛋白保护液，所述蛋白保护液含有酸碱调节剂、表面活性剂、0.5％的蛋白质类型的保护剂和其它保护剂，或者由它们组成，其pH值为6.5。

在一些实施方案中，所述其它保护剂是0.01-1mg/ml肝素钠、0.01％～0.5％茶多酚或0.05％-0.5％环糊精。

在另一些实施方案中，所述其它保护剂选自：

1)0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP和5mM MgCl₂；

2)0.01-0.1mg/ml肝素钠、0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂和5mM-50mM K₂SO₄；

3)0.1％-2％PVP40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂、5mM-50mM K₂SO₄和0.05％-0.5％环糊精；或

4)0.01-0.1mg/ml肝素钠、0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂、5mM-50mM K₂SO₄和0.05％-0.5％环糊精。

在更优选的实施方案中，所述其它保护剂选自：

1)0.1％PVP 40、0.01％茶多酚、2mM AMP和5mM MgCl₂；

2)2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP和5mM MgCl₂；

3)1％PVP 40、0.05％茶多酚、5mM AMP和5mM MgCl₂；

4)0.01mg/ml肝素钠、0.1％PVP 40、0.01％茶多酚、2mM AMP、5mM MgCl₂和5mM K₂SO₄；

5)0.1mg/ml肝素钠、2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂和50mM K₂SO₄；

6)0.1％PVP40、0.01％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄和0.05％环糊精；

7)2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂、50mM K₂SO₄和0.5％环糊精；

8)0.01mg/ml肝素钠、0.1％PVP40、0.01％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄和0.05％环糊精；或

9)0.1mg/ml肝素钠、2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂、50mM K₂SO₄和0.5％环糊精。

在特别优选的实施方案中，所述其它保护剂是0.1mg/ml肝素钠、2％PVP40、0.5％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄和0.05％环糊精。

优选地，在所述蛋白保护液中，表面活性剂的含量是0.2％(体积百分比)。

本发明的蛋白保护剂用于保护Hsp90α，可作为Hsp90α的冻干保护剂。

根据本发明的另一方面，提供上述任一种蛋白保护剂在冷冻干燥Hsp90α中的应用。

根据本发明的另一方面，提供上述任一种蛋白保护剂在制备Hsp90α的定量校准品、质控品或定量检测试剂盒中的应用。

根据本发明的另一个方面，提供Hsp90α保护组合物，其含有Hsp90α和上述任一种蛋白保护剂。

具体而言，所述Hsp90α保护组合物含有Hsp90α、酸碱调节剂、表面活性剂、蛋白质类型的保护剂和其它保护剂，或由它们组成；其中所述其它保护剂是选自肝素钠、MgCl₂、AMP、PVP40、茶多酚、环糊精和K₂SO₄的一种或多种成分。

在一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂和肝素钠的重量比是5:0.01-1。

在一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是茶多酚，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂和茶多酚的重量比是5:0.1-5。

在一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是环糊精，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂和环糊精的重量比是5:0.5-5。

在另一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂的重量比是：5:0.01-0.1:1-20:0.1-5:0.69-3.47:0.48。

在另一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄的重量比是：5:0.01-0.1:1-20:0.1-5:0.69-3.47:0.48:0.87-8.71。

在另一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:1-20:0.1-5:0.69-3.47:0.48:0.87-8.71:0.5-5。

在另一些优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:0.01-0.1:1-20:0.1-5:0.69-3.47:0.48:0.87-8.71:0.5-5。

在更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂的重量比是：5:1:0.1:0.69:0.48。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂的重量比是：5:20:5:3.47:0.48。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP和MgCl₂的重量比是：5:10:0.5:1.74:0.48。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄的重量比是：5:0.01:1:0.1:0.69:0.48:0.87。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂和K₂SO₄的重量比是：5:0.1:20:5:3.47:0.48:8.71。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:1:0.1:1.74:0.48:0.87:0.5。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:20:5:3.47:0.48:8.71:5。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:0.01:1:0.1:1.74:0.48:0.87:0.5。

在另一个更优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:0.1:20:5:3.47:0.48:8.71:5。

在最优选的实施方案中，所述其它保护剂是肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精，且所述Hsp90α保护组合物中蛋白质类型的保护剂、肝素钠、PVP 40、茶多酚、AMP、MgCl₂、K₂SO₄和环糊精的重量比是：5:0.1:20:5:1.74:0.48:0.87:0.5。

优选地，所述Hsp90α保护组合物中所含的酸碱调节剂的量是使所述Hsp90α保护组合物在水中形成含蛋白质类型的保护剂0.5％浓度的溶液时该溶液的pH值为约6.5的量。

本发明的Hsp90α保护组合物中表面活性剂的含量可以是任何适当的量，适当的表面活性剂的量可以由本领域技术人员根据常规技术确定。优选地，在所述Hsp90α保护组合物中，表面活性剂和蛋白质类型的保护剂的体积重量比是2:5(ml:g)，表面活性剂和其它成分之间的比例可以按此比例计算。

优选地，在所述Hsp90α保护组合物中，Hsp90α和蛋白质类型的保护剂之间的重量比是2x10^-5-4x10^-4:5，Hsp90α和其它各成分之间的重量比可以按此比例计算。

本发明的Hsp90α保护组合物可以是Hsp90α冻干粉的形式。

根据本发明的另一个方面，提供Hsp90α溶液，其中含有Hsp90α、酸碱调节剂、表面活性剂、0.5％的蛋白质类型的保护剂和其它保护剂或由它们组成，其pH值为6.5。

在一些实施方案中，所述其它保护剂是0.01-1mg/ml肝素钠、0.01％～0.5％茶多酚或0.05％-0.5％环糊精。

在另一些实施方案中，所述其它保护剂选自：

1)0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP和5mM MgCl₂；

2)0.01-0.1mg/ml肝素钠、0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂和5mM-50mM K₂SO₄；

3)0.1％-2％PVP40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂、5mM-50mM K₂SO₄和0.05％-0.5％环糊精；或

4)0.01-0.1mg/ml肝素钠、0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂、5mM-50mM K₂SO₄和0.05％-0.5％环糊精。

在更优选的实施方案中，所述其它保护剂选自：

1)0.1％PVP 40、0.01％茶多酚、2mM AMP和5mM MgCl₂；

2)2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP和5mM MgCl₂；

3)1％PVP 40、0.05％茶多酚、5mM AMP和5mM MgCl₂；

4)0.01mg/ml肝素钠、0.1％PVP 40、0.01％茶多酚、2mM AMP、5mM MgCl₂和5mM K₂SO₄；

5)0.1mg/ml肝素钠、2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂和50mM K₂SO₄；

6)0.1％PVP40、0.01％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄和0.05％环糊精；

7)2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂、50mM K₂SO₄和0.5％环糊精；

8)0.01mg/ml肝素钠、0.1％PVP40、0.01％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄和0.05％环糊精；或

9)0.1mg/ml肝素钠、2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂、50mM K₂SO₄和0.5％环糊精。

在特别优选的实施方案中，所述其它保护剂是0.1mg/ml肝素钠、2％PVP40、0.5％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄和0.05％环糊精。

优选地，所述Hsp90α溶液中表面活性剂的含量为0.2％(体积百分比)。

在优选的实施方案中，所述Hsp90α溶液中Hsp90α的浓度为20-400ng/ml，优选为20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml和/或400ng/ml。

根据本发明的另一方面，提供用于检测Hsp90α的试剂盒，其中包含上述任一种蛋白保护剂、上述任一种Hsp90α冻干粉或上述任一种Hsp90α溶液。

本发明中所述蛋白质类型的保护剂可以是牛血清清蛋白、人血清清蛋白、鸡血清清蛋白、酪蛋白或酪蛋白钠或其组合。

本发明中所述表面活性剂可以是吐温80、吐温40或曲拉通100或其组合。

本发明中所述酸碱调节剂可以包含磷酸盐缓冲剂。

纳克级浓度的Hsp90α在使用本发明的保护剂后，可以满足以下指标：

1)稳定性：检验37℃加速12天的冻干品，其与2-8℃存放的样品相对比，其检测值降低不超过15％。

使用Hsp90αELISA法试剂盒检测加速后的Hsp90α冻干校准品，其性能应满足以下指标：

1)最低检出限≤1.96ng/ml；

2)标准曲线的线性：

线性范围在20—400ng/ml时，相关系数R2应不小于0.980；

3)质控品测定值：

高、中浓度的质控品测定值应在标示量的85.0％—115.0％范围内，低浓度的质控品应在标示量的80.0％—120.0％范围内。

使用本发明的蛋白保护液制备的Hsp90α冻干品性能指标满足以上要求，其冻干品的有效期由原来的37℃加速稳定性有效期6天(相当于常用储存条件(2-8℃)有效期12个月)，延长至37℃加速稳定性有效期12天，将常规储存延长至24个月，从而可大幅提高Hsp90α检测试剂盒的使用有效期。当使用单个保护剂成分时，也可提高Hsp90α蛋白稳定期，部分稳定期可到20个月。

本发明的蛋白保护液可用于制备Hsp90α的定量校准品、质控品、定量检测试剂盒或检测方法。该定量校准品、质控品、定量检测试剂盒或检测方法可用于确定个体是否存在肿瘤、尤其是恶性肿瘤以及肿瘤是否转移；通过检测血浆、血清或者体液中的Hsp90α水平而对高危人群进行肿瘤筛查；通过检测血浆、血清或者体液中的Hsp90α水平而对肿瘤患者的预后进行判断；通过检测血浆、血清或者体液中的Hsp90α水平而判断对肿瘤病人的手术、放疗或药物治疗是否有效和/或决定何时停止治疗。

附图说明

图1是不同温度下Hsp90的稳定性。

具体实施方式

本文所使用的术语“保护剂”、“蛋白保护剂”或“蛋白质保护剂”是可以在蛋白质被冻干时起保护作用的保护剂，其可以是指单一成分的蛋白保护剂，也可以是由多种成分组成的混合物。常见的蛋白保护剂可以是多羟基化合物、糖类、蛋白质、聚合物、氨基酸、表面活性剂、胺类等。本文中所述的“蛋白质类型的保护剂”是指这样的蛋白保护剂，其组成成分是蛋白质，例如牛血清清蛋白、人血清清蛋白、鸡血清清蛋白、酪蛋白、酪蛋白钠等。

本文所述的“蛋白保护液”或“蛋白质保护液”也可以被称为“冻干保护液”，是指对蛋白质进行冻干时添加的保护液，用于维持蛋白质的活性和稳定性。冻干保护液通常为缓冲液，其中通常含有可以在蛋白质被冻干时起保护作用的保护剂和表面活性剂。

本文所述的“表面活性剂”可以是吐温80、吐温40、曲拉通100、十二烷基磺酸钠等。

本文所述的“Hsp90α”是热休克蛋白90α(Heat shock protein 90α，Hsp90α)。

本文所述的“AMP”是磷酸腺苷。

本文所述的“酸碱调节剂”可以选自缓冲剂、酸或碱，包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、硝酸、硫酸、或其组合。

本文中所提及的百分含量，除非特别指出，当溶质在常态下为固体时，为质量/体积浓度，当溶质在常态下为液体时，为体积/体积浓度。所述“在常态下”是指在常温常压下。

为了更加详细地解释本发明，下面给出本发明的实施例，这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。

实施例1添加单个组份保护剂对Hsp90α蛋白稳定性的影响

目的：筛选新的Hsp90α蛋白保护剂，并确定其使用浓度范围及条件。

试剂：磷酸盐、吐温20和茶多酚购自国药集团化学试剂有限公司，牛血清清蛋白购自sigma公司，肝素钠购自欣晶生物，环糊精购自北京奥博星生物技术责任有限公司。Hsp90α成品试剂盒购自烟台普罗吉生物科技发展有限公司，批号201602002、201604001，该试剂盒的校准品是Hsp90α冻干品。

方法：

1、配制基础溶液，使用纯化水，其中含0.318％磷酸盐(磷酸二氢钠)、0.5％牛血清清蛋白和0.2％吐温20，调节酸碱度到pH6.5，此溶液为后期试验的基本溶液。

2、使用基础溶液分别配制含特定含量的肝素钠、环糊精或茶多酚的冻干保护液，肝素钠、环糊精或茶多酚的含量为：

1)肝素钠：0.01、0.03、0.06、0.1、1、10mg/ml；

2)茶多酚：0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％；

3)环糊精：0.05％、0.1％、0.5％、1％。

3、使用步骤2获得的含特定含量的肝素钠、环糊精或茶多酚的冻干保护液分别配制对应Hsp90α成品试剂盒中20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml的Hsp90α蛋白溶液，并按每瓶400μl分装到2ml规格的西林瓶中。

4、将配制好的含保护剂的西林瓶装Hsp90α蛋白溶液进行冻干，冻干步骤与Hsp90α成品试剂盒Hsp90α蛋白冻干步骤一致。

5、将冻干后的Hsp90α蛋白加铝塑盖封紧，取一半数量进行37℃加速实验(依据：在体外诊断试剂行业的有效期计算中，37℃加速1天相当于2-8℃实时存放2个月)，另一半放置到2-8℃保存。

6、待Hsp90α蛋白冻干品加速时间达到后，使用Hsp90α试剂盒进行检测。对比未加速与加速后的检测结果，加速后的检测值应降低不超过15％。

检测操作步骤如下：

1)取出试剂盒在37℃平衡30分钟，将浓缩洗涤液加入475mL去离子水混匀后加入洗板机中待用；

2)将未加速和加速的冻干品加入0.4ml分析物稀释液溶解混匀；

3)将所需数目的板条至于板架上，加入50μl溶解后的冻干品；

4)在各孔中加入50μL测热休克蛋白90α用标记物液，轻轻振荡混匀；

5)封板膜覆盖微孔板，37℃下温育60分钟；

6)洗板：甩掉反应液，每孔加300μL洗液洗板，或使用洗板机进行洗板，共洗板6次，最后在吸水纸上扣干；

7)每孔中依次加入显色剂Α、B液各50μL，轻轻振荡混匀，37℃温育20分钟；

8)每孔中加入50μL终止液终止显色；

9)加入反应终止液后10分钟内，在450nm/620nm波长下读取OD值，其中450nm是检测波长，620nm是参比波长，用于去除背景干扰。

结果：

经检测，能够满足加速稳定性10天结果的浓度为：0.01-1mg/ml肝素钠、0.01％～0.5％茶多酚、0.05％-0.5％环糊精。试验结果如表1和表2所示。

表1使用不同保护剂37℃加速10天

表2使用不同保护剂37℃加速10天

实施例2多个保护剂联合使用对Hsp90α蛋白稳定性的影响

目的：研发新的Hsp90α蛋白保护剂组合配方，并确定其使用浓度范围和条件。

试剂：磷酸盐、吐温20、MgCl₂、茶多酚和K₂SO₄购自国药集团化学试剂有限公司，牛血清清蛋白和AMP购自sigma公司，肝素钠购自欣晶生物，PVP40购自欣晶生物，环糊精购自北京奥博星生物技术责任有限公司。Hsp90α成品试剂盒购自烟台普罗吉生物科技发展有限公司，批号201602002、201604001，该试剂盒的校准品是Hsp90α冻干品。

方法:

基本实验方法和步骤同实施例1中的方法步骤，并在本实施例中采用了多个保护剂联合的使用配方。

保护剂组合分四大类，各类中均设置不同的浓度组合:

1)0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂；

2)0.01-0.1mg/ml肝素钠、0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂、5mM-50mM K₂SO₄；

3)0.1％-2％PVP40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂、5mM-50mM K₂SO₄、0.05％-0.5％环糊精；

4)0.01-0.1mg/ml肝素钠、0.1％-2％PVP 40、0.01％-0.5％茶多酚、2mM-10mM AMP、5mM MgCl₂、5mM-50mM K₂SO₄、0.05％-0.5％环糊精；

结果：

经检测，满足加速稳定性12天的试验结果如表3、表4和表5所示。

保护剂组合内容：

1)0.1％PVP 40、0.01％茶多酚、2mM AMP、5mM MgCl₂

2)2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂

3)1％PVP 40、0.05％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂

4)0.01mg/ml肝素钠、0.1％PVP 40、0.01％茶多酚、2mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄

5)0.1mg/ml肝素钠、2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂、50mM K₂SO₄

6)0.1％PVP40、0.01％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄、0.05％环糊精

7)2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂、50mM K₂SO₄、0.5％环糊精

8)0.01mg/ml肝素钠、0.1％PVP40、0.01％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄、0.05％环糊精

9)0.1mg/ml肝素钠、2％PVP 40、0.5％茶多酚、10mM AMP、5mM MgCl₂、50mM K₂SO₄、0.5％环糊精

表3使用不同保护剂组合37℃加速12天

表4使用不同保护剂组合37℃加速12天

表5使用不同保护剂组合37℃加速12天

得到的最优效组合配方：0.1mg/ml肝素钠、2％PVP40、0.5％茶多酚、5mM AMP、5mM MgCl₂、5mM K₂SO₄、0.05％环糊精。

该组合37℃加速稳定检测结果(OD450/630值)如下表6所示：

表6最优效组合配方37℃加速稳定检测结果

实施例3使用最优效保护剂组合配方进行Hsp90α试剂盒性能指标检测

目的：通过12天37℃加速实验，测试最优效保护剂组合配方对Hsp90α蛋白和试剂盒检测性能的影响。

方法：依照实施例1中的操作步骤进行检测，其中，以加速后的Hsp90α冻干品作为校准品曲线，同时加入质控品进行试剂盒性能的检测。

结果：使用最优效组合配方的Hsp90α冻干校准品在加速12天后依然稳定，试剂盒各项性能指标结果如下表7所示：

表7试剂盒各项性能指标结构

其中，最低检出限≤1.96ng/ml；相关系数R²大于0.980；高、中浓度的质控品测定值应在标示量的85.0％—115.0％范围内，低浓度的质控品应在标示量的80.0％—120.0％范围内。实际检测值均符合国家相关标准。