一种人血浆蛋白c的冻干稳定剂组合物及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物，它是乳糖、甘露醇、海藻糖、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸以及它们的盐中的任意一种或者任意两种以上的组合。本发明稳定剂可以有效保护蛋白C，制得的蛋白C制剂的外观成型好，蛋白Ｃ活性损失小，回收率高，具有良好的临床应用前景。
【专利说明】一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及血浆制品领域，具体涉及人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物及其用途。
【背景技术】
[0002]人血浆蛋白C，又称蛋白C (protein C，PC)是一种分子量约为62kD的糖蛋白，在血浆中含量约为2-6mg/L。PC是一种维生素K依赖性血浆蛋白，与其他维生素K依赖的蛋白质(如凝血因子I1、VI1、IX和X)理化性质相似，通过灭活凝血因子Va、VIIIa，增高纤溶酶原激活因子，从而维持血液凝血和纤溶系统的动态平衡。由PC及其辅助因子，抑制因子组成的PC系统，目前已确认为机体抗凝血机制的一个重要调节系统，在抗血栓性疾病中起着重要作用。目前，蛋白C主要从血浆中分离纯化而制得。
[0003]人蛋白C在常温条件下易变性失活，因此该制品为了便于保存、运输，在制备过程中需冷冻干燥处理成为粉针制剂。人血浆蛋白C浓缩物制品中，蛋白C纯度较高，蛋白含量相对较少，在制品的冷冻过程中，溶液中不断产生冰晶，使制品盐离子浓度迅速增加，并引起制品内部PH的变化会损伤目的蛋白质的活性；在干燥过程中，制品溶液向玻璃态转变或呈玻璃态、蛋白质结合水的去除等因素也容易引起蛋白质结构的变化从而变性，导致蛋白C的活性降低。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明提供了一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物及其用途。
[0005]本发明人血浆蛋白C的冻干稳定组合物，它是乳糖、甘露醇、海藻糖、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸以及它们的盐中的任意一种或者任意两种以上的组合。
[0006]其中，所述组合物包括如下重量配比的成分:
[0007]乳糖3~5份
[0008]甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸2~10份。
[0009]优选地，所述组合物由如下重量配比的成分组成:
[0010]乳糖4份
[0011]甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸4份或8份。
[0012]其中，所述组合物包括如下重量配比的成分:
[0013]甘露醇2~10份
[0014]组氨酸或精氨酸2~10份。
[0015]优选地，它由如下重量配比的成分组成:
[0016]甘露醇4份或8份
[0017]组氨酸或精氨酸8份。
[0018]其中，所述组合物包括如下重量配比的成分:[0019]甘露醇 3~5份
[0020]组氨酸 3~5份
[0021]精氨酸 3~5份。
[0022]优选地，它由如下重量配比的成分组成:
[0023]甘露醇 4份
[0024]组氨酸 4份
[0025]精氨酸 4份。
[0026]其中，所述组合物包括如下重量配比的成分:
[0027]海藻糖3~5份
[0028]组氨酸或精氨酸6~10份。
[0029]优选地，所述组合物由如下重量配比的成分组成:
[0030]海藻糖4份
[0031]组氨酸或精氨酸8份。
[0032]其中，所述组合物包括如下重量配比的成分:
[0033]精氨酸 3~5份
[0034]组氨酸 3~5份
[0035]天冬氨酸3~5份。
[0036]优选地，所述由如下重量配比的成分:
[0037]精氨酸 4份
[0038]组氨酸 4份
[0039]天冬氨酸4份。
[0040]本发明还提供了一种人血浆蛋白C稳定剂，以前述组合物为活性成分，加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
[0041]本发明制备权利要求前述的人血浆蛋白C稳定剂的方法，步骤如下:按照前述配比，取原料，加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分，混匀，即可。
[0042]本发明还提供了一种制备人血浆蛋白C制剂的方法，它包括如下步骤:
[0043]( I)取去冷沉淀上清，分离纯化得人血浆蛋白C溶液；
[0044](2)在步骤(1)所得溶液中加入前述稳定剂，除菌、分装、冻干，即得。
[0045]去冷沉淀血衆(Cryoprecipitate-reducedplasma, CRP)是新鲜冰冻血衆(Freshfrozenplasma, FFP)在一定温度条件下制备冷沉淀时分离所得的上清血衆。
[0046]步骤(2)中，所述稳定剂的终浓度为0.4~1.2% (w/w)。
[0047]步骤(2)中，所述冻干是在_40°C~30°C下冷冻干燥50h。
[0048]本发明还提供了前述方法制备的人血浆蛋白C制剂。
[0049]本发明稳定剂可以有效维持冷冻干燥过程人血浆蛋白C的活性，提高制品外观和成型，制得的蛋白C制剂的外观成型好，蛋白C活性损失小，回收率高到93 %以上，具有良好的临床应用前景。
[0050]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0051]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]图1是蛋白C浓缩物制品在冷冻干燥过程中温度与时间的变化曲线。横坐标代表冷冻干燥过程的时间(h )，纵坐标代表冷冻干燥过程的温度(°C )，曲线代表随着冷冻干燥时间的推移冷冻干燥温度的变化。
【具体实施方式】
[0053]实施例1本发明人血浆蛋白C制剂的制备
[0054]1、制备方法
[0055]1、人蛋白C浓缩物制备
[0056]( 1)人去冷沉淀血浆的制备
[0057]符合药典要求的人新鲜冰冻血浆约1000L (重量约为1000kg)，用酒精消毒血浆袋后，注射用水在0-5°C融化血浆。离心除去冷沉淀的血浆备用。
[0058](2)凝胶吸附、纯化
[0059]①DEAE Sephadex A50吸附:将2kg的DEAE Sephadex A50凝胶干粉充分溶胀，用平衡液(0.015M柠檬酸钠，0.08M氯化钠，ρΗ7.3)平衡5次，每次60L，然后加入步骤(1)中得到的去冷沉淀血浆,在2-8°C搅拌吸附30分钟，上清液并入血浆罐，收集凝胶。
[0060]②洗涤:分别用60L pH7.3的含0.015M柠檬酸钠，0.20M氯化钠的洗涤液洗涤凝胶3次，每次搅拌30分钟。
[0061]③洗脱:分别用60L pH7.3的含0.015M柠檬酸三钠，0.5M氯化钠的洗脱液洗脱凝胶2次，每次搅拌20分钟。将两次洗脱得到的蛋白洗脱液混合置于洁净的容器中。
[0062](3)超滤、透析
[0063]对步骤(2)中所得蛋白洗脱液用IOkD孔径超滤膜超滤、透析，使最终得到的浓缩液的电导为5mS/cm。
[0064](4) S/D病毒灭活
[0065]将步骤(3)的浓缩液(40L，即40kg)，然后按10:1 (w/w)比例缓慢加入S/D溶液(3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween80)4kg，搅拌均匀，24-26°C连续搅拌6小时(转速:100转/分钟)，每I小时记录温度一次。
[0066](5)肝素亲和层析
[0067]用0.45 μ m膜过滤经S/D灭活后的蛋白溶液，然后泵入肝素亲和层析柱(柱高20cm，底面直径450mm)中进行亲和层析。经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到蛋白C原液，其中层析温度范围为2~10°C，线流速113cm/h (体积流速为180升/小时)。
[0068]①平衡:用120升平衡液(0.008M柠檬酸钠，pH5.8，电导约4mS/cm)对肝素亲和胶进行平衡；
[0069]②上样:将步骤(4) S/D病毒灭活所得蛋白溶液用0.45 μ m膜过滤，泵入层析柱中；
[0070]③洗涤:用160升洗涤液(0.008M柠檬酸钠，0.08M氯化钠，pH5.8，电导约为8mS/cm)对肝素亲和层析柱进行洗涤，观察在线紫外吸收线，至紫外吸收线趋于基线时停止洗涤；
[0071]④洗脱:对肝素亲和层析柱进行洗脱(0.008M柠檬酸钠，0.16M氯化钠，pH5.8电导为15mS/cm)，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液(40升)，即为蛋白C原液。
[0072](6)超滤、透析
[0073]对步骤(5)中所得蛋白C原液用IOkD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.15M，并适当浓缩使每毫升溶液中的蛋白C活性单位大于30IU，得到蛋白C浓缩物。
[0074]I1、添加冷冻干燥稳定剂，并冷冻干燥
[0075]按表1~表3的种类和浓度加保护剂，测定pH，并用0.lmol/L-lmol/L的HCl或NaOH溶液调pH至6.8-7.5，除菌过滤、无菌分装后，_40°C至30°C条件冷冻干燥50h。
[0076]观测成品的外观，检测其复溶时间和澄清度，检测蛋白C的活性回收率。
[0077]2、检测结果
[0078]( I)冷冻干燥后人蛋白C浓缩物制品成型外观结果见表1:
[0079]表1含不同稳定剂的人蛋白C浓缩物制品成型外观
【权利要求】
1.一种人血浆蛋白C的冻干稳定剂组合物，其特征在于:它是乳糖、甘露醇、海藻糖、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、天冬氨酸以及它们的盐中的任意一种或者任意两种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的稳定剂组合物，其特征在于:它包括如下重量配比的成分: 乳糖3~5份 甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸2~10份； 优选地:它由如下重量配比的成分组成: 乳糖4份 甘露醇、海藻糖、精氨酸或天冬氨酸4份或8份。
3.根据权利要求1所述的稳定剂组合物，其特征在于:它包括如下重量配比的成分: 甘露醇2~10份 组氨酸或精氨酸2~10份； 优选地:它由如 下重量配比的成分组成: 甘露醇4份或8份 组氨酸或精氨酸8份。
4.根据权利要求3所述的稳定剂组合物，其特征在于:它包括如下重量配比的成分: 甘露醇 3~5份 组氨酸 3~5份 精氨酸 3~5份； 优选地:它由如下重量配比的成分组成: 甘露醇 4份 组氨酸 4份 精氨酸 4份。
5.根据权利要求1所述的稳定剂组合物，其特征在于:它包括如下重量配比的成分: 海藻糖 3~5份 组氨酸或精氨酸6~10份； 优选地:它由如下重量配比的成分组成: 海藻糖4份 组氨酸或精氨酸8份。
6.根据权利要求1所述的稳定剂组合物，其特征在于:它包括如下重量配比的成分: 精氨酸 3~5份 组氨酸 3~5份 天冬氨酸3~5份； 优选地:它由如下重量配比的成分: 精氨酸 4份 组氨酸 4份 天冬氨酸4份。
7.—种人血浆蛋白C是冻干稳定剂，其特征在于:它是以权利要求1~6任意一项所述组合物为活性成分，加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
8.一种制备权利要求7所述的人血浆蛋白C稳定剂的方法，其特征在于:步骤如下:按照权利要求1~6任意一项所述配比，取原料，加上药物领域可接受的辅料或者辅助性成分，混匀，即可。
9.一种制备人血浆蛋白C制剂的方法，其特征在于:它包括如下步骤: (1)取去冷沉淀血浆，分离纯化得人血浆蛋白C溶液； (2)在步骤(1)所得溶液中加入权利要求7所述的稳定剂，除菌、分装、冻干，即得； 优选地:步骤(2)中，所述稳定剂的终浓度为0.4~1.2% (w/w)； 优选地:步骤(2)中，所述冻干是在_40°C~30°C下冷冻干燥50h。
10.权利要求9所述方法制备 的人血浆蛋白C制剂。
【文档编号】A61K38/17GK103893135SQ201410122754
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】王宗奎, 王玉梅, 杜晞, 邓靖, 袁靖, 李长清, 陈云华, 刘欣晏, 杨刚 申请人:中国医学科学院输血研究所, 贵州泰邦生物制品有限公司