本发明涉及纳米生物技术领域，尤其涉及量子点偶联β-HCG单抗的方法及其在免疫印迹中的应用。
背景技术：
免疫印迹(Western blot) ，在分子生物学及相关领域应用广泛，主要应用于蛋白的定性和半定量分析。但该方法步骤烦琐，耗时长，化学发光检测所用的有机荧光发色团荧光稳定性低，难以长时间成像，使得检测灵敏度低。不同的发色团需要不同波长的光源激发，使成像复杂化，且不能同时检测多种蛋白。
量子点(Quantum dots, QDs)是一种半导体纳米晶体，半径小于或等于玻尔半径，因此量子点表现出独特的光学、电、磁和催化特性。与传统有机染料分子探针相比，量子点的发射光谱宽度窄、可调，且分布对称；其激发光谱宽，且连续分布，可用一种波长激发大小不同的同种量子点而获得多种标记颜色；光稳定性强；斯托克斯位移较大；生物相容性好；荧光寿命长[Wegner KD, Lanh PT, Jennings T, et al. Influence of luminescence quantum yield, surface coating, and functionalization of quantum dots on the sensitivity of time-resolved fret bioassays [J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2013, 5(8): 2881]。
目前，量子点与生物分子偶联常用的技术有配位键结合、静电吸附、共价偶联等。蛋白中某种特定氨基酸才能与金属离子产生配位作用，因此应用不广泛；静电吸附得到的偶联物稳定性较差。表面带有羧基的水溶性量子点通过EDC等交联剂可以与蛋白质分子的氨基共价偶联，得到的偶联物具有良好的生物活性，且光学性质良好。
基于量子点的免疫印迹在理论上具有光稳定性强，灵敏度高，可多重标记的特点，能定性定量检测蛋白，准确度高，不需要化学发光试剂，成像系统简单，耗时短。2005年，Ornberg首次报道将量子点应用到免疫印迹中，利用量子点标记二抗检测不同浓度的MAPK，在不同曝光时间下检测到其蛋白浓度与荧光强度有线性关系。该方法灵敏度高，光化学性能稳定[Ornberg RL, Harper TF, Liu H. Western blot analysis with quantum dot fluorescence technology: a sensitive and quantitative method for multiplexed proteomics [J]. Nat Methods, 2005, 2(1): 79]。中国专利申请CN 101241140A《基于量子点标记的免疫印迹检测方法》，涉及了基于量子点标记二抗的免疫印迹方法，该法仍旧需要经过一抗的孵育，实验步骤较多，并且必须使用二抗，实验成本较为昂贵。
本发明的目的之一是，提供一种量子点标记单抗蛋白的方法。
本发明的目的之二是，提供一种基于量子点的免疫印迹，且能简便定量测定蛋白的方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于开发基于量子点的Western blot定量检测蛋白，提供一种耗时短且线性关系良好的方法。本发明的优点在于采用简单有效的方法制备CdTe量子点-β-HCG单抗偶联物，并在Western blot检测中表现出良好的线性关系和稳定性。
本发明是通过以下技术方案实现的：量子点通过EDC等交联剂偶联β-HCG单抗；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质经电泳分离开后转移至PVDF膜，与量子点标记的β-HCG单抗进行特异性结合，在紫外凝胶成像系统中检测，得到各条带荧光强度，进行定性定量分析。
本发明的具体技术方案如下：量子点-β-HCG单抗偶联物的制备方法及其应用，按照下述步骤进行：
（1）量子点偶联β-HCG单抗
偶联时，加入磷酸盐调节反应液pH，在巯基丙酸修饰的CdTe量子点中先加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）溶液活化反应10-15 min，再加入NHS溶液反应10-15 min，最后加入β-HCG单抗于37℃反应2-4 h。反应结束后，将得到的偶联物离心去沉淀，上清液经超滤离心管离心，并用磷酸缓冲液洗涤，最后浓缩后4℃保存。
（2）基于量子点的免疫印迹法
蛋白样品经过SDS-PAGE电泳按分子量大小分离，转至PVDF膜后并封闭，用量子点标记的β-HCG单抗做为一抗孵育，膜上目的蛋白即能与之进行特异性结合，最后采用紫外凝胶系统检测成像。
蛋白经SDS-PAGE电泳按分子量大小分离，再将PVDF膜于甲醇中激活，采用湿法转膜。将转好的膜放入5%脱脂牛奶中，震荡封闭1 h。用TBS溶液稀释成一系列浓度的量子点-β-HCG单抗偶联物，室温下孵育2 h。反应后直接将膜置于紫外凝胶系统中检测成像。观察荧光条带，并检测各条带荧光强度，得出线性关系。
其中所述的的量子点，其表面带有羧基的CdTe量子点，发射波长为520 nm - 600 nm中的一种。
其中步骤（1）中加入的量子点与EDC质量比为1:0.4 - 1:1，EDC与NHS质量比为1: 0.1 - 1: 0.3。调节反应pH为7.0 – 8.0，每步反应10-15 min。最后加入的量子点与β-HCG单抗质量比为1: 0.1-1: 0.5。
其中所述的量子点-β-HCG单抗偶联物的应用，检测的目的蛋白条带可针对HCG和β-HCG进行特征检测，并根据其荧光强度进行定量测定。
有益效果
（1）本发明的优点和效果在于采用化学交联剂的方法，制备了量子点-β-HCG单抗偶联物，该偶联物经实验证明具有良好的生物活性和光学特性；基于量子点的免疫印迹耗时短，步骤简单，不需要加入显色液，节约成本，光学稳定性强，在TBS缓冲液中可保存5天以上，且荧光强度无太大变化。
（2）本发明拓展了免疫印迹在微量检测蛋白中的应用，并且可以推广到其他类别蛋白的微量检测，其中量子点可自制，且不需要二抗，节约成本，定性定量结果均优于传统免疫印迹，具有良好的产业化前景。
具体实施方式
以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：量子点-β-HCG单抗偶联物的制备
将巯基丙酸（MPA）修饰的CdTe量子点（发射波长520 nm）于0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，配制成1 mg/mL。取量子点0.2 mg，加入磷酸缓冲液稀释至1 mL，加入0.877 g/mL 的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）0.09 μL，于旋转培养器上活化反应10 min。再加入 0.1 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）7.6 μL，继续反应10 min。最后加入9 mg/mL的β-HCG单抗2μL。37℃下反应2 h，得到的偶联物10000 rpm离心去沉淀，上清液经10KD超滤离心管离心浓缩后4℃保存。
偶联物经琼脂糖凝胶电泳分析，与未偶联的量子点和β-HCG单抗相比，迁移速度变慢，确认其偶联成功。
实施例2：量子点-β-HCG单抗偶联物的制备
将巯基丙酸（MPA）修饰的CdTe量子点（发射波长550 nm）于0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，配制成1 mg/mL。取量子点0.3 mg，加入磷酸缓冲液稀释至1 mL，加入0.877 g/mL 的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）0.3 μL，于旋转培养器上活化反应15 min。再加入 0.1 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）30 μL，继续反应15 min。最后加入9 mg/mL的β-HCG单抗8 μL。37℃下反应3 h，得到的偶联物10000 rpm离心去沉淀，上清液经10KD超滤离心管离心浓缩后4℃保存。
偶联物经分子排阻色谱分析，与未偶联的量子点和β-HCG单抗相比，保留时间提前，确认其偶联成功。
实施例3：量子点-β-HCG单抗偶联物的制备
将巯基丙酸（MPA）修饰的CdTe量子点（发射波长600 nm）于0.01M磷酸盐缓冲液（pH8.0）中，配制成1 mg/mL。取量子点0.2 mg，加入磷酸缓冲液稀释至1 mL，加入0.877 g/mL 的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）0.23 μL，于旋转培养器上活化反应15 min。再加入 0.1 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）52 μL，继续反应15 min。最后加入9 mg/mL的β-HCG单抗11 μL。37℃下反应4 h，得到的偶联物10000 rpm离心去沉淀，上清液经10KD超滤离心管离心浓缩后4℃保存。
偶联物经琼脂糖凝胶电泳分析，与未偶联的量子点和β-HCG单抗相比，迁移速度变慢，确认其偶联成功。
实施例4：量子点-β-HCG单抗偶联物在免疫印迹中的应用
将含有β-巯基乙醇的Loading Buffer加入蛋白，混匀后煮沸10 min，冷却后备用。配制12%分离胶和12%集成胶，待胶凝固后安装好电泳装置，倒入缓冲液，将变性后的蛋白取10 μL上样。先恒压80 V，指示剂跑至分离胶时，恒压120 V，待指示剂跑至胶底部，停止电泳。将胶取出，与甲醇激活后的PVDF膜紧贴，夹在滤纸中间，于4℃中湿法转膜2 h。膜转好后取出，放入5%脱脂牛奶中室温震荡封闭1 h。将封闭后的膜用TBS洗净残留的吐温，以1: 30稀释的量子点标记的β-HCG单抗室温下孵育2 h，将膜置于TBS缓冲液中保存。
将膜直接放置于紫外凝胶系统中检测成像，可以发现在46 KD 和23 KD处有明显的亮的条带。
实施例5：量子点-β-HCG单抗偶联物在免疫印迹中的应用
将含有β-巯基乙醇的Loading Buffer加入蛋白，混匀后煮沸10 min，冷却后稀释至不同浓度备用。配制15%分离胶和12%集成胶，待胶凝固后安装好电泳装置，倒入缓冲液，将不同浓度的蛋白各取10 μL上样。先恒压80 V，指示剂跑至分离胶时，恒压120 V，待指示剂跑至胶底部，停止电泳。将胶取出，与甲醇激活后的PVDF膜紧贴，夹在滤纸中间，于4℃中湿法转膜2 h。膜转好后取出，放入5%脱脂牛奶中室温震荡封闭1 h。将封闭后的膜用TBS洗净残留的吐温，以1: 50稀释的量子点标记的β-HCG单抗室温下孵育2 h，将膜置于TBS缓冲液中保存。
将膜直接放置于紫外凝胶系统中检测成像，可以发现在46 KD 和23 KD处有明显的亮的条带，并且随蛋白浓度增加光强度越强。将得到的条带读取其灰度值并做出线性关系，其相关系数可以达到0.9，稳定性、精密度等指标均优于传统未使用内参的免疫印迹法。