一种用于检测癌细胞中H2S的三维纸分析器件的制备方法与流程

本发明涉及复合纳米材料技术、纸芯片技术、电路板制作技术和细胞中气体信号分子检测技术领域，更具体地说是一种适合于现场快速原位检测癌细胞中硫化氢的纸分析器件的构建。

背景技术：

硫化氢（H₂S）作为一种内生的气体信号分子存在于许多哺乳动物的组织中。它的生理功能在一系列的生理过程中逐渐被识别，比如血管生成、血管舒张、细胞凋亡、炎症调节和神经调节等。另外，细胞中H₂S的不正常含量将会引发一些疾病，比如阿耳茨海默氏病、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化。因此，发展有效的检测细胞中H₂S的分析方法对于理解它的生理和病理功能是非常有意义的，这已经成为当今化学研究的一个重要的主题。尽管一些传统的检测方法（比色、电化学发光、荧光光谱）已经被用于检测不同样品中痕量水平的H₂S，但是由于其高的挥发性和快速的分解性能，仍急需发展一种超灵敏、温和、快速的检测方法用于原位可靠地检测癌细胞中的H₂S。

相比于一些传统的检测方法，电化学发分析方法由于其灵敏度高、成本低、装置简单、便携等优点已经被广泛使用。在分析过程中，为了放大检测信号，酶由于其高效的催化性能经常被使用。近年来，基于抑制剂对酶活性的抑制作用实现对抑制剂定量检测的酶抑制分析方法已经引起了广泛的研究兴趣。在检测过程中通过抑制剂控制酶的催化活性，可以实现信号放大。辣根过氧化物酶（HRP）具有响应快速，催化活性高，稳定性高、生物相容性好等优点，此外其催化活性可以被硫化物有效地抑制。基于此，我们利用HRP结合电化学检测技术构建了一种酶抑制的分析方法，它是基于H₂S对酶活性的抑制作用实现对H₂S的检测。

微流控纸基的分析设备由于其成本低、便携、操作简单等优点，被广泛应用于细胞学检查或组织学研究中，它是利用纸基质作为微流控平台实现简单、原位、微型化的检测。纸是由纵横交错的纤维网络组成的，其具有一定的大孔结构。纤维表面的官能团可以为负载其他功能材料提供较强的结合位点。传统的纸基功能材料中，材料只负载在纸纤维的表面，纸的大孔结构并没有得到充分的利用。充分利用纸的纤维网络和大孔结构，在纸基质中形成一个三维（3D）连续的复合材料层对于提高分析性能是非常有意义的。

还原氧化石墨烯（rGO）具有导电性好、表面积大、生物相容性高、机械性能好等优点，已经被作为一个良好的支撑材料用于负载半导体纳米材料及贵金属等。金（Au）钯（Pd）合金纳米粒子由于单一组分Au、Pd优良性能的协同作用，其表现出更优越的性能。我们通过控制组装rGO和AuPd合金纳米粒子在纸纤维的表面和纸的大孔结构中，在纸工作电极（PWE）中形成了一个3D AuPd-rGO网络。这种新型的3D AuPd-rGO-PWE综合运用了纸的独特结构特点及rGO和AuPd合金纳米粒子的优良性能，表现出导电性好、表面积大、生物相容性好等优点，其能够在用于检测癌细胞中的H₂S时极大地放大检测信号，增强分析的灵敏度。

技术实现要素：

本发明的目的是充分利用纸的独特结构特点及rGO和AuPd合金纳米粒子的优良性能制备一种新型的纸分析器件，并结合酶抑制分析方法和电化学检测方法的高灵敏度，实现快速原位检测癌细胞中的H₂S。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：

（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案，如附图1所示；

（2）将步骤（1）中设计的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸放在烘箱中，在100-150 ℃加热30-80秒使蜡融化并渗透整个色谱纸的厚度，形成疏水墙；

（3）在计算机上设计与蜡打印图案相匹配的对电极和参比电极的印刷图案，如附图2所示；

（4）将步骤（2）中得到的蜡打印色谱纸通过丝网印刷技术按照步骤（3）设计的印刷电极图案印刷碳对电极和Ag/AgCl参比电极；

（5）将步骤（4）中得到的色谱纸的样品板和辅助板沿中间线剪开，在样品板的工作区域，生长3D AuPd-rGO网络，制备3D AuPd-rGO-PWE；

（6）在步骤（5）中所得到3D AuPd-rGO-PWE的工作区域，修饰HRP，固定3′端带有氨基的适配体链，随后采用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，最后通过3′端带有氨基的适配体链捕获癌细胞，如附图3所示；

（7）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计电路板的尺寸和形状，如附图4所示，然后根据设计的尺寸和形状完成电路板的制作；

（8）将步骤（5）中得到的辅助板完全叠放在步骤（6）中得到的样品板上，然后将完全叠合的纸芯片与步骤（7）中得到的电路板进行组装；

（9）借助电路板上的导电片将步骤（8）中组装完成的纸分析器件连接到电化学工作站，在电路板B的通孔中加入检测溶液，利用循环伏安法在扫描速度为100 mV/s，扫描电压范围为-0.6 ~ 0.6V进行电化学信号检测，并通过计算抑制率，实现癌细胞中H₂S的检测。

本发明所设计的纸芯片的尺寸如附图1所示，样品板和辅助板的形状均为长方形，长和宽分别为21 mm和20 mm；工作区域和辅助区域均为直径为8 mm的圆形，样品板与辅助板之间宽度为1mm的线为分离二者的剪切线。

本发明所设计的电路板的尺寸如附图4所示，电路板A和电路板B的形状均为长方形，长和宽分别为27 mm和20 mm，其中“a”是用于连接纸工作区域的导电片，其形状为直径为8 mm的圆，“b”是用于连接到电化学工作站的导电片，其形状为边长为5 mm的正方形，“c”是用于连接电化学工作站和参比电极的导电片，其形状为长为10 mm，宽为5 mm的长方形，“d”是用于连接对电极的导电片，其形状为边长为5 mm的正方形，“e”是用于连接两个电路板的通孔，其形状为直径为8 mm的圆。

本发明所述的3D AuPd-rGO-PWE的制备步骤为：

（1）合成金纳米粒子：量取90 mL的二次水置于单口烧瓶中，加热到90℃， 随后加入0.5-1.0 mL 1wt%-2wt%氯金酸，水浴加热到95-100 ℃，反应1-5 min后，加入2.5-3.0 mL 0.5wt%-1wt%柠檬酸钠，并继续搅拌10-20 min至溶液变为酒红色；

（2）在样品板的工作区域首先滴涂15-25 μL 0.5-1.0 mg mL⁻¹氧化石墨烯分散液（GO），然后在室温下自然干燥，重复操作该“滴涂-干燥”过程3-5次，随后将样品板放入含有5-10 mL 0.5 mg mL⁻¹ GO、20-25 μL 80wt% 水合肼和15-20μL 28wt% 氨水的25 mL高压釜中，在90-100 ℃加热2-4 h, 待冷却到室温后用二次水洗涤工作区域，获得rGO-PWE；

（3）在rGO-PWE的工作区域滴加15-20 μL 金纳米粒子，在室温下静置1-3 h，用二次水洗去多余的金纳米粒子后，将30-40 μL新鲜制备的含有10-15 mM 氯金酸，20-25 mM氯钯酸和100-110 mM抗坏血酸的混合液加入到工作区域，在室温下生长10-20 min后，用二次水彻底清洗工作区域并在室温下干燥30 min，获得3D AuPd-rGO-PWE。

本发明所述的在步骤（5）中所得到3D AuPd-rGO-PWE的工作区域，修饰HRP，固定3′端带有氨基的适配体链，随后采用牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，最后通过3′端带有氨基的适配体链捕获癌细胞的步骤为：将10 μL 2 mg mL⁻¹ HRP 滴加到纸芯片工作区域，并在室温下孵化35 min，用pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤除去多余的HRP后，将10 μL 4.0 μM的3′端带有氨基的适配体链滴加到工作区域，孵化30 min 后用pH 7.4 PBS洗涤，然后滴加1%的牛血清白蛋白，用于封堵非特异性结合位点，利用pH 7.4 PBS洗涤后，滴加10 μL不同浓度的癌细胞在37 ℃孵化40 min，随后用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的癌细胞。

本发明所述的将步骤（5）中得到的辅助板完全叠放在步骤（6）中得到的样品板上，然后将完全叠合的纸芯片与步骤（7）中得到的电路板进行组装的步骤为：将完全叠合的芯片用自制芯片夹夹在电路板A电路板B之间，在这个过程中，要保证电路板A的导电片a、纸芯片的工作区域、辅助区域和电路板B中的通孔e完全重合。

本发明所述的步骤（9）中的利用循环伏安法进行电化学信号检测，并通过计算抑制率，实现癌细胞中H₂S的检测的步骤为：借助电路板上的导电片将步骤（8）中组装的纸分析器件连接到电化学工作站，在电路板B的通孔中加入20 μL含有0.5 mM过氧化氢的pH 7.0 PBS检测溶液，在扫描速率为100 mV/s，扫描电压范围为-0.6 ~ 0.6V进行循环伏安法测量，获得电流信号I₀，测量后，用pH 7.0 PBS洗涤纸工作区域，再加入20 μL含有0.5 mM过氧化氢和40 ng mL^-1 血管内皮生长因子的pH 7.0 PBS检测溶液，利用循环伏安法测量电流信号I₁，最后通过方程：抑制率=（I₀- I₁）/ I₀，计算抑制率，绘制抑制率与癌细胞浓度的标准曲线，实现癌细胞中H₂S的检测。

本发明的有益效果：

（1）通过控制组装rGO和AuPd合金纳米粒子在纸纤维的表面和纸的大孔结构中，在PWE中形成了一个3D AuPd-rGO网络，这极大地增强了PWE的表面积、导电性和生物相容性，有利于放大检测信号，增强分析的灵敏度。

（2）该酶抑制分析方法综合运用了HRP高效的催化活性、H₂S对HRP催化活性的有效抑制作用以及电化学检测方法的优越性，极大地提高了分析检测的灵敏度。

（3）采用成本低廉的纸材料设计简易、便携的纸分析器件，可以实现现场快速原位可靠地检测癌细胞中的H₂S。

（4）本发明的简易、便携纸分析器件，操作简单、响应迅速且具有良好的特异性、重现性、稳定性，为临床分析癌细胞中的H₂S提供了一个良好的分析平台，对进一步研究H₂S在细胞学和组织学中的生理功能具有重要的意义。

附图说明

附图1：纸芯片的疏水蜡打印图案。

附图2：纸芯片的丝网印刷电极图案。

附图3：细胞传感器的构建过程。

附图4：电路板的尺寸和形状。

具体实施方式:

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1: 三维纸分析器件在检测MCF-7细胞中H₂S的应用

（1）在计算机上用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案；

（2）将步骤（1）中设计的打印图案通过蜡打印机批量打印在A4尺寸色谱纸上，然后将打印过的色谱纸放在烘箱中，在130 ℃加热50s，使蜡融化并渗透整个色谱纸的厚度，形成疏水墙，而未进行蜡打印的区域仍保持良好的亲水性；

（3）在计算机上用Adobe illustrator CS4软件设计与蜡打印图案相匹配的对电极和参比电极印刷图案；

（4）将步骤（2）中得到的蜡打印色谱纸通过丝网印刷技术按照步骤（3）设计的印刷电极图案印刷Ag/AgCl参比电极和碳对电极；

（5）将步骤（4）中得到的色谱纸的样品板和辅助板沿中间线剪开，在样品板的工作区域，首先生长一层3D的rGO网络：将20 μL 0.5 mg mL⁻¹ GO滴涂到样品板的工作区域，并在室温下自然干燥，将此“滴涂-干燥”过程重复操作3次，然后将样品板放入含有5 mL 0.5 mg mL⁻¹ GO、20μL 80wt%水合肼和18μL 28wt%氨水的25 mL高压釜中，在90 ℃加热2 h。待自然冷却到室温后，将样品板取出，用二次水洗涤并在室温干燥；

（6）在步骤（5）中长有rGO网络的工作区域上生长一层AuPd合金纳米粒子导电层，首先合成金纳米粒子：量取90 mL的二次水置于单口烧瓶中，加热到90 ℃， 随后加入0.8 mL 1%氯金酸，水浴加热到96 ℃，反应1 min后，加入2.8 mL 1%柠檬酸钠，并继续搅拌15 min至溶液变为酒红色。取15 μL 金纳米粒子滴加在工作区域，在室温下静置1 h，用二次水洗去多余的金纳米粒子后，将新鲜制备的30 μL含有10 mM 氯金酸，20 mM氯钯酸和100 mM抗坏血酸的混合液加入到工作区域，在室温下生长10 min后，用二次水彻底清洗工作区域并在室温下干燥30 min，获得3D AuPd-rGO-PWE；

（7）对步骤（6）中获得的3D AuPd-rGO-PWE的工作区域进行生物分子的负载及细胞的捕获：首先，将10 μL 2 mg mL⁻¹ HRP 滴加到纸芯片工作区域，并在室温下孵化35 min，用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的HRP后，将10 μL 4.0 μM的3′端带有氨基的适配体链滴加到工作区域，孵化30 min后用pH 7.4 PBS洗涤，然后滴加1%的牛血清白蛋白，用于封堵非特异性结合位点，利用pH 7.4 PBS洗涤后，滴加10 μL一定浓度的MCF-7细胞在37 ℃孵化40 min，随后用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的MCF-7细胞；

（8）在计算机上用Adobe illustrator CS4软件设计电路板的尺寸和形状，然后根据设计的尺寸和形状完成电路板的制作；

（9）将步骤（4）中得到的辅助板完全叠放在步骤（7）中得到的样品板上，然后将完全叠合的纸芯片与电路板进行组装：将完全叠合的芯片用自制芯片夹夹在电路板A和B之间，在这个过程中，要保证电路板A的导电片a、纸芯片的工作区域、辅助区域和电路板B中的通孔e完全重合；

（10）借助电路板上的导电片将步骤（9）中组装的纸分析器件连接到电化学工作站，在电路板B的通孔中加入20 μL含有0.5 mM过氧化氢的pH 7.0 PBS检测溶液，在扫描速率为100 mV/s，扫描电压范围为-0.6 ~ 0.6V进行循环伏安法测量，获得电流信号I₀，测量后，用pH 7.0 PBS洗涤纸工作区域，再加入20 μL含有0.5 mM过氧化氢和40 ng mL^-1 血管内皮生长因子的pH 7.0 PBS检测溶液，利用循环伏安法测量电流信号I₁，最后通过方程：抑制率=（I₀- I₁）/ I₀，计算抑制率，绘制抑制率与癌细胞浓度的标准曲线，实现癌细胞中H₂S的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 一种用于检测癌细胞中H2S的三维纸分析器件的制备方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcagttgatc ctttggatac cctggttttt tttttt 36