本发明属于食品分析技术领域，涉及食物过敏原及其致敏性残基含量的高灵敏检测方法。
背景技术：
牛乳具有丰富的营养物质，也经常添加到其他食品中，是人们日常生活中经常摄入的物质，同时牛乳作为八大类过敏食物之一，牛乳过敏在人群中的发病率为0.3%～7.5%，而在儿童中的发病率达0.1～7.5%，其中在一岁以下的婴幼儿中的发病率达到2%～3%。食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission）、欧洲食品标签指导委员会（European Food Labeling Directive）和美国食品药品管理局（FDA）都规定食品标签中必须列出各类致敏成分，其中就包括牛乳及乳制品。对食物过敏原的检测是食物过敏管理的关键环节，以便对过敏食物进行风险评估、生产和标示。牛乳中过敏原成分复杂，其中β-乳球蛋白约占牛乳蛋白含量的10%，约占乳清蛋白总量的50%，且IgE介导的牛奶过敏中82%的病人对β-乳球蛋白过敏。因此，开展β-乳球蛋白的检测，是保护牛乳过敏人群合法权益的关键举措，也有利于生产低致敏食品，从而提高牛乳过敏患者的生活质量。
目前，食物过敏原的检测技术有基于蛋白检测的免疫学技术、高效液相色谱技术、液相/质谱联用技术等，及基于核酸检测的聚合酶链式反应技术等，其中免疫学技术最成熟、最常用。抗体在免疫学方法检测食物过敏原中起着关键作用。抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，其中单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌，抗体具有高特异性、均一性特点。虽然多克隆抗体具有制备简单、经济，但相对于单克隆抗体，多克隆抗体的特异性和均一性较差，且产量有限。
蛋白质的结构决定其功能，作为食物过敏原的蛋白，过敏原表位是引起过敏反应的物质基础，包括线性表位和构象性表位。食品在加工及工业应用中常常会经过加热、发酵、酶解等处理，这使过敏原构象性表位易被破坏，但线性表位则相对稳定，不易被破坏。合成牛乳β-乳球蛋白主要IgE线性表位肽，通过杂交瘤技术制备特异性识别该表位肽的单克隆抗体。
由于金属纳米颗粒具有比表面积大、易与抗体偶联等特点，被广泛应用于高灵敏检测方法中。目前，应用较多的纳米金属有胶体金、纳米银、免疫磁珠等，而胶体金是应用最广泛的纳米材料。另外， KOH可以羟基化修饰酶标板，可以进一步共价结合抗体，缩短包被时间，提高检测效率。因此，对酶标板进行羟基化修饰，并共价固定单克隆抗体，利用β-乳球蛋白多克隆抗体与胶体金制备胶体金探针，并建立基于胶体金探针的酶联免疫吸附法（ELISA）进行高灵敏、高效率地检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量，同时可评价食物样品致敏性的强弱，评估食品安全风险的高低，也为食品过敏原标示提供更可靠的检测方法。目前，在我国，结合共价固定抗体的高效率、胶体金的高灵敏和IgE表位单克隆抗体的特异性对食品中过敏原及其致敏性残基的定量检测还是空白。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提出一种基于胶体金探针检测牛乳β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法，建立一种基于胶体金探针高灵敏的IgE线性表位识别检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法。该方法准确性高、灵敏度高、特异性好、回收率高、检测时间短。
本发明的技术方案如下。
1、β-乳球蛋白IgE线性表位单克隆抗体的制备。
合成文献报道的β-乳球蛋白主要IgE线性表位AA127-144（EVDDEALEKFDKALKALP），并在其N端加上一个半胱氨酸（C），然后与血蓝蛋白偶联制备免疫原。以制备的免疫原免疫 BALB/c 小鼠，采用腹部皮下多点注射方式免疫，利用细胞融合技术将脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得可分泌抗体的细胞株，通过筛选得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并借助小鼠体内诱生腹水法大量制备抗体，最后用Protein G亲和柱纯化的得到β-乳球蛋白IgE线性表位单克隆抗体。
2、β-乳球蛋白多克隆抗体的制备。
以牛乳β-乳球蛋白为抗原，通过常规方法制备获得β-乳球蛋白多克隆抗体。
3、抗体的纯化。
把β-乳球蛋白与CNBr-Sepharose 4B柱材偶联，制备免疫亲和柱。兔抗β-乳球蛋白抗血清与等体积PBS混合，将血清加入Sepharose 4B亲和柱中，室温下孵育30 min，再循环上样一次；用20倍柱体积的PBS进行非特异性洗脱，再用10倍柱体积的3 M MgCl2进行特异性洗脱得到牛乳β-乳球蛋白特异性多克隆抗体。纯化后，用截留分子量为3 kDa的超滤管对抗体进行除盐，并浓缩至合适的体积。
4、β-乳球蛋白多克隆抗体的生物素化。
把纯化得到的β-乳球蛋白多克隆抗体与长链生物素按1：20的摩尔比混合，冰浴2 h，用脱盐柱除去多余的生物素。
5、胶体金探针的制备。
取1 mL胶体金溶液（粒径为20 nm），再加40 μL 浓度为1mg/mL的生物素化β-乳球蛋白多克隆抗体，25 °C偶联1 h。然后加100 μL 10%的BSA，25 °C孵育1 h，封闭胶体金表面未结合抗体的位点。接着用低温离心机14,000×g 4°C离心30 min，去除未结合的游离抗体，加入1 mL保存液（含1% BSA，1 % PEG 20000，5%蔗糖，0.25% Tween-20的PBS，pH 6.5）重悬沉淀标记抗体的胶体金探针。
6、共价固定单克隆抗体。
聚苯乙烯酶标板中每孔加入200 μL 1%的KOH，37 °C孵育5 min进行羟基化修饰，再用超纯水洗5次。加10 μL EDC（4 mg/mL，溶于0.1 M MES，pH 4.7）到990 μL单克隆抗体（8 μg/mL），37 °C孵育5-10 min活化抗体。活化的抗体与等体积4%的APTES混合，然后加100 μL抗体到羟基修饰的酶标板中，37 °C孵育1 h，再用PBST清洗3次。
7、基于胶体金探针夹心ELISA法检测β-乳球蛋白标准曲线的绘制。
往共价固定有单克隆抗体的酶标板中每孔加入250 μL 2%的明胶溶液（含0.1% Tween-20），37 °C封阻1 h。清洗后，每孔加入100 μL已知浓度梯度的β-乳球蛋白，37 °C孵育1.5 h。清洗后，每孔加入100 μL胶体金探针，37 °C孵育1.5 h。清洗后，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37 °C孵育1.5 h。清洗后，每孔加入100 μL TMB溶液，与37 °C避光孵育15 min后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，根据吸光值和抗原浓度的关系绘制β-乳球蛋白标准曲线。
8、样品预处理。
（1）液态乳制品：取一定量的液态乳制品于离心管中，用低温离心机10,000g，4 °C离心15 min，去除脂肪层和沉淀，上清用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品。
（2）粉状乳制品：称一定量的样品用PBS稀释，溶解后离心，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品。
（3）固态乳制品：称一定量的样品，磨成均匀粉末，取1g 粉末加入到20 mL提取液（20 mmol/L Tris-HCl, 2% Tween-20, pH 8.0），4 °C搅拌过夜提取蛋白。再经10,000×g 4 °C离心10 min，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品。
9、样品检测。
将待检测的食品进行预处理，制备检测样。根据上述方法经共价固定抗体、封闭及清洗后，每孔加入100 μL预处理的样品，孵育清洗后，按步骤[0021]依次加入胶体金探针、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、TMB溶液，经H2SO4终止反应后，用酶标仪检测吸光值，把吸光值带入标准曲线计算出被检样品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量。
本发明的优点是：1、本发明利用牛乳β-乳球蛋白表位肽制备单克隆抗体，具有特异性识别β-乳球蛋白IgE表位的优点；2、本发明利用胶体金和抗体制备探针，具有高灵敏的优点；3、本发明利用羟基化修饰的酶标板共价固定单克隆抗体，具有反应时间短的优点；4、基于表位抗体及胶体金探针定量检测乳产品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的夹心ELISA方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、检测时间短等优点，便于高通量检测；5、本发明所建立的方法将为高通量、高灵敏快速分析检测多种食品中相关过敏原及其致敏性残基提供了一种有效的方法，具有良好的推广和应用前景。
附图说明
图1为所建夹心ELISA法检测β-乳球蛋白的标准曲线。
具体实施方式
本发明将通过以下具体实例作进一步说明。
实施例1：定量检测阳光纯牛奶中过敏原β-乳球蛋白含量。
1. 样品预处理。
取1 mL阳光纯牛奶10,000×g，4 °C离心15min，去除脂肪，上清用封阻液稀释10,000倍后作为检测样。
2. 样品检测。
（1）共价固定：将EDC活化的单克隆抗体（8 μg/mL）与等体积的4%APTES混合后，每孔100 μL加到羟基化修饰的酶标板中，37 °C共价固定1 h。
（2）洗涤：用PBST（含0.1%吐温-20）洗涤3次，每次3 min，扣干。
（3）封阻：用PBS配2%明胶（含0.1%吐温-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
（4）加抗原：用封阻液将β-乳球蛋白标准品在31.25–16,000 ng/mL范围内梯度稀释，每孔加入100 μL标准品/样品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
（5）加检测抗体：用封阻液将胶体金探针稀释200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
（6）加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素：用封阻液将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
（7）加显色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
（8）测吸光值：孵育结束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，吸收波长为450 nm，根据吸光值绘制标准曲线，根据线性回归方程和样品吸光值计算样品中β-乳球蛋白的含量，三次检测的平均值为最终检测含量。
3. 结果。
检测标准曲线方程为y=0.80378x-0.90867，r2=0.9966，灵敏度为0.24 ng/mL。阳光纯牛奶中β-乳球蛋白的含量为3.21 mg/mL，而牛乳中β-乳球蛋白的含量约为3-4 mg/mL，说明所建立的检测方法是可行的。
实施例2：定量检测多美滋优阶倍护部分水解婴幼儿奶粉中β-乳球蛋白致敏性残基含量。
1. 样品预处理。
称取0.2 g多美滋优阶倍护部分水解婴幼儿奶粉，加入封阻液并充分溶解，使蛋白浓度为5 mg/mL。10,000×g于4 °C 离心15min，去除脂肪和沉淀，用封阻液将上清稀释至250 μg/mL, 50 μg/mL及10 μg/mL，作为检测样。
2. 样品检测。
（1）共价固定：将EDC活化的单克隆抗体（8 μg/mL）与等体积的4%APTES混合后，每孔100 μL加到羟基化修饰的酶标板中，37 °C共价固定1 h。
（2）洗涤：用PBST（含0.1%吐温-20）洗涤3次，每次3 min，扣干。
（3）封阻：用PBS配2%明胶（含0.1%吐温-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
（4）加抗原：用封阻液将β-乳球蛋白标准品在31.25–16,000 ng/mL范围内梯度稀释，每孔加入100 μL标准品/样品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
（5）加检测抗体：用封阻液将胶体金探针稀释200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
（6）加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素：用封阻液将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
（7）加显色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
（8）测吸光值：孵育结束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，吸收波长为450 nm，根据吸光值绘制标准曲线，根据线性回归方程和样品吸光值计算样品中β-乳球蛋白的含量，三次检测的平均值为最终检测含量。
3. 结果。
检测标准曲线方程为y=0.80378x-0.90867，r2=0.9966，灵敏度为0.24 ng/mL。多美滋优阶倍护部分水解婴幼儿奶粉中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量为45.48 mg/kg。
实施例3：定量检测Leibniz Choco Minis巧克力中β-乳球蛋白含量。
1. 样品预处理。
把Leibniz Choco Minis巧克力磨成粉末，称取1.0 g粉末，加20 mL提取液（20 mmol/L Tris-HCl, 2% Tween-20, pH 8.0），4 °C搅拌过夜提取蛋白。将提取液于10,000 g 4 °C 离心15min，去除脂肪和沉淀，用封阻液将上清稀释500倍，作为检测样。
2. 样品检测。
（1）共价固定：将EDC活化的单克隆抗体（8 μg/mL）与等体积的4%APTES混合后，每孔100 μL加到羟基化修饰的酶标板中，37 °C共价固定1 h。
（2）洗涤：用PBST（含0.1%吐温-20）洗涤3次，每次3 min，扣干。
（3）封阻：用PBS配2%明胶（含0.1%吐温-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
（4）加抗原：用封阻液将β-乳球蛋白标准品在31.25–16,000 ng/mL范围内梯度稀释，每孔加入100 μL标准品/样品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3 min，扣干。
（5）加检测抗体：用封阻液将胶体金探针稀释200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
（6）加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素：用封阻液将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3 min，扣干。
（7）加显色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
（8）测吸光值：孵育结束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，吸收波长为450 nm，根据吸光值绘制标准曲线，根据线性回归方程和样品吸光值计算样品中β-乳球蛋白的含量，三次检测的平均值为最终检测含量。
3. 结果。
检测标准曲线方程为y=0.80378x-0.90867，r2=0.9966，灵敏度为0.24 ng/mL。Leibniz Choco Minis巧克力中β-乳球蛋白的含量为2.38 g/kg。