一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法及免疫渗滤装置与流程

本发明涉及蛋白检测技术领域，尤其涉及一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法及免疫渗滤装置。

背景技术：

原发性肝癌与肝炎、肝硬变等良性肝病产生的甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)在其糖链结构上存在很大差异，即与良性肝病相比，肝癌产生的AFP，其岩藻糖指数要高得多。岩藻糖具有与小扁豆素结合的特性。AFP根据其(岩藻糖基)对小扁豆凝集素的亲和力不同可以分为AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。其中AFP-L1主要来自于良性肝病，AFP-L2主要来源于孕妇，而AFP–L3是甲胎蛋白的岩藻糖糖基化形式，主要来源于肝细胞性肝癌(HepatoCellular Carcinoma，HCC)。2005年FDA正式批准将AFP-L3作为原发性肝癌的标志物之一。AFP-L3在肝癌的早期诊断、鉴别诊断、疗效评估和预后监测等方面均具有较高的特异性与敏感性。

岩藻糖为甲基化六碳糖，存在于组织及血清等多种糖蛋白糖链中，称为蛋白结合岩藻糖(protein-bound fucose，P-bf)。AFP碳水化合物链上存在岩藻糖残基，此种异质体称为岩藻糖基化AFP(FucAFP)，具有重要的理论意义和临床应用意义，在肝癌诊断和预后应用中可以作为一项重要的指标。

传统的血清岩藻糖蛋白的分离方法，包括亲和交叉免疫电泳技术、亲和印迹法、亲和层析法、“双位点夹心”酶联免疫吸附法、LiBASys测定仪、i30检测系统技术及热景生物的糖基捕获离心柱前处理技术。其中植物凝集素亲和免疫电泳技术和i30检测系统技术要求高、操作繁琐、试剂昂贵，限制了其推广应用。而糖基捕获离心柱，由于样本处理和检测分开进行，增加了操作的繁琐性。

技术实现要素：

针对目前岩藻糖蛋白分离方法中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法及免疫渗滤装置，所述方法和免疫渗滤装置尤其适用于检测生物样品中的岩藻糖基化甲胎蛋白，并对各种岩藻糖基化蛋白具有通用性。

为达此目的，本发明采用了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法，其包括如下步骤：

(1)将甲胎蛋白抗原和小扁豆素复合于微孔滤膜上；

(2)滴加血清样品到微孔滤膜上，使样品中的岩藻糖基化甲胎蛋白与微孔滤膜上的小扁豆素结合；

(3)向微孔滤膜上滴加酶标记的甲胎蛋白多克隆抗体，并加入显色底物，得到检测结果。

本发明是利用微孔滤膜，在短时间内实现了血清样本中多种抗原或抗体的一次性同时检测，其检测过程只需3-5min即可完成。相比采用蛋白芯片，本发明提供的免疫渗滤检测方法，具有检测时间短、成本低、稳定性好等优点。

本发明的免疫渗滤方法是将捕获蛋白固定在硝酸纤维素膜上，带负电荷的抗体与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起；并且，通过采用HRP和显色底物发生反应产生兰褐色稳定产物，该产物能够长时间稳定存在，不会随着时间的延长逐渐变弱或消失，观察结果不会因为时间段的不同产生误差，结果稳定性好；再有，本发明的免疫渗滤方法不需要任何仪器进行结果扫描分析，可在5min之内肉眼观察判断结果；其次，本发明的免疫渗滤方法只需在室温完成，不需要温箱。

本发明提供的免疫渗滤检测方法，适用于检测生物样品中的岩藻糖基化甲胎蛋白，并对各种岩藻糖基化蛋白具有通用性。

本发明中的岩藻糖基化甲胎蛋白是指甲胎蛋白碳水化合物链上存在岩藻糖残基的异质体。

根据本发明，步骤(1)所述甲胎蛋白抗原为原核表达人甲胎蛋白抗原，也可选择真核表达甲胎蛋白抗原，在此不做特殊限定。

根据本发明，步骤(3)所述酶标记的甲胎蛋白多克隆抗体为兔源抗体。

根据本发明，步骤(3)所述酶为辣根过氧化物酶(HRP)，也可为碱性磷酸酶(ALP)，其用于实现酶底物显色。

根据本发明，所述检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法可以包括如下步骤：

(1)将甲胎蛋白抗原和小扁豆素复合于微孔滤膜上；

(2)滴加10-15μL的血清样品到微孔滤膜上，使样品中的岩藻糖基化甲胎蛋白与微孔滤膜上的小扁豆素结合；然后用封闭液洗涤，去除非特异性结合物；

(3)向微孔滤膜上滴加酶标记的甲胎蛋白多克隆抗体，孵育3-5s后用封闭液洗涤，去除非特异性结合物，加入显色底物显色液；

阳性血清时，甲胎蛋白抗原和岩藻糖基化甲胎蛋白的检测区域显示蓝色，阴性血清时，甲胎蛋白抗原检测区域显示蓝色，岩藻糖基化甲胎蛋白的检测区域不显色。阴性对照无论是阳性血清和阴性血清都不显色。

示例性地，所述免疫渗滤方法具体可以包括如下步骤：

样品检测：

将待测血清样品稀释后滴加在含有微孔滤膜的检测区上，孵育后，用PBST洗涤检测区，去除非特异结合物；加入用PBS稀释的HRP标记的AFP抗体，孵育后，用PBST洗涤，去除非特异结合物；加入HRP底物显色液，肉眼观察结果。

根据本发明，所述孵育是指室温孵育3-5s，例如3s、3.5s、4s、4.5s或5s。

根据本发明，所述检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法中，可以在如下免疫渗滤装置中进行，但并非仅限于此。

一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤装置，其含有微孔滤膜，在微孔滤膜基质上设置有至少1个检测区，所述检测区内设有阳性对照检测亚区、血清岩藻糖蛋白检测亚区和阴性对照区，其中阳性对照检测亚区固定有甲胎蛋白，血清岩藻糖蛋白检测亚区固定有小扁豆素，阴性对照区固定有牛血清白蛋白；同一检测亚区内的检测斑上的物质浓度相同。检测亚区和对照区分别至少包括1个检测斑，例如可以是2个、3个、4个、5个或6个等。

本发明中所述免疫渗滤装置由韧性好的塑料制品、纸质吸水材料和硝酸纤维素膜组成，能够承受撞击和碰撞，不容易破碎。

本发明中，所述微孔滤膜基质上具有1个检测区，所述检测亚区具有1个检测斑，所述阳性对照区和阴性对照区各具有1个对照斑；所述甲胎蛋白为原核表达人甲胎蛋白。

本发明的免疫渗滤装置还包括辣根过氧化酶标记的甲胎蛋白多克隆抗体和显色底物液；所述辣根过氧化酶标记的甲胎蛋白多克隆抗体为兔源抗体；所述免疫渗滤装置还包括用于洗涤和稀释的PBST和PBS封闭液。

本发明优选采用具有微孔滤膜的免疫渗滤装置，其与蛋白芯片相比，具有检测时间短、成本低、稳定性好等优点，可将检测过程控制在3-5min。

第二方面，本发明还提供了一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤装置，所述免疫渗滤装置的微孔滤膜基质上包括至少1个检测区，所述检测区内设有阳性对照检测亚区、血清岩藻糖蛋白检测亚区和阴性对照区，其中阳性对照检测亚区固定有甲胎蛋白，血清岩藻糖蛋白检测亚区固定有小扁豆素，阴性对照区固定有牛血清白蛋白；同一检测亚区内的检测斑上的物质浓度相同。

根据本发明，所述检测亚区至少包括1个检测斑，例如可以是2个、3个、4个、5个或6个等。

根据本发明，所述微孔滤膜基质上具有1个检测区，所述检测亚区具有1个检测斑，所述阳性对照区和阴性对照区各具有1个对照斑。

根据本发明，所述甲胎蛋白为原核表达人甲胎蛋白。

根据本发明，所述免疫渗滤装置还包括辣根过氧化酶标记的甲胎蛋白多克隆抗体和显色底物液。

根据本发明，所述辣根过氧化酶标记的甲胎蛋白多克隆抗体为兔源抗体。

根据本发明，所述免疫渗滤装置还包括用于洗涤和稀释的PBST和PBS封闭液。

本发明还提供了免疫渗滤装置在非诊断和/或非治疗目的血清岩藻糖蛋白检测中的用途。

与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明通过利用微孔滤膜，在短时间内实现了血清样本中多种抗原或抗体的一次性同时检测，本发明提供的免疫渗滤检测方法，能够准确地检测血清岩藻糖蛋白，具有检测时间短、稳定性好、成本低等优点；

(2)本发明提供的检测方法和免疫渗滤装置需要的原材料和仪器设备成本都大为减少，免疫渗滤的装置为纸质和塑料制品，成本很低，大约1元人民币，不需要任何仪器设备进行实验流程的准备、孵育、结果扫描，大大降低了检测成本和费用；

(3)本发明的免疫渗滤方法在时间上与其他方法进行比较，ELISA检测至少需要3h；蛋白芯片检测需要1.5h；而本发明仅需3-5min，检测时间上会大大缩短。

附图说明

图1是本发明的免疫渗滤装置示意图，其中，1-盖，2-微孔滤膜，3-纸质吸水材料，4-塑料底。

图2是本发明的免疫渗滤方法的结果示意图，其中，1-3是阳性结果，NC膜上方的阳性对照检测斑呈现兰褐色阳性信号，中间的小扁豆素检测斑呈现兰褐色阳性信号，下方的BSA对照斑不显色；4-5是阴性结果，NC膜上方的阳性对照检测斑呈现兰褐色阳性信号，中间的小扁豆素检测斑和下方的BSA对照斑不显色。

图3是制备免疫渗滤硝酸纤维素膜的示意图，阳性对照区固定AFP，中间检测区固定小扁豆素，阴性对照区固定BSA。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

如图1所示，其是本发明中免疫渗滤装置的结构示意图，该免疫渗滤装置具有微孔滤膜，其由上到下依次设置为盖1、微孔滤膜2、纸质吸水材料3和塑料底4。在组装时，事先将微孔滤膜裁剪成直径大约1.5cm的圆形，将纸质吸收材料3放在塑料底4内，纸质吸水材料上面中央放置预先裁剪的微孔滤膜2，然后盖上盖1。

本发明中所用到的微孔滤膜可以是硝酸纤维素膜，本发明采用GE Healthcare RPN303B；纸质吸水材料可以是吸水纸；盖和底均采用塑料制品。

如图2所示，其示出了采用本发明的免疫渗滤方法的结果示意图，阳性血清时(图2中的1-3)，阳性对照和岩藻糖基化甲胎蛋白的检测区域均显示蓝色；如果是阴性血清时(图2中的4-6)，岩藻糖基化甲胎蛋白的检测区域则不显色，阳性对照显示蓝色；无论阳性和阴性血清，阴性对照都不显色。

图3是制备免疫渗滤硝酸纤维素膜的示意图，阳性对照区固定AFP，中间检测区固定小扁豆素，阴性对照区固定BSA。

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

实施例1免疫渗滤装置的制备及使用流程

实验所用试剂和仪器：原核表达AFP(美国abcam公司)；小扁豆素(Sigma公司)；硝酸纤维素膜(GE Healthcare)、辣根过氧化物酶标记的兔源抗体(美国abcam公司)；HRP显色底物液(美国Millipore公司)。

PBS配方：氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.44g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g，调pH值至7.4，定容至1L。

PBST配方：PBS，1L+Tween-20，1mL。

硝酸纤维素膜(GE Healthcare)，每个免疫渗滤装置包含1个检测区，每个检测区可检测一份血清，一次检测AFPL3标志物。

每个检测区域内，将鼠源原核表达人AFP(美国abcam公司)、小扁豆素Sigma公司)各0.5μL依次点在硝酸纤维素膜上，点样浓度AFP 0.5mg/mL，小扁豆素4mg/mL；10％牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照，0.5μL点成对照斑。

免疫渗滤操作流程：

用制备好的免疫渗滤检测健康对照组和肝癌实验组动态血清标本中AFP L3肿瘤标志物。

室温条件下，用血清样本10μL滴加在免疫渗滤装置的膜片上，利用小扁豆素和岩藻糖结合的特性，使小扁豆素与血清中的岩藻糖结合形成小扁豆素抗原复合物；3秒钟后，血清液体渗透膜片被膜片下面的吸水材料吸水。

滴加10μL PBST洗涤，去除非特异结合，反复3次。再加入PBS稀释的辣根过氧化物酶标记兔源一抗，兔源抗体与血清中的AFP抗原结合，小扁豆素-(AFP)岩藻糖-兔源辣根过氧化物酶标记抗体复合物；兔源抗体同时与固定膜上的阳性对照AFP结合，AFP-兔源辣根过氧化物酶标记抗体复合物。3秒钟后，血清液体渗透膜片被膜片下面的吸水材料吸水。

滴加10μL PBST洗涤，去除非特异结合，反复3次，加入HRP显色底物，避光1分钟，滴加10μL PBST洗涤。阳性血清检测斑呈现蓝色斑点。

实施例2

用制备好的免疫渗滤检测健康对照组和肝癌实验组动态血清标本中AFP L3肿瘤标志物。

室温条件下，用血清样本2.5μL稀释4倍后，滴加在免疫渗滤装置的膜片上，利用小扁豆素和岩藻糖结合的特性，使小扁豆素与血清中的岩藻糖结合形成小扁豆素抗原复合物；5秒钟后，血清液体渗透膜片被膜片下面的吸水材料吸水。

滴加10μL PBST洗涤，去除非特异结合，反复5次。再加入PBS稀释的辣根过氧化物酶标记兔源一抗，兔源抗体与血清中的AFP抗原结合，小扁豆素-(AFP)岩藻糖-兔源辣根过氧化物酶标记抗体复合物；兔源抗体同时与固定膜上的阳性对照AFP结合，AFP-兔源辣根过氧化物酶标记抗体复合物。5秒钟后，血清液体渗透膜片被膜片下面的吸水材料吸水。

滴加10μL PBST洗涤，去除非特异结合，反复5次，加入HRP显色底物，避光1分钟，滴加10μL PBST洗涤。阳性血清检测斑呈现蓝色斑点。

综上可以看出，本发明利用微孔滤膜，在较短时间内实现了血清样本中多种抗原或抗体的一次性同时检测，其检测过程只需3-5min即可完成，具有检测时间短、灵成本低、稳定性好等优点。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。