一种检测多甲氧基黄酮类成分的方法与流程

本发明涉及食品来源复杂组分中生物活性物质快速检测技术领域，具体涉及一种检测多甲氧基黄酮类成分的方法。

背景技术：

柑橘是世界第一大水果，种植面积和产量均居所有水果之首。柑橘皮是我国传统中药陈皮、青皮、枳实等药材的重要来源，其中类黄酮物质是主要功效成分之一。多甲氧基黄酮(Polymethoxyflavones，PMFs)几乎专属存在于柑橘中，以果皮中含量最高，各种PMFs在橘皮中的含量为0.01％～0.05％。PMFs以2-苯基色原酮为母核，C6-C3-C6为基本骨架结构，在C4位置上具有羰基且具有2个或2个以上-OCH3。几乎所有PMFs都具有抗氧化活性和消除自由基能力，使其在抗癌、抗炎、抗菌、抗突变、抗血小板凝集、抗动脉粥样硬化、降胆固醇水平等方面表现出显著的生物活性。目前，PMFs的检测方法主要是高效液相色谱法(HPLC)和液相-质谱联用技术(LC-MS)。这些方法的优点是灵敏度高，准确，重复性好；但也存在样品前处理复杂、需要洗脱程序摸索和洗脱液准备过程、单个样品分析时间长、测试费用昂贵，特别是局限于仪器所在地，且需要专业的技术人员进行操作。

拉曼散射是单色光束的入射光的光子与分子发生非弹性碰撞，即光子通过分子散射后频率改变，可通过测定散射光相对于入射光频率的变化来获取分子的结构信息。表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering，SERS)则是将待检测物分子放置于贵金属纳米材料上时拉曼散射信号显著增强的现象，这一技术具有无需样品预处理、检测用时短、检测用量少、检测限低、检测方法简便、检测结果准确等一系列优点，使其在微量检测方面具有巨大的优势和潜力；并且便携式手持拉曼检测装备已实现部分检测样品的现场检测，更是扩展了SERS的应用领域。然而SERS并不是一种有效的分离技术，单独使用通常无法实现成分复杂的混合物的检测，因此有必要通过与其他各类分离技术联用而实现复杂样品的分离检测。联用技术是将多种技术联合使用，从而实现优势互补，完成更高的科研目标，联用技术在化学检测、生物医学、药学等领域受到越来越广泛的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测多甲氧基黄酮类成分的方法，本发明采用液液萃取—薄层层析—表面增强拉曼散射(LLE-TLC-SERS)联用方法准确高效检测样品中的多甲氧基黄酮类成分(PMFs)。

本发明所述的多甲氧基黄酮类成分(PMFs)指的是柑橘来源的4种天然PMFs及其8种体内主要代谢产物(脱甲基PMFs)，化学结构如式Ⅰ所示：

式Ⅰ中，各基团的取代情况如表1中所示。

表1PMFs的名称以及取代情况

本发明所提供的检测多甲氧基黄酮类成分的方法，包括如下步骤：

(1)采用有机溶剂和水对待检测的样品进行萃取，收集有机溶剂相，即为含多甲氧基黄酮类成分的萃取液；

所述多甲氧基黄酮类成分为橘皮素、4′-去甲基橘皮素、5-去甲基橘皮素、5,4′-二去甲基橘皮素、川陈皮素、3′-去甲基川陈皮素、4′-去甲基川陈皮素、3′,4′-二去甲基川陈皮素、5-去甲基川陈皮素、5,3′-二去甲基川陈皮素、5,4′-二去甲基川陈皮素和5,3′,4′-三去甲基川陈皮素中至少一种；

(2)将经浓缩后的所述有机溶剂相进行二维薄层层析分离，并在紫外荧光检测器下对所述多甲氧基黄酮类成分所对应的分散点进行标注；

(3)在所述二维薄层层析采用的正相薄层层析板上的所述分散点上喷洒溶胶，进行表面增强拉曼散射光谱检测，得到所述分散点对应的成分的光谱强度；根据所述光谱强度和各所述成分的浓度与其拉曼散射光谱强度之间的线性关系，即得到样品中所述多甲氧基黄酮类成分的浓度。

上述的方法中，所述样品可为下述1)-3)中任一种：

1)柑橘或柑橘制品，具体可为果实、果汁、果皮等形式；

2)化学分离合成过程中的多甲氧基黄酮中间体或终产物(大部分为去甲基的PMFs)；

3)含有多甲氧基黄酮的生物样品，如体内代谢产物。

上述的方法中，步骤(1)中，所述萃取之前，将所述样品制成粉末状，可使检测更加准确；

所述有机溶剂可为乙酸乙酯、正丁醇或正己烷；

所述有机溶剂与所述水的体积比可为1～3：1，具体可为2：1；

所述样品与所述水的质量-体积比可为：1g：10～1000mL，具体可为1g：250mL。

上述的方法中，步骤(2)中，所述二维薄层层析的条件如下：

一维薄层层析的展开剂可为体积比为10～50：1的二氯甲烷和甲醇的混合液，具体可为20：1；

二维薄层层析的展开剂可为体积比可为1～3：1的正己烷和乙酸乙酯的混合液，具体可为1.5：1。

步骤(2)中，由于不同PMFs与层析板硅胶填料间的吸附解吸附能力不同，在双向展开剂推动下表现出不同的Rf值，实现了不同结构PMFs之间的二次分离。

上述的方法中，步骤(2)中，在波长为254nm或365nm的紫外光下对所述分散点进行标注(根据标准品在相同条件下的Rf值对各分散点进行对应标注)，可采用铅笔进行标注，对一维薄层层析下的分散点和二维薄层层析下的分散点分别进行标注，在波长为365nm的紫外光下分散点发荧光。

上述的方法中，步骤(3)中，所述溶胶可为Ag溶胶或Au溶胶。

上述的方法中，步骤(3)中，利用手持表面增强拉曼散射仪进行所述表面增强拉曼散射光谱检测。

上述的方法中，步骤(3)中，所述表面增强拉曼散射光谱检测的条件如下：

激光器波长为785nm；

扫描时间为10s；

扫描次数3次；

波数范围为500～3000cm^-1。

上述的方法中，步骤(3)中所述标准曲线按照常规的方法进行制作即可，即按照所述表面增强拉曼散射光谱检测的条件进行，选用PMFs标准品作为样品，各PMFs标准品的浓度范围为0～20ppm。

将本发明方法测定的含量结果与HPLC的检测结果进行比较，对比结果表明，本发明检测方法与HPLC的分析结果的准确度相当，因此具有相当高的准确性。

本发明采用液液萃取(LLE)-薄层层析(TLC)-表面增强拉曼散射(SERS)联用方法方便快捷地检测复杂样品中的PMFs成分和含量，对柑橘类食品及其它各类样品中的PMFs的快速检测具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明检测方法的流程图。

图2为12种PMFs的二维薄层层析分离图(Rf1和Rf2)。

图3为本发明实施例1中川陈皮素的PLS图。

图4为12种PMFs的PCA图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中HPLC检测的条件如下：

采用Ascentis RP-Amide反相高效液相色谱柱，最佳洗脱条件如下：流动相A：75％的水、20％的乙腈、5％的四氢呋喃和50mM的醋酸铵；流动相B：50％的水、40％的乙腈、10％的四氢呋喃和50mM醋酸铵。选定梯度洗脱程序为：流动相B由10％开始，0-5min，流动相B上升至50％；5-15min，流动相B升为70％；15-25min，流动相B升为90％；25-30min，流动相B保持100％。其中流速为1mL/min，自动进样器的温度设置为4℃，检测波长为黄酮类特征吸收326nm，进样量为10μL。

按照图1所示的流程图对含PMFs的样品(12种成分)进行检测，各成分的二维薄层层析分离图(Rf1和Rf2)如图2所示。

对12种PMFs进行SERS检测，采用Ag溶胶作为基底，采用手持表面增强拉曼散射仪检测得各种PMFs单体的表面增强拉曼散射图谱。采用激光器的波长为785nm，扫描时间为10s，扫描次数3次，波数范围为500～3000cm^-1。得到各成分的SERS谱图，经处理得到图4所示的PCA图。由该图可以看出，虽然多甲氧基黄酮结构相似，但其SERS谱图存在一定的差异，通过TQ Analyst数据处理软件进行主成分分析(PCA)，对体系内在结构关系降维，消除随机变化，采用新的综合变量反映原来多个变量所提供的主要信息，证明SERS方法可实现PMFs的识别。

实施例1、清见蜜柑果皮中多甲氧基黄酮的检测

按照图1所示的流程进行检测。

(1)将清见蜜柑果肉剥离，果皮切成细条状，加入液氮，使果皮在液氮中保持3min，用打粉机使冻实的果皮打成粉状。

(2)称取100mg柑橘果皮干粉于干净的烧杯中，而后添加25mL的超纯水并振荡混匀后转移至干净的液液萃取瓶中，而后加入2倍体积的乙酸乙酯(50mL)，将瓶体密封后振荡混匀后静置2min，乙酸乙酯相和水相由于密度不同而分层，上层为乙酸乙酯相，下层为水相；而后将下层的水相排出而除去柑橘果皮浸膏中水溶性色素、多糖、蛋白质及苷类等物质；将乙酸乙酯相经减压浓缩处理得含PMFs混合组分的萃取物9.6mg。

(3)将上述含PMFs的萃取物溶解于1.0mL的甲醇中，将配置好的溶液定量滴加于正相薄层层析板上，先采用二氯甲烷-甲醇20:1洗脱体系进行一维洗脱，再采用正己烷-乙酸乙酯6:4洗脱体系进行二维洗脱，在可持紫外灯(254nm)下可观测到分散在薄层板不同位置的4个PMFs成分的斑点，分别为川陈皮素(Rf1 0.55，Rf2 0.65)(图2中的标记5)、5-去甲基川陈皮素(Rf1 0.90，Rf2 0.92)(图2中的标记9)、橘皮素(Rf1 0.70，Rf2 0.78)(图2中的标记1)、5-去甲基橘皮素(Rf1 0.95，Rf2 0.95)(图2中的标记5)，利用铅笔描绘定位。

(4)采用商业化的Ag溶胶作为表面增强拉曼散射(SERS)表征的基底，将100μL的Ag溶胶滴加于4种PMFs分散点上，采用手持表面增强拉曼散射仪检测得各种PMFs单体的表面增强拉曼散射图谱。采用激光器的波长为785nm，扫描时间为10s，扫描次数3次，波数范围为500～3000cm^-1。利用SERS标准曲线和得到的各成分的光谱强度对4种PMFs单体进行含量测定，川陈皮素、5-去甲基川陈皮素、橘皮素、5-去甲基橘皮素的含量分别为：0.045±0.004％、0.005±0.001％、0.048±0.005％、0.003±0.001％。

HPLC的检测结果为：0.051±0.003％、0.007±0.001％、0.055±0.003％、0.004±0.001％，可见，本发明方法的检测结果与HPLC的检测结果一致。

实施例2、喂食川陈皮素小鼠体内代谢产物的样品检测

按照图1所示的流程进行检测。

(1)将AJ小鼠饲养于代谢笼中，并给予AIN-76A鼠标准食物(添加0.1％5-去甲基川陈皮素)。每天定时对食物罐进行补充并在一周内收集小鼠所有粪便样品，用打粉机使粪便样品打成粉状。

(2)称取100mg小鼠粪便样品于干净的烧杯中，而后添加25mL的超纯水并振荡混匀后转移至干净的液液萃取瓶中，而后加入2倍体积的乙酸乙酯(50mL)，将瓶体密封后振荡混匀后静置2min，乙酸乙酯相和水相由于密度不同而分层，上层为乙酸乙酯相，下层为水相；而后将下层的水相排出而除去粪便样品中的水溶性物质；将乙酸乙酯相经减压浓缩处理得含PMFs混合组分的萃取物5.8mg。

(3)将上述含PMFs的萃取物溶解于1.0mL的甲醇中，将配置好的溶液定量滴加于正相薄层层析板上，先采用二氯甲烷-甲醇20：1洗脱体系进行一维洗脱，再采用正己烷-乙酸乙酯6:4洗脱体系进行二维洗脱，在可持紫外灯(365nm)下可观测到分散在薄层板不同位置的5个PMFs成分的斑点，分别为川陈皮素(Rf1 0.55，Rf2 0.65)(图2中的标记5)、3′-去甲基川陈皮素(Rf1 0.45，Rf2 0.45)(图2中的标记6)、4′-去甲基川陈皮素(Rf1 0.46，Rf2 0.50)(图2中的标记7)、3′,4′-二去甲基川陈皮素(Rf10.35，Rf2 0.35)(图2中的标记8)、5-去甲基川陈皮素(Rf1 0.90，Rf2 0.92)(图2中的标记9)，利用铅笔描绘定位。

(4)采用商业化的Ag溶胶作为表面增强拉曼散射(SERS)表征的基底，将100μl的Ag溶胶滴加于5个PMFs分散点上，采用手持表面增强拉曼散射仪检测得各PMFs成分的表面增强拉曼散射图谱。采用激光器的波长为785nm，扫描时间为10s，扫描次数3次，波数范围为500～3000cm^-1。利用SERS标准曲线和得到的各成分的光谱强度对5种PMFs单体进行含量测定，川陈皮素、3′-去甲基川陈皮素、4′-去甲基川陈皮素、3′,4′-二去甲基川陈皮素、5-去甲基川陈皮素的含量分别为：0.021±0.003％、0.008±0.003％、0.035±0.004％、0.016±0.003％、0.011±0.002％。

HPLC的检测结果为：0.024±0.002％、0.010±0.001％、0.038±0.002％、0.016±0.002％、0.015±0.002％，可见，本发明方法的检测结果与HPLC的检测结果一致。