一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。

背景技术：

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对4型FAdV血清学抗体检测的快速方法及其试剂盒。在FAdV的编码蛋白中，hexon为FAdV的表面蛋白，且在不同血清型间相对保守，在介导FAdV病毒感染宿主细胞中起重要作用，能有效刺激机体产生体液免疫。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种基于hexon蛋白N端的检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了禽腺病毒hexon基因N端保守区原核表达质粒，之后将该质粒转化入BL21细胞进行原核表达并纯化，将纯化的蛋白作为包被抗原建立试剂盒，检测禽腺病毒特异性抗体。

本发明所述的一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被有表达hexon蛋白N端保守区的ELISA酶标板，HRP标记的兔抗鸡抗体，样品稀释液，洗涤液；所述的hexon蛋白N端保守区序列如SEQ ID NO.5所示。

其中，所述包被有表达hexon蛋白N端保守区的ELISA酶标板，是通过将纯化的hexon蛋白N端保守区表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。

其中，所述稀释液及洗涤液是10mM pH7.2的磷酸缓冲液。

所述包被有表达hexon蛋白N端保守区的ELISA酶标板，通过下述步骤得到：

(1)禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后按1:5的比例加入PBS制成悬液；经0.45um微孔滤器过滤后，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为禽腺病毒后，－20℃保存。

(2)禽腺病毒基因组的制备：首先将禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得禽腺病毒基因组，置-20℃备用。

(3)禽腺病毒hexon原核表达质粒构建：从GenBank中下载FAdV的5个型的代表株进行氨基酸序列分析，选择了N端1个比较保守的表位片段，设计出扩增禽腺病毒hexon基因N端保守区的引物以及pGEX-6p-1线性化载体的引物，具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。以pGEX-6p-1原核表达载体以及禽腺病毒基因组为模板，利用表1中所列相应引物分别PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒hexon基因N端保守区(SEQ ID NO.5)；随后利用重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒hexon基因N端保守区的PCR产物进行快速体外重组克隆(参见图1，图2)，重组克隆经序列验证后，命名为p-FAdV-hexon-N。之后将正确的质粒转化入BL21感受态细胞中，经IPTG诱导表达以后超声破碎，上清和沉淀分别跑SDS-PAGE，发现表达的蛋白主要在沉淀中以包涵体的形式存在(参见图3)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

(4)表达产物的反应原性鉴定：扩增阳性克隆的BL21细胞，1：100接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达，5h后收集细菌，用PBS重悬后40Hz，间隔8s进行破碎，破碎完成后离心分上清和沉淀，图3为SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀，可见表达产物主要表达在沉淀中以包涵体的形式存在，之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(图4)。

(5)制备检测禽腺病毒抗体的抗原:利用BL21表达的产物沉淀跑SDS-PAGE，之后用预冷的Kcl显色，切下目的条带，真空冷冻干燥以后进行研磨，加入适量的PBS溶解，离心以后去上清获得可溶性hexon蛋白N端保守区表达产物，即为检测禽腺病毒抗体的抗原。图5为SDS-PAGE分析纯化的Hexon蛋白N端保守区表达产物

(6)检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒：该试剂盒成分包括包被有hexon蛋白N端保守区的ELISA酶标板，阳性阴性对照，商品化的HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。该试剂盒检测禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：400稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：400稀释后加入A3、A4孔，剩下的的孔用于检测待检样品(1：400稀释)，37度反应1小时；PBS洗涤3遍后，加入工作浓度的HRP标记的兔抗鸡抗体，37度反应1小时；PBS洗涤5遍后，进行显色10分钟，之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值,OD450大于0.2的孔判为阳性。

本发明的有益效果体现在：本发明建立的禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒能特异性的检测出抗禽腺病毒抗体，而不能检测出抗其它病原的抗体(图6)。因此，该试剂盒具有良好禽腺病毒的特异性，能用于禽腺病毒感染状况流行病学调查。

附图说明

图1，PCR扩增线性化pGEX-6p-1载体

泳道1：线性化的pGEX-6p-1载体；泳道M：1Kb DNA Ladder。

图2，PCR扩增Hexon基因N端保守区

泳道1：禽腺病毒Hexon基因N端保守区的扩增；泳道M：100bp DNA Ladder。

图3，SDS-PAGE分析p-FAdV-Hexon-N的表达

泳道1、2：分别为p-FAdV-Hexon-N片段上清及沉淀；泳道3、9：GST上清；泳道4、10：GST沉淀；泳道M：蛋白Marker；泳道5、6:分别为p-FAdV-Hexon其它保守片段1的上清及沉淀；泳道7、8:分别为p-FAdV-Hexon其它保守片段2的上清及沉淀；泳道11、12:分别为p-FAdV-Hexon其它保守片段3的上清及沉淀。

图4，Western-blot分析制备的抗原与阳性血清的反应性

泳道M：蛋白Marker；泳道1：阴性对照GST；泳道2：p-FAdV-Hexon其它保守片段3表达产物；泳道3：p-FAdV-Hexon其它保守片段2表达产物；泳道4：p-FAdV-Hexon其它保守片段1表达产物为片段2的BL21表达产物；泳道5：本发明p-FAdV-Hexon-N端片段表达产物。

图5，SDS-PAGE分析纯化的p-FAdV-Hexon-N的表达产物

泳道M:蛋白Marker；泳道1:纯化的p-FAdV-Hexon-N的表达产物

图6，检测FAdV抗体的间接ELISA试剂盒检测效果。

具体实施方式

实施例：

1,禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBS制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为禽腺病毒后，－20℃保存。

2，设计扩增出含pGEX-6p-1线性化载体与禽腺病毒Hexon蛋白N端保守区片段的引物：具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1.PCR扩增线性化pGEX-6p-1及禽腺病毒Hexon蛋白N端保守区引物

3,禽腺病毒基因组的制备：取禽腺病毒分离毒株病毒上清400uL于1.5mL指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L E DTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时；加入400uLTris平衡酚，充分混匀后10000r/min离心10分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入400uL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得血清4型禽腺病毒基因组，置-20℃备用。

4，PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及禽腺病毒Hexon基因N端保守区片段：分别以pGEX-6p-1载体质粒(Invitrogen公司)以及以上制备的禽腺病毒基因组为模板，表1所述相应引物为引物分别进行PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒Hexon基因N端保守区。PCR扩增反应体系为：模板1uL，5×Buffer10uL，10mM dNTP Mix 1uL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为10μmol 2uL，高保真酶1uL，加入灭菌超纯水至50uL。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4分钟，随后进行30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟)，72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1，图2所示)。

5，pFAdV-Hexon-N重组表达载体构建：将以上纯化的线性化载体pGEX-6p-1以及禽腺病毒Hexon基因N端保守区片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM Ⅱ的作用下进行重组克隆。具体重组反应体系如下：纯化的禽腺病毒Hexon基因片段PCR产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-1线性化载体50ng，2μL商品化的ExnaseTM Ⅱ酶，4μL5倍的缓冲液，其它补加水至20μL。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μL反应物转化到常规感受态细菌，涂LB平板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定。鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中进行诱导表达。

6，表达产物的反应原性鉴定：扩增阳性克隆的BL21细胞，1：100接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达，5h后收集细菌，用PBS重悬后40Hz，间隔8s进行破碎，破碎完成后离心分上清和沉淀，图3为SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀，可见表达产物主要表达在沉淀中以包涵体的形式存在，之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(图4)。用抗禽腺病毒阳性血清进行的Western-blot分析证明，只有本发明表达的Hexon蛋白N端保守片段能与禽腺病毒阳性血清进行良好的免疫反应，而其它表达的Hexon蛋白保守片段(包括p-FAdV-Hexon保守片段1，2，3)均不能与抗禽腺病毒阳性血清进行良好免疫反应。p-FAdV-Hexon保守片段1，2，3的扩增引物如表2，其他操作相同

表2.PCR扩增保守片段1，2，3引物

7，制备检测禽腺病毒抗体的抗原：利用BL21表达的产物沉淀进行SDS-PAGE之后用预冷的Kcl显色，切下目的条带，真空冷冻干燥以后进行研磨，加入适量的PBS溶解，离心以后去上清获得可溶性Hexon蛋白N端保守区表达产物，即为检测禽腺病毒抗体的抗原。图5为SDS-PAGE分析纯化的Hexon蛋白N端保守区表达产物。

8，检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒组装及特性：该试剂盒成分包括包被有Hexon蛋白N端保守区表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照，商品化的HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。该试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：400稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：400稀释后加入A3、A4孔，剩下的的孔用于检测待检样品，37度反应1小时；PBS洗涤3遍后，加入1：50000稀释的HRP标记的兔抗鸡抗体，37度反应1小时；PBS洗涤5遍后，进行显色10分钟，之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值。以大于阴性OD值+3倍标准偏差的孔判为阳性。试剂盒特异性试验发现，该试剂盒仅与阳性血清反应(FadV1，FadV1)，而SPF鸡血清、抗马立克氏病病毒血清(MDV)、抗鸡新城疫病毒血清(NDV)、抗禽白血病病毒血清(ALV)、抗禽流感病毒血清(AIV),抗传染性法氏囊病病毒血清(IBDV)以及抗传染性支气管炎病毒血清(IBV)均不反应(图6)。