蛋白质免疫检测方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种蛋白质免疫检测方法。

背景技术：

Western Blotting技术(蛋白质印迹技术)是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体上，利用抗原抗体的特异性结合反应来检测目标蛋白的表达或者修饰状态的方法。Western Blotting技术是目前生物化学实验中最常用到的检测蛋白的方法，但是，该方法很多时候都会遇到背景过高、信号太弱等问题，从而影响实验结果分析和实验进度。

目标蛋白(即抗原)在总蛋白中的丰度、抗体结合的特异性和反应性、二抗孵育信号放大过程中信噪比的控制等因素，都会对结果的一致性和稳定性造成相当大的影响。一抗的特异性和反应性决定了最终信号的质量。目前的一抗分为单克隆抗体和多克隆抗体，通常价格高昂，而其中单抗的效果较好价格也更高。而对于一些低丰度蛋白，通常为了得到清晰的条带，不得不增加一抗的浓度，这不仅使得成本上升，也容易造成非特异性条带增多，使得信噪比下降。对于一抗的特异性和结合能力的提升将会对Western blotting的效果产生积极的影响。但目前市场上针对Western blotting的增强试剂大多以增强化学发光反应的信号为手段，从而放大最终得到的信号。其局限性也是显而易见的，这种放大过程将信号和噪音同时放大。

技术实现要素：

基于此，有必要针对蛋白质免疫检测方法中噪音同时放大的问题，提供一种降低噪音放大的蛋白质免疫检测方法。

一种蛋白质免疫检测方法，包括如下步骤：

S1、将目标蛋白转移到固相载体上；

S2、将目标蛋白用封闭剂封闭；

S3、加入一抗，孵育后洗涤；

S4、加入工程化酶，孵育后洗涤；所述工程化酶能够与所述一抗特异性结合并与所述目标蛋白反应；

S5、加入腺苷三磷酸以及镁离子，孵育后洗涤；

S6、加入过氧化物酶，孵育后洗涤；

S7、加入发光试剂成像显色。

本发明的蛋白质免疫检测方法，采用新的信号增强原理，其能够通过酶促反应修饰目标蛋白进而增加信号来源，同时使一抗的特异性和反应性被有选择的加强，从而在加强信号的同时，并不会放大噪音，进而有效提高信噪比。本发明的蛋白质免疫检测方法，同时可以大量节约一抗的使用量，进而有效降低成本。本发明的过氧化物酶单独使用，具有很强的通用性，不需要针对鼠源或兔源的一抗选择不同的二抗，因而经济实用。上述蛋白质免疫检测方法，主要应用于Western blotting，同时在其它蛋白质免疫检测中，如ELISA中也有一定的应用前景，为蛋白质的检测和定量提供了更广泛的选择。

在其中一个实施例中，所述固相载体为聚偏氟乙烯膜。

在其中一个实施例中，所述封闭剂为脱脂牛奶。

在其中一个实施例中，所述一抗为α-Tubulin抗体。

在其中一个实施例中，所述一抗的稀释比例为1:1000～1:100000。

在其中一个实施例中，所述孵育的温度为4～37℃，所述孵育的时间为5min～16h。

在其中一个实施例中，所述洗涤采用TBST缓冲液洗涤。

在其中一个实施例中，所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶。

在其中一个实施例中，所述发光试剂为ECL发光试剂。

在其中一个实施例中，所述蛋白质免疫检测方法为蛋白质印迹检测。

附图说明

图1为实施例1的显色图案。

图2为对比例1的显色图案。

图3为测试例1的显色图案。

图4为测试例2的显色图案。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种蛋白质免疫检测方法。以下以蛋白质印迹(Western Blotting)为例进行说明，可以理解的是，本发明的检测方法还适用于其它蛋白质免疫检测中，例如ELISA(酶联免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay)。

具体地，蛋白质免疫检测方法，包括如下步骤：

S1、将目标蛋白转移到固相载体上。

在蛋白质印迹(Western Blotting)中，在步骤S1之前还包括获取目标蛋白的步骤。

获取目标蛋白的步骤具体包括：首先，提取细胞蛋白；接着，测定所提取的细胞蛋白的浓度；然后，将细胞蛋白电泳分离。

其中，提取细胞蛋白的目的是，获得高丰度、高品质的目标蛋白。提取细胞蛋白一般是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取细胞蛋白的方法很多，鉴于不同的实际情况以及对蛋白性质的要求不同，可以选用不同的裂解方法。

在本实施方式中，采用RIPA裂解液对细胞进行裂解。

其中，浓度测定可以采用Bradford法(考马斯亮蓝法)、Lowry法(Folin-酚试剂法)、或BCA法等。在本实施方式中，采用BCA法进行蛋白测定。

其中，电泳分离可以采用本领域技术人员所公知的各种方法，在此不再赘述。

在步骤S1中，固相载体又叫作固相支持物、或转移膜，其主要作用是，为目标蛋白提供支撑载体。根据固相载体与目标蛋白的结合能力(也就是单位面积的固相载体能结合目标蛋白的载量)、固相载体的孔径、后续显色检测以及其它因素来选择合适的固相载体。

优选地，固相载体选自NC膜(硝酸纤维素膜)、尼龙膜、或PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)。在本实施方式中，固相载体为PVDF膜。

S2、将目标蛋白用封闭剂封闭。

步骤S2的主要目的是，为了避免作为检测试剂的一抗与固相载体发生非特异性结合，使非特异性背景提高。步骤S2将固相载体上的潜在结合位点进行封闭处理，从而使一抗无法与固相载体进行非特异性结合。

其中，封闭剂一般采用脱脂奶粉或BSA(牛血清白蛋白)。在本实施方式中，封闭剂为脱脂奶粉。

S3、加入一抗，孵育后洗涤。

其中，一抗也叫作第一抗体，其的主要目的是，与目标蛋白(即抗原)产生抗原-抗体特异性结合。根据目标蛋白的不同，可以选择合适的一抗来实现与目标蛋白的特异性结合。

在本实施方式中，一抗为α-Tubulin抗体。

优选地，一抗的稀释比例为1:1000～1:100000。这样在保证良好的信号强度下，可以达到节省一抗的使用量的效果。

加入一抗之后进行孵育操作，孵育操作的目的是使一抗和目标蛋白充分进行特异性结合。

优选地，孵育的温度为4～37℃，孵育的时间为5min～16h。

孵育操作之后进行洗涤操作，洗涤操作的目的是，去除未进行特异性结合的一抗。

优选地，洗涤采用TBST缓冲液洗涤。当然，可以理解的是，也可以采用其它洗涤液进行洗涤，例如PBST。

S4、加入工程化酶，孵育后洗涤。

其中，工程化酶的主要作用是，能够与一抗产生特异性结合并与目标蛋白反应，从而识别目标蛋白并在目标蛋白上加特异性修饰。

优选地，工程化酶的稀释比例为1:2000。

其中，步骤S4的孵育和洗涤，可以参照步骤S3中的孵育洗涤，也可做适当的调整，在此不再赘述。

S5、加入腺苷三磷酸以及镁离子，孵育后洗涤。

在步骤S5中，加入腺苷三磷酸与镁离子的主要目的是，通过ATP和镁离子的协同作用，使工程化酶与一抗快速产生特异性结合，使反应催化，从而达到增强信号的来源。

其中，腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，简写ATP)又叫腺嘌呤核苷三磷酸、或三磷酸腺苷。

腺苷三磷酸以及镁离子可以混合加入，也可分别加入。混合加入可以是腺苷三磷酸以及镁离子简单混合，也可以是以腺苷三磷酸镁的形式加入。分别加入可以是先加入腺苷三磷酸后加入镁离子，也可以是先加入镁离子后加入腺苷三磷酸。

同样地，步骤S5的孵育和洗涤，可以参照步骤S3中的孵育洗涤，也可做适当的调整，在此不再赘述。

S6、加入过氧化物酶，孵育后洗涤。

其中，过氧化物酶的主要目的是，检测工程化酶的特异性修饰，将一抗信号特异性的呈现出来，从而使最终信号得以显示和记录。

优选地，过氧化物酶为HRP(辣根过氧化物酶)。

S7、加入发光试剂成像显色。

优选地，发光试剂为ECL(增强化学发光)发光试剂。

成像显色的操作可以采用本领域技术人员所公知的各种成像显色操作，在此不再赘述。

本发明的蛋白质免疫检测方法，采用新的信号增强原理，其能够通过酶促反应修饰目标蛋白进而增加信号来源，同时使一抗的特异性和反应性被有选择的加强，从而在加强信号的同时，并不会放大噪音，进而有效提高信噪比。本发明的蛋白质免疫检测方法，可以放大一抗信号10～100倍，这样可以大量节约一抗的使用量，进而有效降低成本。本发明的过氧化物酶单独使用，具有很强的通用性，不需要针对鼠源或兔源的一抗选择不同的二抗，因而经济实用。上述蛋白质免疫检测方法，主要应用于Western blotting，同时在其它蛋白质免疫检测中，如ELISA中也有一定的应用前景，为蛋白质的检测和定量提供了更广泛的选择。

以下结合具体的实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1

将A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)培养于10％胎牛血清的高糖DMEM培养液中，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，3天传代一次，取对数生长期的细胞进行实验。

将一盘(9cm)细胞(约10⁷)裂解于1mL RIPA裂解液(50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1％Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中。并在冰上孵育20min，再在4℃、12000r/min离心15min得到总蛋白。

BCA法测蛋白浓度并分装。

取总蛋白20μg每孔，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到PVDF膜上，5％(W/W)脱脂牛奶封闭1h后将膜剪成两份。

将其中一份膜，加1:5000比例稀释的α-Tubulin一抗，4℃孵育过夜后TBST室温摇床洗膜3×10min(即3次、每次10min)，加入1：2000稀释的工程化酶25℃孵育1h，TBST室温摇床洗膜3×10min，加入腺苷三磷酸镁后37℃孵育1h，再加入HRP室温孵育1h，TBST室温摇床洗膜3×10min，加ECL发光试剂后成像显色。

显色结果见图1。

对比例1

将实施例1的剪后的另一份膜，加1:5000比例稀释的一抗(α-Tubulin抗体)，4℃孵育过夜后TBST室温摇床洗膜3×10min，再加入1:2000稀释的二抗(anti-human-HRP)，25℃孵育1h，TBST室温摇床洗膜3×10min，加ECL发光试剂后成像显色。

显色结果见图2。

测试例1：

取5μL工程化酶滴于甲醇活化后的PVDF膜上，待液滴消失后用5％(W/W)封闭剂(脱脂牛奶)封闭1h，封闭后加入腺苷三磷酸镁于37℃孵育1h，TBST室温摇床洗膜3×10min，后加入HRP室温孵育1h，TBST室温摇床洗膜3×10min，加ECL发光试剂后成像显色。显色结果见图3。

测试例2

取5μL工程化酶滴于甲醇活化后的PVDF膜上，待液滴消失后用5％(W/W)封闭剂(脱脂牛奶)封闭1h，封闭后加入PBS(磷酸缓冲盐溶液)于37℃孵育1h，TBST室温摇床洗膜3×10min，后加入HRP室温孵育1h，TBST室温摇床洗膜3×10min，加ECL发光试剂后成像显色。显色结果见图4。

通过图1以及图2可以看出，图1中信号强大远远大于图2中的信号强度，从而说明本发明的检测方法对α-Tubulin免疫检测放大效果明显。进一步说明本发明的检测方法可以有效增强信号强度，而不放大噪音，有效提高了检测的灵敏度。

结合参见图3以及图4，图3中信号强大远远大于图4中的信号强度，从而说明本发明的检测方法，腺苷三磷酸镁可以特异性的使得信号增强的作用，其特异性好。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。