一种快速、灵敏的检测血液中依托咪酯的方法与流程

本发明公开了一种快速、灵敏的检测血液中依托咪酯的方法。本方法以离子迁移谱技术为基本检测技术，利用离子迁移谱仪作为检测手段，采用正离子高压模式，结合传统的液液萃取前处理方法、高温热解析进样方式。发明中的装置稳定、可靠，方法简便、快速、高效。所建立的定性、定量分析方法满足医生对麻醉病人临床给药浓度分析范围。本发明中的检测方法可广泛用于临床给药深度分析，指导临床医生精准用药。

背景技术：

麻醉是为保证手术的顺利进行而通过麻醉药物对患者施以镇静、镇痛、催眠、肌松等多方面效用，以消除患者对手术中各种刺激的感知及反应。全身麻醉的临床实施包括吸入麻醉与全凭静脉麻醉两种。适合做全身麻醉剂的化合物的要求：理化性质稳定、无毒、快速分布、可代谢及排泄，使麻醉过程能够达到“快麻快醒”；由于这些特点使得麻醉剂的快速动态监测存在困难。实时监测麻醉过程中，麻醉剂的浓度是麻醉医生实施安全有效麻醉的依据。在实施全静脉麻醉时的主要麻醉剂是丙泊酚和依托咪酯，国内外尚无实时监测麻醉药浓度的设备。

依托咪酯是咪唑的衍生物，化学名称为r-(+)-乙基-1-(1-苯乙基)-1-氢-咪唑-5-羧酸酯。依托咪酯分子量为244，为减少依托咪酯的某些不良反应引入了脂质乳剂的新配方。目前国内外推荐的临床使用剂量与方法都因无快速有效的血药浓度分析方法而在具体应用时常有差错。

目前国内外均无实时监测依托咪酯的血药浓度的方法。手术中75％的依托咪酯与蛋白结合。当病情(如肝病、肾病)影响血清蛋白时，游离(未结合)药物的比例可发生不同程度的变化，可能使其药理作用增强。依托咪酯在肝硬化患者的分布容积增加1倍，但是其清除率正常，因此其消除半衰期为正常的2倍。其初始分布半衰期及临床药效可能不变。年龄增加可使依托咪酯的初始分布容积减少，清除率下降。

目前，临床上常用基于脑电信号检测和分析的技术来间接反映患者麻醉深度，如bis，熵指数等，但是这些技术在精确评估患者麻醉深度以减少术中知晓方面的作用还颇有争议。精准麻醉的实现，需要了解给药后麻醉剂在效应室及血液中的实时浓度分布和变化趋势，因此，亟待发展实时测量麻醉剂的血药浓度的仪器和方法。依托咪酯血药浓度监测国外用hplc法，国内仅有一些报道，hplc法监测费时费力，前处理复杂，更主要是用hplc法依托咪酯血药浓度监测特别不确切，所以国内外也少用，多处于科学研究阶段。气相色谱(gc)、高效液相色谱(hplc)，气质联用(gc-ms)和液质联用(hplc-ms)虽能监测血药浓度，但不能实时在线测量，而且由于设备庞大、需要复杂的样品前处理、耗时较长等缺点，即使在实验室得出药物的相关数据，但是麻醉早已结束，故以上设备均不可能应用于临床。用离子迁移谱检测仪监测依托咪酯血药浓度在国内外均无报道。

离子迁移谱(ionmobilityspectrometry，ims)技术20世纪70年代出现的一种快速分离检测技术，与传统的质谱、色谱仪器相比，具有结构简单，灵敏度高，分析速度快，结果可靠的特点。目前我们研究的ims已经广泛应用在医疗检测、化学战剂、毒品、爆炸物探测、环境监测、有毒气体监测、火灾监测、水污染监测和食品监测等领域。本方法的研发必然引发全静脉依托咪酯麻醉方法的革新，推动静脉麻醉领域的创新技术与创新理论，是实现精准麻醉、安全静脉麻醉的唯一关键技术。

技术实现要素：

本发明涉及一种快速、灵敏的检测血液中依托咪酯的方法，检测装置为离子迁移谱仪，步骤如下：

1)将依托咪酯药物标准品溶解于离体血浆或离体血液中，配制成5个以上含不同血药浓度的依托咪酯药物样本，样本中依托咪酯药物浓度处于0.5-20ng/μl，经过相同体积的有机溶剂萃取后，分别取体积a的有机相滴在进样载片上，同时分别添加体积a的内标校准试剂，体积a的范围为10-50μl；室温(20-30℃)挥干溶剂后，利用离子迁移谱检测仪，采用正离子高压模式检测分析，热解析样品被电离后，连续记录离子到达离子迁移谱检测器的迁移时间和信号峰强度离子迁移谱图；

2)根据依托咪酯和内标试剂的迁移时间，记录两个峰的最大信号强度，然后样品信号强度与内标信号强度求比值；根据血药浓度与对应的信号强度比值拟合生成标准曲线方程。

3)取100-1000μl的注射依托咪酯药物的人或动物的离体待测血液样品，采用有机溶剂提取法，提取待测目标物；取体积a待测目标物滴在进样载片上，同时添加体积a的内标校准试剂；室温(20-30℃)挥干有机溶剂后，利用离子迁移谱检测仪，采用正离子高压模式检测分析，热解析样品后，连续记录离子到达离子迁移谱检测器的迁移时间和信号峰强度离子迁移谱图；计算样品信号强度与内标信号强度求比值。

4)根据步骤1)中依托咪酯药物和内标检测所获得的信号峰迁移时间确定待测血液样品中依托咪酯药物的信号峰和内标峰，对待测血液样品中依托咪酯药物定性；将步骤3)中比值带入步骤2)中标准曲线方程，进一步确定血液中依托咪酯药物的含量。

由于人或动物的个体差异，进行待测血液样品检测前，应首先进行方法可行性确认：

检测前进行标准品检测：步骤1)实验要进行血浆或血液样品的背景信号空白测试，将血浆或血液样品背景信号的迁移时间与上述目标物所获得的迁移时间进行比对，若无重合峰证明此检测方法可行，可继续以下实验过程；若有重合峰证明此检测方法于此人或动物的血浆或血液样品不可行。

有机溶剂为乙酸乙酯或氯仿，离心提取时间1min以上；有机溶剂与血浆不互溶，但是血浆中的药物成分却易溶于提取剂中；同时保证血液中成分的提取物在迁移谱正离子模式下与目标峰无重叠干扰。

内标物属于稳定的钛酸酯类，且与血液基质没有重叠峰可以完全分离开的邻苯二甲酸二壬酯(dnp)或是邻苯二甲酸二癸酯(didp)，溶剂为乙酸乙酯或氯仿，浓度为5-50ng/μl；通过内标校准可以排除仪器日间差异，保证数据重复性，实现精准定量。

药物空白添加形成的标准曲线方程是以血药浓度为横坐标，目标物最大信号强度与内标最大信号强度之比(或是解析面积之比)为纵坐标；热解析信号采集时间为1-30s之内。

步骤1)将依托咪酯药物标准品溶解于离体血浆或离体血液中，配制成含0.5、1、2.5、5、12.5ng/μl依托咪酯药物样本。

离体血浆或离体血液为服药前人或动物的血浆或血液；离体待测血液样品为服药后人或动物的血液；且它们来源相同，即来源个体相同。

本方法中的检测装置为离子迁移谱仪采用正离子高压模式，仪器主要包括进样装置、离子迁移管(含电离源、反应区、离子门、迁移区、信号接收装置)、信号转换系统和气路干燥系统组成，所述的进样装置由进样口及设置于进样口外侧的载气输送管路构成，在进样口上侧连接有热解析进样器热解析温度大于150-250℃，所述的进样载片进样时置于进样口中，载气将样品送入到离子迁移谱迁移管内进行分析检测。

离子迁移谱实验中使用的载气和漂气气源为独立外供气源；气源气体需要经过活化处理的硅胶、分子筛和活性炭过滤，除去水、有机物和灰尘；气源条件固定，可以保证离子迁移谱背景信号稳定。

依托咪酯血药浓度监测对保证临床安全性具有极为重要的意义。这种检测方法的成功开发，将把离子迁移谱引向医学界，同时弥补我国医学界麻醉药物依托咪酯检测方面的落后和差距。

本发明的优点如下：

1.与传统的液相色谱方法相比，将离子迁移谱作为分析血液中依托咪酯的手段具有以下优点：研究发现了一种依托咪酯离子迁移谱检测的内标试剂，建立了一种离子迁移谱检测血中依托咪酯浓度的标准方法。通过内标校准实现了用离子迁移谱进行依托咪酯麻醉药定量分析，避免了日间差，重复性好。

2.本测量方法简便、快速、可靠性好，无需专业背景人员操作。进样体积小、简单样品前处理、灵敏度高、定性、定量分析准确，非常适合临床快速分析检测。

3.整个仪器携带方便；测量速度快，单个样品分析测试时间小于30s；仪器的运行费用很低，消耗品很少；仪器的性价比高，分析速度快。

附图说明

图1为正离子模式下检测依托咪酯的离子迁移谱图；

图2为正离子模式下依托咪酯定量分析标准曲线。

具体实施方式

图1-2给出了一些实验谱图对本发明给与说明。

实施例1

试验中采用的实验条件均为：电离源为灯电离的离子迁移谱，正离子模式高压源，步进电机热解析进样器。实验时迁移管温度保持在100℃，进样器200℃，载气(空气)、漂气(空气)气流分别为300ml/min、400ml/min。内标选择dnp，10ng/μl，样品进样量10μl,内标取10μl混合一起室温(20-30℃)晾干。

图1给出了正离子模式下检测依托咪酯的离子迁移谱图。

如图1所示，通过离子迁移率校准可知。当丙酮迁移时间在3.24ms时，依托咪酯单体峰迁移时间为4.64ms，内标dnp迁移时间位于7ms。后续试验以此为标准进行定性分析。

实施例2

试验中采用的实验条件均为：电离源为灯电离的离子迁移谱，正离子模式高压源，步进电机热解析进样器。实验时迁移管温度保持在100℃，进样器200℃，载气(空气)、漂气(空气)气流分别为300ml/min、400ml/min。内标选择dnp，10ng/μl，样品进样量10μl,内标取10μl混合一起室温(20-30℃)晾干。依托咪酯药物配制成含0.5、1、2.5、5、12.5ng/μl依托咪酯药物的样本。

图2给出了正离子模式下依托咪酯定量分析标准曲线。

根据依托咪酯和内标试剂的迁移时间，连续采集离子迁移谱图30秒，选连续采集样品信号峰强度与内标信号强度最大值的比值。根据血药浓度(0-12.5ng/μl)与最大信号强度比值拟合生成标准曲线方程；如图2，标准曲线方程为y＝0.126*x+0.265,相关系数r>0.98。所建立的定性、定量分析方法满足医生对麻醉病人的人体给药浓度分析范围。

实施例3

试验中采用的实验条件均为：电离源为灯电离的离子迁移谱，正离子模式高压源，步进电机热解析进样器。实验时迁移管温度保持在100℃，进样器200℃，载气(空气)、漂气(空气)气流分别为300ml/min、400ml/min。内标选择dnp，10ng/μl，样品进样量10μl,内标取10μl混合一起室温(20-30℃)晾干。

根据依托咪酯药物和内标检测所获得的信号峰迁移时间确定待测血液样品中依托咪酯药物的信号峰和内标峰，将最大信号强度比值带入标准曲线方程中，可以进一步确定血液中依托咪酯药物的含量。

如一未知浓度依托咪酯样品，检测出最大信号强度依次为：638mv、662mv、608mv，三次对应的内标信号强度依次为1534mv、1695mv、1490mv；比值依次为：0.3989、0.3316、0.4080，平均值为0.3795。代入上述实施例标准曲线方程中，得依托咪酯血药浓度0.9ng/μl。