本发明属于利用苔藓植物检测土壤重金属污染技术领域，尤其涉及一种基于波叶仙鹤藓精确检测土壤铅污染度的方法。
背景技术：
铅是一种具较强潜在危害性的重金属污染元素，对人畜生物具有致癌、致畸、致突变的毒性特征，在土壤中较稳定，不易代谢和降解，但可通过食物链的生物富集作用使人畜发生慢性中毒，因此备受重视。由于含铅产品的产量及用途在不断增加，据统计，中国仅铅污染的耕地就有6000～8000万亩，每年由工业生产废弃物所产生的铅，其中70％～80％会排放进入到土壤中；目前大量使用的石油燃料中也有相当高的铅含量，经大气沉降后，也加重了土壤中的铅污染。此外，铅污染具有相当大的不可逆性，土壤一旦被污染，对农作物的影响将持续很长一段时间。业内对土壤铅污染的评价方法多采用化学检测法，即测定出土壤中铅的含量值，以此作为衡量土壤铅生态安全性的依据。但土壤中的铅元素实际所产生的毒性与它的生物有效性密切相关，衡量土壤是否已达到安全标准，最终应以土壤中的实际铅毒性对生物体所造成的伤害程度作为判断依据。由此看来，若利用某种对铅具有强敏感性的低等植物，通过其生长状况和生理反应来指示土壤铅污染，可具有较强的直观性和说服力。换言之，若该植物所处的含铅土壤尚未对其生长造成影响，说明此时的土壤是安全的，适合种植其他农作物；否则即说明该土壤已超出了铅污染安全限度，具有一定的铅污染风险而不适于种植农作物。目前针对环境铅污染评价方面，运用较多的是苔藓植物检测法，但该类方法仅见于用在对大气铅污染的检测，对土壤的检测却一直未见有涉及。若将苔藓植物检测法应用于土壤铅污染的检测，则需要解决的前提问题：一是如何消除自然环境中长期生长的苔藓植物本身对污染环境所具有的背景适应性，即如何提升所用检测材料对铅污染物的敏感性；二是如何避开空气中含铅粉尘颗粒的影响，而使苔藓所受到的铅毒害全部来自于其生长的土壤。解决好上述两问题可从根本上提高苔藓植物检测土壤铅污染的效果和精确度。
技术实现要素：
本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种基于波叶仙鹤藓精确检测土壤铅污染度的方法，旨在解决如何获取合适的检测材料以及如何避开空气中含铅粉尘颗粒的影响，从而使敏感性极高的苔藓所受到的铅毒害全部来自于其生长的土壤，进而在根本上提高苔藓植物检测土壤铅污染的效果和精确度。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：
本发明提供的基于波叶仙鹤藓精确检测土壤铅污染度的方法，其特征在于，该方法包括植物材料的培植获得方法和双层隔离式吸污防尘检测方法；
植物材料的培植获得方法：
制备孢子悬液：采集孢子生长期已成熟的波叶仙鹤藓植株的孢子体若干，放于石英研钵中，加入少许液氮后，轻轻研磨至孢子体的苞蒴完全破裂，使内藏的孢子散出，加入蒸馏水反复冲洗研钵，将洗液一并通过网孔内径为1mm的不锈钢滤网进行过滤，滤掉大部分的苞蒴残体，从而获得孢子悬液；
制备培养基质：以体积比为1︰1的洁净砂质土壤和植物残体发酵物为基质配方，充分混合后作为波叶仙鹤藓培养基质；将制备好的培养基质平铺于直径35cm、高6cm的聚乙烯浅盘中，基质厚度为5cm；
设置培养条件：将孢子悬液均匀喷洒于培养基质中，放置于人工光照气候培养箱内，模拟出苗前四五月份的野外环境，待波叶仙鹤藓幼苗开始长出；然后模拟出苗后六七月份的野外环境继续培养；出苗后40～50d即进入孢子生长阶段，将该时期的植株作为土壤铅污染的检测材料；
双层隔离式吸污防尘检测方法：利用双层隔离式吸污防尘装置覆盖用于作为土壤铅污染检测的植株；所述双层隔离式吸污防尘装置设置有圆锥体形状的支撑支架，由一大一小组成；圆锥面上由4根铁丝连接顶部和底部圆环即可；两套支架周身用食品保鲜膜或其他薄而透明的材料包裹，且两支架底部之间的部分亦用膜材料连封，作为活性炭的承载面；内支架底部中空不封闭；内外两支架的周身包裹膜上分别留有孔洞，外孔居下，孔径稍大，内孔居上，孔径稍小；使用时，在连接两支架底部之间的承载面上放置一层活性炭，再将该支架整体倒扣于波叶仙鹤藓植物体上。
进一步，植物残体发酵物以花卉沤制肥料代替。
进一步，将孢子悬液均匀喷洒于培养基质中，放置于人工光照气候培养箱内，初始培养温度设置为22℃～26℃，光照强度设置为2500Lux/10h，每日喷洒1/6浓度的Hogland营养液300-400mL/盘，使基质湿度保持在70％～80％；20～30d后波叶仙鹤藓幼苗开始长出，此时将培养温度设置为32℃～37℃，光照强度设置为5000Lux/14h；出苗后40～50d即进入孢子生长阶段，将该时期的植株作为土壤铅污染的检测材料。
本发明采用了一种尚未报道过的、对土壤中的铅具有极高敏感性的苔藓植物——波叶仙鹤藓，其进化程度低、植物体结构简单、对环境中的铅毒性抵抗力弱，极易受到土壤中铅的毒害并快速地表现出症状，且该种植物在外观上不同于一般的细小苔藓，其植株个体相对较大，成熟时高度可达4～6cm，受到铅毒害后表现出的症状十分明显，很容易进行观测，因此非常适合进行土壤铅污染检测。本发明已进行的相关探索结果显示，无论从该植物的外观形态，还是叶绿素含量、可溶性蛋白含量及MDA浓度等生理指标的反应来看，该植物对土壤中的铅具有较强的感应能力，且各指标变化程度较好地对应了土壤中的铅污染程度，因此这些指标适合作为波叶仙鹤藓检测土壤铅污染的有效参数。但在具体应用时发现，从自然环境中直接采集到的波叶仙鹤藓，其对土壤铅污染的感应能力有所降低，导致检测效果不佳，究其原因是由于其在长期生长过程中已对污染环境产生了一定适应性，应用前需经特殊处理消除其背景适应性，以增强其对铅的敏感度；此外还发现，在利用波叶仙鹤藓进行土壤铅污染现场检测时，其所处环境一般为开放性空间，空气中存在较多形式的飘浮态含铅污染物，如含铅颗粒、含铅粉尘、含铅气溶胶粒子等，地表的含铅粉尘颗粒也极容易散逸到低空大气中，而波叶仙鹤藓由于表面无角质层和蜡质层的覆盖保护、气孔裸露于植物体表(这是苔藓植物结构上区别于高等植物的地方)，故很容易受到上述气态含铅污染物的侵入毒害，这也是一直以来将苔藓植物应用于大气铅污染检测的主要原理和依据。因此在利用波叶仙鹤藓检测土壤铅污染时，很难判定其受到的铅毒害是来自于土壤亦或是大气。上述两方面因素的存在，降低了波叶仙鹤藓对土壤铅污染的检测效果和准确度。基于此，本发明涉及一种人工培植波叶仙鹤藓的技术方法，通过孢子萌发再生新鲜植株的过程，有效地消除了其对原生环境的背景适应性，进一步增强了其对土壤铅污染的敏感度，以此获取可用于高效检测土壤铅污染的植株材料；本发明还涉及一种能有效隔离空气中含铅污染物的方法，使波叶仙鹤藓在检测土壤铅污染时，所受到的铅毒全部来自于土壤中，进一步增强了波叶仙鹤藓检测土壤铅污染的精确度和可行性。本发明规范了苔藓植物检测环境污染的技术标准，具有极高的应用价值和推广前景。
附图说明
图1是本发明提供的双层隔离式吸污防尘罩基本架构示意图。
图中：1、外架；2、内架；3、内孔；4、外孔；5、活性炭层。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。
本发明采用了一种尚未报道过的、对土壤中的铅具有极高敏感性的苔藓植物——波叶仙鹤藓，其进化程度低、植物体结构简单、对环境中的铅毒性抵抗力弱，极易受到土壤中铅的毒害并快速地表现出症状，且该种植物在外观上不同于一般的细小苔藓，其植株个体相对较大，成熟时高度可达4～6cm，受到铅毒害后表现出的症状十分明显，很容易进行观测，因此非常适合进行土壤铅污染检测。本发明已进行的相关探索结果显示，无论从该植物的外观形态，还是叶绿素含量、可溶性蛋白含量及MDA浓度等生理指标的反应来看，该植物对土壤中的铅具有较强的感应能力，且各指标变化程度较好地对应了土壤中的铅污染程度，因此这些指标适合作为波叶仙鹤藓检测土壤铅污染的有效参数。但在具体应用时发现，从自然环境中直接采集到的波叶仙鹤藓，其对土壤铅污染的感应能力有所降低，导致检测效果不佳，究其原因是由于其在长期生长过程中已对污染环境产生了一定适应性，应用前需经特殊处理消除其背景适应性，以增强其对铅的敏感度；此外还发现，在利用波叶仙鹤藓进行土壤铅污染现场检测时，其所处环境一般为开放性空间，空气中存在较多形式的飘浮态含铅污染物，如含铅颗粒、含铅粉尘、含铅气溶胶粒子等，地表的含铅粉尘颗粒也极容易散逸到低空大气中，而波叶仙鹤藓由于表面无角质层和蜡质层的覆盖保护、气孔裸露于植物体表(这是苔藓植物结构上区别于高等植物的地方)，故很容易受到上述气态含铅污染物的侵入毒害，这也是一直以来将苔藓植物应用于大气铅污染检测的主要原理和依据。因此在利用波叶仙鹤藓检测土壤铅污染时，很难判定其受到的铅毒害是来自于土壤亦或是大气。上述两方面因素的存在，降低了波叶仙鹤藓对土壤铅污染的检测效果和准确度。基于此，本发明涉及一种人工培植波叶仙鹤藓的技术方法，通过孢子萌发再生新鲜植株的过程，有效地消除了其对原生环境的背景适应性，进一步增强了其对土壤铅污染的敏感度，以此获取可用于高效检测土壤铅污染的植株材料；本发明还涉及一种能有效隔离空气中含铅污染物的方法，使波叶仙鹤藓在检测土壤铅污染时，所受到的铅毒全部来自于土壤中，进一步增强了波叶仙鹤藓检测土壤铅污染的精确度和可行性。本发明规范了苔藓植物检测环境污染的技术标准，具有极高的应用价值和推广前景。
本发明的具体的步骤如下：
植物材料的培植获得过程：
①制备孢子悬液：采集孢子生长期已成熟的波叶仙鹤藓植株的孢子体若干，放于石英研钵中，加入少许液氮后，轻轻研磨至孢子体的苞蒴完全破裂，使内藏的孢子散出，加入蒸馏水反复冲洗研钵，将洗液一并通过网孔内径为1mm的不锈钢滤网进行过滤，滤掉大部分的苞蒴残体，从而获得孢子悬液；
②制备生长基质：以体积比为1︰1的洁净砂质土壤和植物残体发酵液(以花卉沤制肥料代替)为基质配方，充分混合后作为波叶仙鹤藓生长基质，该基质具有质地疏松、有机质含量丰富、保湿性强、透气性好等特点，适合苔藓植物生长。将制备好的生长基质平铺于直径35cm、高6cm的聚乙烯浅盘中，基质厚度为5cm。
③设置培养条件：将孢子悬液均匀喷洒于培养基质中，放置于人工光照气候培养箱内，初始培养温度设置为22℃～26℃，光照强度设置为2500Lux/10h(该时期模拟出苗前四五月份的野外环境)，每日喷洒1/6浓度的Hogl and营养液300-400mL/盘，使基质湿度保持在70％～80％；20～30d后波叶仙鹤藓幼苗开始长出，此时将培养温度设置为32℃～37℃，光照强度设置为5000Lux/14h(该时期模拟出苗后六七月份的野外环境)；出苗后40～50d即进入孢子生长阶段，将该时期的植株作为土壤铅污染的检测材料。
④双层隔离式吸污防尘罩的设计和使用：
本发明涉及的防尘设备在不对波叶仙鹤藓的生长、发育及生理状况造成任何影响的前提下，高效率地隔离屏蔽空气中含铅污染物与植物体的接触，尽可能减少空气污染对植物体的影响，从而提升波叶仙鹤藓对土壤铅污染的检测效果和质量。该产品的设计过程和使用方法是：主要包含一套类似圆锥体形状的支撑支架，由一大一小组成(图1表示该设备的纵切面)，实线表示套在外面的大支架为外架1，虚线表示里面的小支架为内架2；支架制作材料可由铁丝或其他易弯曲的材料制成，支架搭建应尽量简单，圆锥面上仅由4根铁丝(或其他材料)连接顶部和底部圆环即可；两套支架周身用食品保鲜膜(或其他薄而透明的材料)包裹，且两支架底部之间的部分(图中灰色区域所示)亦用膜材料连封，作为活性炭的承载面；内支架底部中空不封闭，便于倒扣植物体；内外两支架的周身包裹膜上分别留有孔洞，外孔4居下，孔径稍大，内孔3居上，孔径稍小；两圆锥支架的尺寸大小依实际需要而定。使用时，在连接两支架底部之间的承载面上放置一层活性炭层5，再将该支架整体倒扣于波叶仙鹤藓植物体上即可。
本发明涉及的防尘设备整体设计成圆锥体形状，上部面积小、下部面积大，一方面最大限度地减少了对空气中含铅粉尘颗粒的截留面积，另一方面有利于该产品在使用过程中的稳固性、不易倒伏；支架搭建简单、透明薄膜包裹的理由是尽量减少光照遮挡物，既保证了与空气隔离，又不影响透光效率，从而使苔藓植物正常进行光合作用；内外膜上留有孔洞是为了保证与外界环境的气体交换畅通，外膜孔方位偏下、内膜孔方位偏上则是为了阻挡那部分从外孔飘逸进入的含铅粉尘颗粒，使其不再向上通过内膜孔进入到内膜空间从而与植物体接触；从外膜孔进入的含铅粉尘颗粒，基本上可全部被位于两支架之间的底部承载面上的活性炭所吸附。综上，该双层隔离式吸污防尘罩产品的使用，可最大限度地去除空气中含铅污染物对波叶仙鹤藓的影响，且整个产品制作过程简单、耗材小、造价低、使用方便，可重复利用，对环境无任何影响，因此可大量用于科研实践及辅助相关部门开展检测工作。
具体检测时，取上述所培植获得的波叶仙鹤藓植株，移植于待检测土壤中，将上述所设计出的双层隔离式吸污防尘罩(已放置活性炭)扣放在波叶仙鹤藓植株上，以生长在无铅污染基质中的植株为对照，观测其外观性状变化，并在第3～5d取样，测定并比较植株的叶绿素含量、可溶性蛋白含量及MDA浓度，依据上述指标变化，综合评价待检测土壤的铅污染程度及生态安全性。
为进一步说明本发明所涉及的植物材料获取方法所产生的效果，以及波叶仙鹤藓对土壤铅污染的敏感性特征，采用了土壤基质中梯度铅胁迫的方式进行了验证。以国内土壤铅污染环境质量背景值为参考，通过人工定量添加硝酸铅溶液的方式，使每份样品土壤中的铅离子浓度分别为35.0mg·kg-1、70.0mg·kg-1、140.0mg·kg-1、280.0mg·kg-1，以零添加的洁净土壤作为对照；分别将本技术培植获得的和直接从野外采集的波叶仙鹤藓植株移植于上述不同铅浓度的土壤基质中，放置于人工气候箱内(人工气候箱内的空气可视为洁净空气，可不考虑含铅粉尘颗粒的影响)；自移植后的第2日起，隔日观测波叶仙鹤藓的生长反应，同时取材并以乙醇提取法测定波叶仙鹤藓的叶绿素含量、考马斯亮蓝法测定植物体可溶性蛋白含量、硫代巴比妥酸法测定植物体丙二醛(MDA)含量，连续进行3次，将数据观测结果汇总于下表1中。由数据可知，与无铅污染的空白对照土壤相比，经本发明培植获得的波叶仙鹤藓，在低铅含量(35.0mg·kg-1为一级土壤含铅量标准)的土壤中即表现出受害症状，生理指标产生显著变化；随着铅胁迫浓度增加和时间延长，植株受害程度加深，受害症状愈加明显；当铅浓度接近三级土壤含铅量标准时(280.0mg·kg-1)，波叶仙鹤藓达到耐受限值，植株枯萎死亡，由此可见，波叶仙鹤藓对土壤铅污染敏感性极强，可作为检测土壤铅污染的理想材料。同时也发现，未经本发明技术过程培植的波叶仙鹤藓植株(直接从野外环境中采集获得)作检测材料时，在铅污染胁迫下与空白对照相比，其各项指标测定结果之间的变化差异程度减小，说明从野外直接采集的植株对土壤铅污染的敏感度有所降低。其原因在于，自然环境中的波叶仙鹤藓在长期的生长过程中，已对野外环境产生了一定的污染适应性，这在某种程度上降低了其对土壤铅污染的敏感度，而通过本发明所涉及的孢子培植过程，从孢子期(即为该植物的种子)开始即脱离了原有的生长环境，消除了其背景适应性，而最大限度地保留了对铅污染的敏感性特征，因此更适宜作为土壤铅污染的检测材料。
表1波叶仙鹤藓对土壤铅污染的敏感性特征分析
叶绿素与可溶性蛋白可作为植物生长健康状况的评价指标，含量值越高说明植物生长状况越好；丙二醛是植物在受到逆境胁迫时产生的物质，含量值越大说明植物受害程度越高。通过上表1中对几种敏感性指标的检测对比，可清楚地看出，经过本发明技术所培植获得的波叶仙鹤藓植株材料，在检测性能上明显优于不经培植过程而直接采集获得的植株。
为进一步验证本发明所涉及的防尘罩的效果，采取了野外现场校验的方式，将波叶仙鹤藓植株分为两份，分别栽培于相同的无铅污染土壤基质中，其中一份采用防尘罩遮盖，另一份未进行遮盖，同时放置于当地一家中型火电厂排气囱附近的地面上，每天定时到现场观测波叶仙鹤藓外观生长状况及反应，放置4d后取回，无菌水清洗植物体后，分别采用乙醇提取法测定波叶仙鹤藓的叶绿素含量、考马斯亮蓝法测定植物体可溶性蛋白含量、石墨炉原子吸收分光光度法测定植物材料中铅元素的含量，测定结果如下表2所示。从表中测定结果可见，所研制防尘罩较好地隔离了工业污染区空气中的重金属粒子，从而对波叶仙鹤藓起到保护作用；不使用防尘罩而受到空气污染物毒害的波叶仙鹤藓植株，其叶绿素含量、可溶性蛋白含量有显著下降(两项指标分别相比使用防尘罩遮盖的植株下降了31.6％和34.4％)，与植物体受害症状相符合；最具说明性的是波叶仙鹤藓对铅元素的吸收富集含量，使用防尘罩后，有效地阻碍了植物体对空气中铅的吸收，而未使用防尘罩的植株，其铅吸收浓度高达17.95mg·kg-1，是使用防尘罩植株的28.5倍。由此可见，在利用波叶仙鹤藓进行土壤铅污染检测时，该防尘罩设备具有较好的防尘吸污效果，可高效地排除空气中铅污染物的干扰和影响。
表2防尘罩对空气铅污染的隔离效果及其对波叶仙鹤藓生长的保护作用
通过分析上表2的实施效果可知，本发明所涉及的防尘罩有效地隔离了大气中铅等污染物质的影响，较好地保护了植物生长过程。
综合上述两则实施例可见，采用本发明培植获得的波叶仙鹤藓对土壤铅污染具有极高的敏感性特征，双层隔离式吸污防尘罩可有效排除空气中铅的影响，二者相互配合，可实现波叶仙鹤藓对土壤铅污染高精准度地检测。
以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。