一枝蒿提取物的质量控制方法与流程

本发明涉及一种一枝蒿提取物的质量控制方法，属于民族医药技术领域。

背景技术：

菊科(Compositae)植物一枝蒿(Artemisia rupestris L.)，全草入药。维吾尔语称“一孜乎艾曼尼”，哈萨克语称“一孜乎”，在新疆民间用药历史悠久。有清热解毒，消食健胃，利胆，解蛇毒之功效。用于消化不良，腹胃胀痛，肝炎，荨麻疹，蛇咬伤，感冒发烧等。主要分布在我国新疆、中亚、欧洲等地。该药材记载于我国清代赵学敏《本草纲目拾遗》，云：“巴里坤出一种药，名一枝蒿，生深山中，无枝叶，一枝茁土，气味如蒿，四月间牧马卒驱马入山，收草携归，有贩至兰州货卖者”。自古以来新疆流传着“家有一枝蒿，百病都除掉”的民间谚语。

一枝蒿全草中含有倍半萜类、黄酮类、氨基酸类、苷类、多糖类、挥发油、多肽和生物碱等多种化合物。从一枝蒿中分离得到的黄酮类化合物主要有木犀草素、紫花牡荆素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖甙、蒙花甙、日本椴苷、金腰素乙、洋艾素、洋槐苷、槲皮素、田蓟苷、木犀草素-7-O-葡萄糖、芦丁、异山萘甲黄素、岳桦素等。

目前一枝蒿中总黄酮主要以芦丁为对照品，比色法进行测定。蒙花苷为一枝蒿中主要的黄酮类成分，但以蒙花苷为对照品，对一枝蒿进行含量测定方法至今未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种一枝蒿提取物的质量控制方法，该方法采用紫外分光光度法，以蒙花苷为对照品，测定一枝蒿提取物中总黄酮的含量。采用高效液相法对蒙花苷进行含量测定。本发明提供的质量控制方法，具有良好准确性、稳定性和重复性，能够有效地控制含一枝蒿提取物的质量，可以应用于大工业生产中。

本发明所述的一种一枝蒿提取物的质量控制方法，该控制方法采用紫外分光光度法，高效液相法进行一枝蒿提取物中总黄酮和蒙花苷的含量测定，具体操作按下列步骤进行：

紫外分光光度法：

a.对照品溶液的制备：

取蒙花苷精密称定，加甲醇制成每1mL含蒙花苷20-30μg的溶液，备用；

b.标准曲线的制备：

量取对照品溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL分别置10mL量瓶中，用甲醇稀释到10mL，以甲醇试剂为空白，于紫外分光光度法在320-330nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

c.供试品溶液的制备与测定法：

取一枝蒿提取物3.0-10.0mg，精密称定，置10mL量瓶中，用甲醇超声提取20分钟，室温定容至10mL，从中再精密取0.5mL置10mL量瓶中再用甲醇稀释到10mL，测定其吸光度，根据吸光度值，从回归方程中求出供试品中一枝蒿提取物总黄酮的含量；

高效液相法：

d、色谱条件与系统适应性：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.2％甲酸溶液为流动相B，按时间0，8，25，50，55，60；流动相A 10，13.5，19,29,80,80；流动相B 90，86.5，81，71，20，20进行梯度洗脱，流速：1mL/min，检测波长：320-330nm，柱温：30℃，进样量：10μL，理论塔板数按一蒙花苷峰计算应不低于4000；

e、对照品溶液的制备：

取蒙花苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含蒙花苷20-30μg的溶液；

f、供试品溶液的制备：

取一枝蒿提取物20-50mg，精密称定，置25mL量瓶中，加入甲醇20mL超声提取10分钟，室温定容至25mL，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得；

d.测定法：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μL，分别注入液相色谱仪，即得到一枝蒿提取物蒙花苷含量。

本发明所述的一枝蒿提取物的质量控制方法，该控制方法中一枝蒿提取物制备方法为：

将一枝蒿药材，加入浓度为70％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩，加水稀释，离心，再将所得滤液上大孔树脂，分别用水、浓度为30％乙醇、浓度为70％乙醇进行洗脱，合并30％乙醇和70％乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得一枝蒿提取物。

本发明所述的一枝蒿提取物的质量控制方法，该控制方法中蒙花苷的高效液相含量测定方法的优选为：

a.色谱条件与系统适应性：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.2％甲酸溶液为B，按下表进行梯度洗脱；流速：1mL/min；检测波长：328nm；柱温：30℃，进样量：10μL，理论塔板数按一蒙花苷峰计算应不低于4000；

b.对照品溶液的制备：取蒙花苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含蒙花苷25μg的溶液，即得。

c.取一枝蒿提取物20-50mg，精密称定，置25mL量瓶中，加入甲醇20mL超声提取10分钟，室温定容至25mL，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得；

d.测定法：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μL，分别注入液相色谱仪，即得到一枝蒿提取物蒙花苷含量。

对本发明一枝蒿提取物的质量控制方法的研究与说明：

一、对总黄酮含量测定的研究说明：

1、系统适应性研究：

(1)仪器与试药：紫外分光光度计，蒙花苷标准品；水为超纯水；其他试剂均为分析纯；

(2)最大吸收波长的确定：

精密称取一枝蒿提取物10mg，置10mL量瓶中，水10mL溶解，超声提取20分钟，室温定容至10mL，以水试剂为空白，于200-400nm之间扫描，其最大吸收波长为328nm，见附图1和2，故总黄酮测定波长为328nm；

(3)供试品溶液的制备：

取一枝蒿提取物6.0mg，精密称定，置10mL量瓶中，用甲醇超声提取20分钟，室温定容至10mL，从中再精密取0.5mL置10mL量瓶中再用甲醇稀释到10mL，测定其吸光度，根据吸光度值，从回归方程中求出供试品中总黄酮的含量；

(4)标准曲线的制备：

取干燥至恒重的蒙花苷，精密称定，加甲醇制成每1mL含蒙花苷28μg的溶液，精密量取对照品溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL分别置10mL量瓶中，用甲醇稀释到10mL，以甲醇试剂为空白，于紫外分光光度法在328nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1，总黄酮线性方程：Y＝28.982x-0.0043，r＝0.9999，蒙花苷线性范围：0.0056-0.028mg·mL^-1。

表1蒙花苷线性关系结果

2、精密度试验

取同一批次供试品约6mg，精密称定，照供试品溶液的制备项下的方法，连续测定6次，依法测定吸光度，根据吸光度值，从回归方程中求出供试品中一枝蒿提取物总黄酮的含量，并计算RSD值，结果RSD(n＝6)为0.22％，见表2。

表2精密度实验结果

3、稳定性试验

取同一批次供试品约6mg，精密称定，照“供试品溶液的制备”项下方法，依法制备，间隔时间(10min，20min，30min，40min，50min，60min)，在328nm处测定，表明供试品溶液在60min内基本稳定，RSD(n＝7)为1.95％，见表3。

表3稳定性试验结果

4、重复性试验

平行精密称取同一实验室样品，6份，每份6.0mg，精密称定，照“供试品溶液的制备”项下方法，依法制备，在328nm处测定吸光度，计算总黄酮含量，结果RSD(n＝6)为2.43％，见表4。

表4重复性试验结果

5、加样回收率试验

精密称取同批次已知含量(总黄酮标示量为51.10％)的样品约3.0mg，精密称定，共6份，置10mL容量瓶中，按照样品中蒙花苷的量与蒙花苷对照品的量1:1加入蒙花苷对照品，再加入适量的甲醇，使其溶解后，定容至10mL，按供试品溶液制备法制备，按上述方法测定总黄酮含量，计算回收率，结果见表5。

表5总黄酮回收率试验结果

6、样品含量测定

取3批样品，按供试品溶液制备法制备，按上述方法测定总黄酮含量，计算总黄酮含量，结果总黄酮含量平均值为51.21％。

对蒙花苷含量测定的研究说明

1、系统适应性研究

(1)仪器与试药：紫外分光光度计，蒙花苷标准品；水为超纯水；乙腈、甲醇色谱纯；

其他试剂均为分析纯；

(2)色谱条件：

a)流动相的选择：经研究，选择乙腈(A)-0.2％甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱条件见表6

表6梯度洗脱条件

b)测定波长的选择：经紫外光谱扫描，蒙花苷在270nm，328nm处有最大吸收，328nm处基线比较平整，干扰较少，故选择328nm作为检测波长；

c)柱温：30℃

d)系统适用性研究：经研究，在系统实验中蒙花苷峰理论塔板数应不低于4000。

2、供试品溶液、对照品溶液的制备：

(1)供试品溶液：取一枝蒿提取物25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇20mL超声提取(250W，40kHz)20分钟，室温定容至25mL，取适量用0.22μm微孔滤膜过滤，精密吸取10μL，进入液相色谱仪，计算，即得。

(2)对照品溶液的制备

精密称取蒙花苷对照品2.5mg减压干燥至恒重，置于10mL容量瓶中，加甲醇适量超声溶解并定容至10mL，摇匀，即得对照品溶液(每mL含蒙花苷25μg)。

(3)含量测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μL，进入液相色谱仪测定，见附图2,3。

2方法学考察

(1)线性关系和回归方程

标准品溶液的制备：精密称取一枝蒿酮酸对照品3.4mg置于25mL容量瓶中，加甲醇适量溶解并定容至25mL，即得(每mL含一枝蒿酮酸136μg)。从蒙花苷对照品母液中分别精密量取0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8mL置6个不同的10mL量瓶中，用甲醇稀释至10mL，配置6个不同浓度的标准溶液；从中分别取10ul进入液相色谱仪，在选定的色谱条件下进行测定，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。蒙花苷线性方程：Y＝989463X-7841，r＝0.9998，蒙花苷线性范围：0.092-0.552μg。

(2)精密度试验

精密称取同一批次供试品33mg，精密称定，照“供试品溶液的制备”项下的方法，依法测定峰面积，连续测定6次，结果RSD(n＝6)为1.53％，见表7。

表7精密度实验结果

(3)稳定性试验：

取同一批次供试品约33.5mg，精密称定，照“供试品溶液的制备”项下方法，依法制备，分别在0、2、4、6、8、12、24h测定，表明供试品溶液在24h内基本稳定，RSD(n＝8)为2.33％，见表8。

表8稳定性试验结果

(4)重复性试验

取同一批次供试品，6份，精密称定，照“供试品溶液的制备”项下方法，依法制备，按上述方法测定峰积，计算蒙花苷含量，结果RSD(n＝6)为1.98％，见表9。

表9重复性试验结果

(5)加样回收率试验

精密称取同批次已知含量(蒙花苷标示量为1.64％)的样品，共6份，置25mL容量瓶中，按照样品中蒙花苷的量与蒙花苷对照品的量1:1，分别精密加入蒙花苷对照品0.2684mg，按供试品溶液制备法制备，按上述方法测定蒙花苷含量，计算回收率，结果见表10。

表10蒙花苷回收率试验结果

(6)样品含量测定

取不同批号的3批成品样品，按供试品溶液制备法制备，按上述方法测定蒙花苷含量，计算蒙花苷含量，结果蒙花苷含量平均为2.06％。

本发明所述的一枝蒿提取物的质量控制方法相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、一枝蒿中芦丁含量极少，以芦丁为对照品进行总黄酮的测定，不能真实反应一枝蒿提取物的质量。而我们在研究中发现蒙花苷为一枝蒿中主要的黄酮类化合物，以其为对照品，对总黄酮进行含量测定，可以更好的控制一枝蒿提取物的质量。

2、本发明首次提供了一枝蒿提取物中总黄酮和蒙花苷两种成分含量测定的方法，对含有一枝蒿其他制剂的质控标准也有一定的借鉴作用。

3、本发明提供的方法具有良好准确性、稳定性和重复性，可以应用于大工业生产中，是非常好的质量控制方法。

附图说明

附图1为本发明蒙花苷紫外扫描图；

附图2为本发明一枝蒿提取物紫外扫描图；

附图3为本发明蒙花苷对照品高效液相图；

附图4为本发明一枝蒿提取物高效液相图。

具体实施方式

实施例1：

紫外分光光度法对一枝蒿提取物总黄酮的含量测定：

对照品溶液的制备：取蒙花苷精密称定，加甲醇制成每1mL含蒙花苷25μg的溶液；

标准曲线的制备：量取对照品溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL分别置10mL量瓶中，用甲醇稀释到10mL，以相应试剂为空白，于紫外分光光度法在320nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

c.供试品溶液的制备与测定法：

取本品6.0mg，精密称定，置10mL量瓶中，用甲醇超声提取20分钟，室温定容至10mL，从中再精密取0.5mL置10mL量瓶中再用甲醇稀释到10mL，测定其吸光度，根据吸光度值，从回归方程中求出供试品中一枝蒿提取物总黄酮的含量，计算得一枝蒿提取物总黄酮含量为51％。

实施例2：

紫外分光光度法对一枝蒿提取物总黄酮的含量测定：

对照品溶液的制备：取蒙花苷精密称定，加甲醇制成每1mL含蒙花苷28μg的溶液；

标准曲线的制备：量取对照品溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL分别置10mL量瓶中，用甲醇稀释到10mL，以甲醇试剂为空白，于紫外分光光度法在328nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备与测定法：取一枝蒿提取物8.0mg，精密称定，置10mL量瓶中，用甲醇超声提取20分钟，室温定容至10mL，从中再精密取0.5mL置10mL量瓶中再用甲醇稀释到10mL，测定其吸光度，根据吸光度值，从回归方程中求出供试品中一枝蒿提取物总黄酮的含量，计算得一枝蒿提取物总黄酮含量为55％。

实施例3：

高效液相法对一枝蒿提取物蒙花苷的含量测定：

色谱条件与系统适应性：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.2％甲酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速：1mL/min；检测波长：324nm；柱温：30℃，进样量：10μL，理论塔板数按一蒙花苷峰计算应不低于4000；

对照品溶液的制备：取蒙花苷对照品精密称定，加入甲醇制成每1mL含蒙花苷25μg的溶液；

供试品溶液的制备：取一枝蒿提取物30mg，精密称定，置25mL量瓶中，加入甲醇20mL超声提取10分钟，室温定容至25mL，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μL，分别注入液相色谱仪，计算得一枝蒿提取物中蒙花苷栏量为1.8％。

实施例4

高效液相法对一枝蒿提取物蒙花苷的含量测定：

色谱条件与系统适应性：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.2％甲酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速：1mL/min；检测波长：328nm；柱温：30℃，进样量：10μL。理论塔板数按一蒙花苷峰计算应不低于4000；

对照品溶液的制备：取蒙花苷对照品精密称定，加入甲醇制成每1mL含蒙花苷30μg的溶液；

供试品溶液的制备：取一枝蒿提取物40mg，精密称定，置25mL量瓶中，加入甲醇20mL超声提取10分钟，室温定容至25mL，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μL，分别注入液相色谱仪，计算得一枝蒿提取物中蒙花苷栏量为2.1％。