一种证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法。

背景技术：

外周血淋巴细胞根据生物学功能和细胞表面抗原表达分为3个群：T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)和NK淋巴细胞【自然杀伤细胞(natural killer)，CD3-CD16+和/或CD56+】。T细胞又分为辅助T细胞(CD3+CD4+)和抑制T细胞(CD3+CD8+)。淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，它总体反应机体当前的免疫免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病，如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等，分析发病机制，观察疗效及检测预后有重要意义。临床上发现间隙连接蛋白40基因Cx40(-44和+71位点)多态性与原发性高血压(EH)有一定的相关性。

目前，现有技术中，还没有证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种操作简便、成本低廉的证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法。

其具体技术方案为：

一种证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法，包括以下步骤：

步骤1、动物血压测量

使用全自动大小鼠无创血压测量仪检测WKY大鼠、SHR和硫化氢干预组三组大鼠尾动脉收缩压。测量时先预热，将血压计的充气尾套套在大鼠尾根部，待大鼠安静后，重复测量血压3次，结果取其平均值。

步骤2、大鼠外周血淋巴细胞悬液制备

将大鼠麻醉状态下，采集腹主动脉外周血，置于10g/LEDTA真空采血管内。外周血进行离心，将血清和血细胞分离开，在血细胞中加至少一倍的PBS溶液，充分混匀，将稀释后的血细胞轻铺于等量淋巴细胞分离液上，1500r、30min，抽取云雾状于1.5ml离心管中，1800r、6min，弃上清，PBS溶液重悬，备用。

步骤3、外周血T淋巴细胞亚群和Cx40、Cx43的检测

取流式专用染色管，各组大鼠按照顺序分别标记为空白、测定管和同型对照管，各管分别加入相应流式抗体，依据抗体说明书调整抗体终浓度，并设立阴性对照。室温避光孵育30min，上机使用CELLQuest软件进行检测。标记CD4-APC和CD8-PE的管中加入固定剂120μL,4℃孵育30min，再用破膜buffer破膜，根据说明书参考浓度加入山羊抗大鼠Cx40抗体和FITC标记的兔抗山羊IgG，FITC同型对照，和小鼠抗大鼠Cx43抗体和FITC标记的山羊抗小鼠IgG，FITC同型对照，37℃孵育30min，上机使用CELLQuest软件进行检测。将流式细胞仪调整至最佳工作状态，以FSC/SSC设门并排除死细胞和细胞碎片，根据同型对照调整好实验参数后再进行样本测定，首先设门于CD3+淋巴细胞，然后设门于CD4+和CD8+细胞，破膜后的淋巴细胞设门于CD4+和CD8+，然后设门于Cx40+、Cx43+细胞，所有样本均在2h内完成对细胞的检测，每管检测20000个细胞，计算机读出测定值，最后对收集的数据进行分析。

进一步，步骤3中所述的相应流式抗体具体为：CD3-FITC，FITC同型对照；CD4-APC，APC同型对照；CD8-PE，PE同型对照；山羊抗大鼠Cx40抗体和FITC标记的兔抗山羊IgG，FITC同型对照；小鼠抗大鼠Cx43抗体和FITC标记的山羊抗小鼠IgG，FITC同型对照。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明首次公开了硫化氢与T淋巴细胞上连接蛋白的关系，提示硫化氢通过影响免疫细胞间的缝隙连接通讯，调节炎症因子的释放，从而在改善高血压炎症所致的靶器官损伤中发挥了重要作用。

附图说明

图1是本发明证明硫化氢与缝隙连接关系的实验方法的流程图；

图2是三组大鼠动脉血压的比较；

图3是三组大鼠肾脏组织病理学改变(×400)；

图4是三组大鼠外周血T淋巴细胞亚群频率；其中，图4A：CD3+表达频率；图4B：CD8+表达频率；图4C：CD4+表达频率；图4D：CD4+CD25+表达频率

图5是三组大鼠外周血CD4⁺T Cx40细胞的表达；

图6是三组大鼠外周血CD4⁺Cx43细胞的表达；

图7是三组大鼠外周血CD8⁺T Cx40细胞的表达；

图8是三组大鼠外周血CD8⁺T Cx43细胞的表达。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

分组：WKY组：正常Wistar京都(Wistar-Kyoto,WKY)大鼠，雌雄不拘，9周龄，每日腹腔注射与SHR+H2S组等量生理盐水，持续8周。

SHR组：自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)，雌雄不拘，9周龄，每日腹腔注射与SHR+H2S组等量生理盐水，持续8周。

NaHS处理组：SHR，雌雄不拘，9周龄，每日腹腔注射56μmol/kg体重的NaHS(H₂S的供体)，持续8周。

1动物血压测量使用全自动大小鼠无创血压测量仪检测各组大鼠尾动脉收缩压。测量时先预热，将血压计的充气尾套套在大鼠尾根部，待大鼠安静后，重复测量血压3次，结果取其平均值。

2大鼠外周血淋巴细胞悬液制备将大鼠麻醉状态下，采集腹主动脉外周血，置于10g/LEDTA真空采血管内。外周血进行离心，将血清和血细胞分离开，在血细胞中加至少一倍的PBS溶液，充分混匀，将稀释后的血细胞轻铺于等量淋巴细胞分离液上，1500r、30min，抽取云雾状于1.5ml离心管中，1800r、6min，弃上清，PBS溶液重悬，备用。

3外周血T淋巴细胞亚群和Cx40、Cx43的检测取流式专用染色管，各组大鼠按照顺序分别标记为空白、测定管和同型对照管，各管分别加入相应流式抗体，依据抗体说明书调整抗体终浓度，并设立阴性对照。室温避光孵育30min，上机使用CELLQuest软件进行检测。标记CD4-APC和CD8-PE的管中加入固定剂120μL,4℃孵育30min，再用破膜buffer破膜，根据说明书参考浓度加入山羊抗大鼠Cx40抗体和FITC标记的兔抗山羊IgG，FITC同型对照，和小鼠抗大鼠Cx43抗体和FITC标记的山羊抗小鼠IgG，FITC同型对照，37℃孵育30min，上机使用CELLQuest软件进行检测。将流式细胞仪调整至最佳工作状态，以FSC/SSC设门并排除死细胞和细胞碎片，根据同型对照调整好实验参数后再进行样本测定，首先设门于CD3+淋巴细胞，然后设门于CD4+和CD8+细胞，破膜后的淋巴细胞设门于CD4+和CD8+，然后设门于Cx40+、Cx43+细胞，所有样本均在2h内完成对细胞的检测，每管检测20000个细胞，计算机读出测定值，最后对收集的数据进行分析。

实验结果：

(1)WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组大鼠血压的比较于8周龄开始处理各组大鼠，持续9周后，测量各组大鼠收缩压，结果表明：SHR组大鼠收缩压显著高于WKY大鼠组(P<0.01)，NaHS干预组大鼠收缩压显著高于SHR组大鼠，图2。

(2)HE染色发现，可见WKY大鼠组大鼠肾小球大小规则，肾小管上皮细胞完整，排列整齐，肾间质无病变；SHR组肾脏血管壁增厚，肾小球出现轻度萎缩，小管上皮细胞出现空泡及颗粒变性，肾间质被炎性细胞浸润；NaHS干预组可见肾小球相比SHR组的萎缩有所改善，肾小管上皮细胞的空泡及颗粒变性也相对于SHR组较少，肾间质炎性浸润程度也相对于SHR组较少，图3。

(3)流式细胞术检测WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组大鼠外周血中淋巴细胞亚群的表达频率，结果显示，结果显示，WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组外周血CD4⁺T淋巴细胞百分比为(67.28±1.31)％、(69.31±0.98)％和(67.80±0.38)％，无统计学差异；WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组外周血CD8⁺T淋巴细胞百分比为(34.62±1.42)％、(33.40±0.85)％和(34.63±0.62)％，无统计学差异；WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组外周血CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞百分比的比值为2.01±0.14、2.09±0.08和1.96±0.04，无统计学差异；WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组外周血CD4⁺CD25⁺T淋巴细胞百分比为(7.72±0.50)％、(5.94±0.33)％和(6.49±0.35)％，SHR组vs WKY大鼠组降低，有统计学差异(P<0.05)，SHR组vs NaHS干预组升高，无统计学差异，图4。

(4)通过流式细胞术测得WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组大鼠外周血T淋巴细胞CD4+上Cx40的表达频率分别为(5.20±1.69)％、(18.60±2.78)％、(2.90±0.80)％，SHR组较WKY大鼠组表达上升，差异有统计学意义(P<0.01)，NaHS干预组较SHR组表达下降，差异有统计学意义(P<0.01)，图5。

(5)通过流式细胞术测得WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组大鼠外周血T淋巴细胞CD4+上Cx43的表达频率分别为(0.21±0.06)％、(0.25±0.06)％、(0.23±0.06)％，SHR组较WKY大鼠组表达上升，差异无统计学意义，NaHS干预组较SHR组表达下降，差异无统计学意义，图6。

(6)通过流式细胞术测得WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组大鼠外周血T淋巴细胞CD8+上Cx40的表达频率分别为(1.98±0.32)％、(0.85±0.25)％、(1.29±0.25)％，SHR组较WKY大鼠组表达下降，差异有统计学意义(P<0.01)，NaHS干预组较SHR组表达上升，差异无统计学意义，图7。

(7)通过流式细胞术测得WKY大鼠组、SHR组和NaHS干预组大鼠外周血T淋巴细胞CD8+上Cx43的表达频率分别为(0.14±0.01)％、(0.26±0.11)％、(0.24±0.08)％，SHR组较WKY大鼠组表达上升，差异无统计学意义，NaHS干预组较SHR组表达下降，差异无统计学意义，图8。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。