一种流式细胞仪散射光检测装置的制作方法

本发明涉及流式细胞仪的散射光检测领域，特别涉及一种流式细胞仪散射光检测装置。

背景技术：

流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞仪对悬液中处于高速、直线流动的单细胞或其他颗粒，通过检测散射光信号和(或)标记的荧光信号，实现高速逐一的多参数定量分析。在细胞生物学、细胞周期动力学、免疫学、血液学及肿瘤学等领域具有广泛的应用。

散射光不受细胞样品制备技术(如染色)的影响,被称为细胞的自身物理特性,反应了细胞的大小和内部结构。激光照射细胞微粒产生散射光信号，细胞在流动室中进入探测区域,经激光照射在空间360°立体角发生散射。光散射的强弱跟细胞的大小、形状、质膜、内部结构等信息有关。细胞的流式分析中主要看前向角散射(fsc)和侧向角散射(ssc)两种光散射信号。由于细胞或微粒的流速非常快，散射光信号变化频率非常快，为了获得尽量多的不失真信息，要求散射光检测系统具有很高的工作带宽；微瓦级的散射光信号经光电转换后形成微弱的电信号，如何有效的获取该信号对于实现精密测量至关重要。

因此，需要一种流式细胞仪的散射光检测装置，能够有效的获取微瓦级的散射光信号，同时低噪声、宽动态范围，以实现对散射光的测量。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种低噪声、宽动态范围散射光检测装置，实现对散射光的测量，该装置包括散射光的采集系统和散射光检测电路系统；

所述散射光的采集系统，包括：

488nm的固体激光器，用于提供激光光源；

光束整形镜片组，包括两块圆柱形透镜，用于产生聚焦光斑；

流动室；

光阑；

收集物镜；

滤光片；

所述散射光检测电路系统，包括：

光电探测器，即光电二极管，用于将光信号转换为电信号，其输出信号既可以作为电压信号检测，也可以作为电流信号检测；

i/v转换电路，包括运算放大器、基线恢复电路和旁路反馈电路cf，所述运算放大器包括跨阻放大器；所述旁路反馈电容cf，用于消除电路潜在的谐振；

信号调理电路，包括次级放大电路即反相放大电路，由于i/v输出信号只有毫伏量级，需要工作稳定的低噪声放大电路将信号进一步放大至伏特级，以便与后续的控制和运算系统对接；所述反相放大电路还包括电容c2与反馈电阻r3，所述电容c2与反馈电阻r3并联连接，构成一个低通滤波器起到了抑制高频干扰的作用；

488nm的固体激光器激光发出的光经两块圆柱形透镜纵向和横向整形压缩，形成椭圆形光斑，聚焦在流动室中央。待测细胞以分离的单颗粒形式通过流动室时，被聚焦光斑照射，发生衍射散射，产生散射光。

利用光电二极管将微弱的散射光信号转换为电信号。然后，利用跨阻放大器以及基线恢复电路对信号进行放大、滤波。

散射光强跟待测细胞颗粒的截面积呈正相关，颗粒以速度v向下运动，当颗粒部分进入椭圆光斑时，形成散射光较弱，随着颗粒的移动，形成的散射光逐渐增强，当颗粒被光斑完全照射时，形成的散射光最强，细胞完全离开椭圆光斑时在光电探测器上形成一个时间脉冲脉冲宽度为(l+2r)/v，其中，l为椭圆光斑短轴长度，r为细胞半径。t时刻散射光强度为：

(1)式中，x为细胞距位置原点(l＝0)的距离。

所述光电探测器的输出信号作为电流信号检测，电流信号的检测拥有更好的线性关系、偏移以及带宽性能，而大多数电子设备接收的是电压信号而不是电流信号，则需要进行i/v转换，并且i/v输出信号只有毫伏量级，需要工作稳定的低噪声放大电路(即信号调理电路)将信号进一步放大至伏特级，以便与后续的控制和运算系统对接。

所述i/v转换电路，包括运算放大器、基线恢复电路和旁路反馈电路cf，所述运算放大器采用跨阻放大器，运算放大器的选择需要考虑的一个因素是增益带宽积，运放的增益带宽积由反馈电阻rf、总输入电容ci和i/v转换部分信号带宽f1共同决定，其计算公式由(2)式给出。

ft＝2πrfcif1²(2)

(2)式中：ft为运放的最小单位增益带宽(运放实际的增益带宽积必须大于ft)，rf为反馈电阻，ci为运放求和点的总电容(运放共模输入电容cm+运放差模输入电容cd+光电二极管结电容cs)。

所述i/v转换电路中，旁路反馈电容cf的增加可消除电路潜在的谐振，cf的计算公式由(3)式给出。

(4)式中：fu为运放的增益带宽积。

所述信号调理电路，采用控制简单、动态范围大和线性度好的反相放大电路作为次级放大电路，在进行转换的同时还可对信号进行放大，电路的放大增益g＝-r3/r2，增加一个电容c2与反馈电阻r3并联构成一个低通滤波器起到了抑制高频干扰的作用。u3b、cr2、cr3、r10构成了一个精密整流电路，可以使非线性降低到非常小的数值。

本发明的散射光检测电路的噪声主要决定于i/v转换电路引入的噪声，对于i/v转换电路，主要的输出噪声源是运算放大器的输入电压噪声和反馈电阻噪声，输入运算放大器的输入电流噪声可忽略不计，rf的电阻热噪声在整个电路的输出等效噪声：

(4)式中，t表示绝对温度(单位k)；k表示玻尔兹曼常数(1.38×10-23j/k)；fh整个电路的信号带宽；g表示信号调理电路的增益。

运算放大器的输入电压噪声在整个电路的输出等效噪声：

(5)式中，vn表示运算放大器的输入电压噪声。

折合到输出总均方根噪声：

本发明各级电路模块的信号带宽，通过对整个电路的信号带宽进行评估，根据多级放大电路频响的上限截止频率计算公式：

(4)式中：fh为整个检测电路的带宽，f1、f2、fn为各级电路的带宽。

宽动态范围与低噪声是相近的，噪声小，则动态范围大；噪声大，便占据了很多空间，则有用信号的动态范围就小。

综上可知，本发明的有益效果在于提供一种流式细胞仪散射光检测装置，能够有效的获取微瓦级的散射光信号，在设计电路时，通过控制相关参数，实现低噪声、宽动态范围，从而实现对散射光的测量。

应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本发明所要求保护内容的限制。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1示意性示出散射光的采集系统。

图2示意性示出激光散射脉冲产生机理，其中，l为椭圆光斑短轴长度，r为细胞半径，v为颗粒运动速度，t为时间。

图3示意性示出散射光检测电路系统框图。

图4示意性示出i/v转换等效电路，rf为反馈电阻。

图5示意性示出散射光检测电路图，c2为电容，r3为反馈电阻。

图6示意性示出散射光采集系统实物图。

图7示意性示出激光器的功率为20mw，经过i/v转换后输出的信号波形。

图8示意性示出激光器的功率为20mw，经过调理电路后输出的信号波形。

图9散射光检测电路的输出信号。

具体实施方式

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在附图中，相同的附图标记代表相同或类似的部件，或者相同或类似的步骤。

本实施例为对脉宽为4μs左右的散射光脉冲信号进行处理。

首先，确定电路中主要的元器件：光电二极管选用滨松公司的s1336-8bq型号，运算放大器全部选用adi公司的ad8065型号，反馈电阻rf取8.2kω，cf取10pf，c2取22nf，r2取4.99kω，r3取1kω，r4取15kω，c3取4.3pf、c4取13pf，r5、r6、r7、r8取4.99kω，r10、r11取100ω，cr1、cr2、cr3选in4002。

图1所示为散射光的采集系统，包括：488nm的固体激光器，光束整形镜片组，流动室，光阑，收集物镜，滤光片；其中光束整形镜片组包括两块圆柱形透镜；图6所示为散射光采集系统实物图，由激光、光束整形结构、流动室、前向散射光检测板组成。

激光器采用coboltlmd488型号半导体激光器，整形透镜为焦距为20mm的两块柱形透镜，待测微粒的半径r＝10um，电源采用rigol公司的dp832系列可编程直流电源，示波器采用agilenttechnologies公司的dso-x2004a型号。

散射光强跟待测细胞颗粒的截面积呈正相关，产生机理如图2所示。颗粒以速度v向下运动，当颗粒部分进入椭圆光斑时，形成散射光较弱，如图2(a)所示，随着颗粒的移动，形成的散射光逐渐增强，当颗粒被光斑完全照射时，形成的散射光最强，如图2(b)所示，细胞完全离开椭圆光斑时在光电探测器上形成一个时间脉冲如图2(c)所示，脉冲宽度为(l+2r)/v，其中，l为椭圆光斑短轴长度，r为细胞半径。t时刻散射光强度为：

(1)式中，x为细胞距位置原点(l＝0)的距离。

参见图3-图6,为散射光检测电路系统，图3所示为散射光检测电路系统框图，其中光电二极管的输出信号作为电流信号检测，电流信号的检测拥有更好的线性关系、偏移以及带宽性能，而大多数电子设备接收的是电压信号而不是电流信号，则需要进行i/v转换，并且i/v输出信号只有毫伏量级，需要工作稳定的低噪声放大电路(即信号调理电路)将信号进一步放大至伏特级，以便与后续的控制和运算系统对接。

如图4，所示为i/v转换电路，采用控制简单、动态范围大和线性度好的反相放大电路作为次级放大电路，在进行转换的同时还可对信号进行放大，电路的放大增益g＝-r3/r2，增加一个电容c2与反馈电阻r3并联构成一个低通滤波器起到了抑制高频干扰的作用。u3b、cr2、cr3、r10构成了一个精密整流电路，如图5所示为散射光检测电路图，可以使非线性降低到非常小的数值。反相放大电路中旁路反馈电容cf的增加可消除电路潜在的谐振，cf的计算公式由(3)式给出。

(3)式中：fu为运放的增益带宽积。

所述信号调理电路，包括运算放大器、基线恢复电路和旁路反馈电路cf，所述运算放大器采用跨阻放大器，运放的增益带宽积由反馈电阻rf、总输入电容ci和i/v转换部分信号带宽f1共同决定，其计算公式由(2)式给出。

ft＝2πrfcif1²(2)

(2)式中：ft为运放的最小单位增益带宽(运放实际的增益带宽积必须大于ft)，rf为反馈电阻，ci为运放求和点的总电容(运放共模输入电容cm+运放差模输入电容cd+光电二极管结电容cs)。

下面通过实验数据，将实验结果与理论计算结果进行对比，进一步验证本发明通过合理控制相关参数，可实现实现低噪声和宽动态范围：

如图7所示，为激光器的功率调整为20mw，经过i/v转换后输出的信号波形，利用示波器的反向功能，输出波形显示为正，幅值为340mv，脉宽大约为4us，波形的上升和下降测量值分别为1.385us和1.390us，波形的稳定性以及左右对称度均良好。r＝10um，l＝20um，v＝10m/s，由散射光的产生机理得，得出散射光信号的脉冲时间为t＝4us，实验结果与计算结果相符。

如图8所示，为激光器的功率调整为20mw，经过调理电路后输出的信号波形,其幅值为5.05v，上升和下降的测量值分别为1.396us和1.407us，波形的稳定性以及左右对程度均良好。

根据多级放大电路的原理，本发明散射光检测电路的噪声主要决定于i/v转换电路引入的噪声，对于i/v转换电路而言，主要的输出噪声源是运算放大器的输入电压噪声和反馈电阻噪声，输入运算放大器的输入电流噪声可忽略不计，rf的电阻热噪声在整个电路的输出等效噪声：

(4)式中，t表示绝对温度(单位k)；k表示玻尔兹曼常数(1.38×10-23j/k)；fh整个电路的信号带宽；g表示信号调理电路的增益。

运算放大器的输入电压噪声在整个电路的输出等效噪声：

(5)式中，vn表示运算放大器的输入电压噪声。

折合到输出总均方根噪声：

通过计算得，总输出噪声为3.51mvrms。

从以上噪声分析计算过程中可知：主要的噪声来自于运放的噪声电压，可以选择噪声电压更低的运放来降低噪声电压；其次，来自i/v转换电路中的反馈电阻rf以及信号调理电路中的电阻r3的噪声，在满足带宽要求的前提下，尽量增大rf，减小r3；最后，系统带宽对噪声的影响大，随着系统带宽的增大，噪声会显著提升，系统带宽控制在低噪声设计中非常重要，系统带宽能满足系统需求即可，不能太大。

(2)电路的带宽可以用上升时间这一参数确定。利用信号发生器和激光二极管产生阶跃信号作为输入信号，散射光检测电路的输出信号如图9所示，其上升时间为302ns，根据公式(7)得出，fbw＝1.16mhz。

(7)式中，tr表示上升时间，fbw表示整个电路的信号带宽。

分析各级电路模块的信号带宽，可对整个电路的信号带宽进行评估，根据多及放大电路频响的上限截止频率计算公式：

(8)式中：fh为整个检测电路的带宽，f1、f2、fn为各级电路的带宽。

计算整个散射光检测电路的信号上限截止频率为1.2mhz，与实验结果近似相一致，误差为3.33％；下限截止频率为1.5khz，电路带宽为1.5khz-1.2mhz，即为宽动态范围，是满足光学信号的设计要求的。

综上，本发明提供一种流式细胞仪散射光检测装置，能够有效的获取微瓦级的散射光信号，在设计电路时，能够通过控制相关参数，实现低噪声、宽动态范围，从而实现对散射光的测量。

结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。