一种注射用赖氨匹林中赖氨酸含量的检测方法及应用与流程

本发明涉及一种赖氨酸的检测方法及应用，具体的说涉及一种通过HPLC检测药品中赖氨酸的检测方法和应用。
背景技术：
：药物赖氨匹林为阿司匹林和赖氨酸复盐，是非甾体抗炎解热镇痛药，具有解热、镇痛、抗炎作用。其临床应用剂型为注射用赖氨匹林。《中国药典》2015版新增了“注射用赖氨匹林”品种，其中“含量测定”项下规定赖氨酸和阿司匹林两部分分别测定含量。但是药典中对赖氨酸的含量测定仅记载了“用适宜的氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离测定”，并未记载具体的检测条件。目前通过高效液相色谱法(HPLC)检测氨基酸含量主要是采用衍生化法，例如以邻苯二甲醛(OPA)、2，4-二硝基氯苯(CDNB)、异硫氰酸苯酯(PITC)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)为衍生化试剂，对氨基酸含量进行测定。但是目前已知的现有技术中的衍生化反应及色谱条件都不能适用于注射用赖氨匹林中赖氨酸的含量测定，通过现有方法检测到的衍生化物不止一个，专属性很差。高效液相色谱法(HPLC)虽然是常用的检测分析方法，但是对于特定的被测物，需要经过大量的实验摸索，才能筛选出色谱条件中各种参数的最佳选择。尤其是在对药品赖氨匹林的检测中，因为有阿司匹林和赖氨酸两种成分，在常规反相色谱条件下出峰快，相互干扰，很难直接分离测定。因此，开发一种赖氨酸的检测方法，能够准确、可靠的检测注射用赖氨匹林中的赖氨酸含量，作为药品质量标准，非常必要。技术实现要素：本发明提供一种赖氨酸的高效液相色谱检测方法，其色谱条件为：用磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂，以磷酸盐溶液和乙腈的混合液作为流动相，其中磷酸盐溶液的浓度为10-60mmol/L，乙腈的体积百分比为5-25％，检测波长为200-210nm，该检测波长为能检测氨基酸紫外吸收的末端波长。优选的，本发明提供一种赖氨酸的高效液相色谱检测方法，其色谱条件为：用磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂，以20mmol/L磷酸二氢钾-乙腈(85:15)为流动相，检测波长为205nm。进一步的，本发明所述赖氨酸的高效液相色谱检测方法，其色谱条件为：用磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂，以20mmol/L磷酸二氢钾-乙腈(85:15)为流动相，检测波长为205nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃。进一步的，本发明所述赖氨酸的高效液相色谱检测方法，其理论板数按赖氨酸峰计不低于3000。优选的，本发明所述赖氨酸的高效液相色谱检测方法，其中待检测的赖氨酸浓度范围为0.2-2.0058mg/ml。优选的，本发明所述赖氨酸的高效液相色谱检测方法，其中待测品为药品注射用赖氨匹林。优选的，本发明所述赖氨酸的高效液相色谱检测方法，其测定方法为：色谱条件与系统适用性试验：用磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂，以20mmol/L磷酸二氢钾-乙腈(85:15)为流动相；检测波长为205nm，理论板数按赖氨酸峰计，应不低于3000。测定法：取注射用赖氨匹林供试品适量，精密称定，加0.02mmol/L盐酸溶液溶解并定量稀释成每1ml中约含赖氨酸0.8mg的溶液作为供试品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取盐酸赖氨酸对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算赖氨酸的含量，即得。本发明还提供一种赖氨酸的高效液相色谱检测方法的应用，其用于检测药品注射用赖氨匹林中的赖氨酸含量。本发明的赖氨酸的高效液相色谱检测方法，能够对药品“注射用赖氨匹林”中的赖氨酸含量进行准确可靠的测定，在0.2-2.0mg/ml的浓度范围内具有良好的线性关系，系统适用性良好，准确度高，稳定性、精密度、耐用性和专属性均良好，且操作简单易行，较衍生化法和氨基酸自动分析仪检测法大大降低了检测成本。附图说明图1：实施例2中盐酸赖氨酸对照品的浓度对峰面积线性回归曲线图。图2：实施例10的色谱图结果。图3：实施例11的色谱图结果。具体实施方式下面实施例对本发明进一步详细说明，本领域技术人员应当意识到在不脱离本发明的范围和精神的情况下所作的改动，均属于本发明的范围。实施例1：色谱条件和样品高效液相色谱仪：岛津LC-20A液相色谱仪。色谱条件：用磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂，以20mmol/L磷酸二氢钾-乙腈(85:15)为流动相；流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为205nm，理论板数按赖氨酸峰计应不低于3000。盐酸赖氨酸对照品：来自中国食品药品检定研究院，140673-201408，含量：99.9％。供试品：国药集团国瑞药业有限公司，注射用赖氨匹林，规格：0.9g，批号：1510101稀释剂：0.02mol/L盐酸溶液。实施例2：线性试验精密称定盐酸赖氨酸对照品0.10029g，置50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性试验储备溶液(100％浓度)。精密量取线性试验储备液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml，分别置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为线性试验系列浓度溶液，分别为10％浓度溶液、20％浓度溶液、30％浓度溶液、40％浓度溶液、50％浓度溶液、60％浓度溶液、70％浓度溶液、80％浓度溶液。分别精密量取各浓度溶液20μl，注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图。试验结果表明，赖氨酸在约0.20058mg/ml-2.0058mg/ml浓度范围内线性关系良好。以浓度对峰面积进行线性回归，试验结果见下表1，线性回归曲线见附图1。表1赖氨酸含量测定方法线性试验结果实施例3：系统适用性试验取线性试验项下40％浓度溶液，作为系统适用性溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图。试验结果表明，本方法系统适用性良好，试验结果见下表2。表2赖氨酸含量测定方法系统适用性试验结果测定次数123456平均RSD％保留时间(min)25.94425.94125.93525.93625.93525.93425.9380.02峰面积489875489813490356490332490151489632490026.50.07理论塔板数14735.814770.214748.514745.01468514762.514741.20.20实施例4：准确度试验(加样回收试验)回收率测定储备液制备：精密称定注射用赖氨匹林0.38106g(赖氨酸含量已准确测定44.70％，即含有赖氨酸共0.1703g)，置250ml量瓶中，以稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率测定储备液。回收率测定溶液的制备：精密称定9份盐酸赖氨酸对照品(每1份中赖氨酸的实际投入量见表3)，分别置9个50ml量瓶中，每个量瓶精密加入25ml上述回收率测定储备液(即每个量瓶中含样品中的赖氨酸的量为0.01703g)，再分别用稀释剂定容至刻度，摇匀，作为回收率测定溶液。取上述9个回收率测定溶液各20μl，注入液相色谱仪，每个溶液进样2次，记录色谱图；以线性试验项下40％浓度溶液作为对照品溶液，按外标法以峰面积计算测得量，再按下式计算加样回收率。试验结果表明，本方法准确度高，能够满足检测要求，试验结果见下表3。表3赖氨酸含量测定方法加样回收试验结果实施例5：溶液稳定性试验以线性试验项下40％浓度溶液作为对照品稳定性试验溶液；精密称定供试品0.07545g置50ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品稳定性试验溶液；以上两种溶液均放入液相色谱仪样品架中，样品架温度为室温。对照品稳定性试验溶液于第0、2、5、9、14、19、24、29和35小时分别取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品稳定性试验溶液于第0、3、6、9、14、21、26和32小时分别取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明，对照品溶液室温放置35小时稳定；供试品溶液室温下放置32小时稳定。试验结果见下表4。表4赖氨酸含量测定溶液稳定性试验结果实施例6：精密度试验以稳定性试验供试品溶液为样品1，同法制备5份供试品溶液，共6份样品，上述溶液分别取20μl注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图；以线性试验项下40％浓度溶液作为对照品溶液，按外标法以峰面积计算供试品中赖氨酸含量。试验结果表明，本方法精密度良好。试验结果见下表5。表5赖氨酸含量测定方法精密度试验结果样品1样品2样品3样品4样品5样品6RSD(％)第1次进样的峰面积512097511470509518515252516587516639---第2次进样的峰面积512588512155509325515145516240516138---赖氨酸含量(％)44.7644.6444.6944.7744.6444.670.13实施例7：中间精密度试验另一个分析员在不同的时间，使用与实施例6型号不同的高效液相色谱仪(岛津LC-2010CHT)，以相同的色谱条件进行实验。称取供试品约76mg，置50ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；再同法制备5份供试品溶液，共6份样品，上述溶液分别取20μl注入液相色谱仪，每个样品进样2次，记录色谱图；精密称定对照品0.02023g，置25ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液，按外标法以峰面积计算供试品中赖氨酸含量。试验结果表明，实施例6和实施例7的两位分析人员的12份供试品中赖氨酸含量测得值RSD为0.59％，表明本方法中间精密度良好。试验结果见下表6和表7。表6赖氨酸含量测定方法中间精密度试验结果样品1样品2样品3样品4样品5样品6RSD(％)第1次进样的峰面积536976530281535771530206538252532216---第2次进样的峰面积536467529918535569530544536990534081---赖氨酸含量(％)45.1145.0845.1044.8745.5045.000.48表7赖氨酸含量精密度测试结果实施例8：耐用性实验取盐酸赖氨酸对照品适量，加稀释剂溶解。分别选择柱温为30℃和40℃，流速为0.8ml/min和1.2ml/min，磷酸盐浓度18mmol和22mmol，有机相(乙腈)比例为13％和17％，其他相应色谱条件不变。精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明，本方法耐用性良好。试验结果见下表8。表8赖氨酸含量测定方法耐用性试验结果实施例9：专属性试验(1)酸水解(5mol/LHCl室温放置72h)：称取供试品76mg置50ml量瓶中，加入5ml的5mol/LHCl室温放置72h，用NaOH中和后，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，取溶液过滤，即得。(2)碱水解(5mol/LNaOH室温放置72h)：称取供试品76mg置50ml量瓶中，加入5ml的5mol/LNaOH室温放置72h，用HCl中和后，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，取溶液过滤，即得。(3)高温破坏(85℃放置6h)：称取供试品152mg置25*40mm称量瓶中，摊平，在85℃下加热6小时，冷却至室温，用稀释剂溶解并转移至100ml量瓶中，并用稀释剂定容至刻度，摇匀即得。(4)氧化破坏(30％H2O2室温放置72h)：称取供试品76mg置50ml量瓶中，加入5ml的30％H2O2室温放置72h，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，取溶液过滤，即得。(5)光照破坏(4500Lux照射72h)：称取供试品152mg置25*40mm称量瓶中，摊平，在4500Lux条件下照射72h，用稀释剂溶解并转移至100ml量瓶中，并用稀释剂定容至刻度，摇匀即得。精密量取以上各溶液20μl注入液相色谱仪，以DAD检测器检测，记录色谱图，各条件下赖氨酸主峰的纯度均符合要求(均大于0.999)，表明本方法的专属性很好，且降解产物与主峰之间的分离度大于1.5。另取阿司匹林对照品(中国食品药品检定研究院，100113-201405，含量：99.8％)、水杨酸对照品(中国食品药品检定研究院，100106-201104，含量：99.9％)、乙酸(国药集团化学试剂有限公司，20131016，含量：≥99.5％)和对照品各适量，以稀释剂配制成适当浓度的溶液，取以上溶液与溶剂各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明，注射用赖氨匹林中已知成分阿司匹林及其主要降解物水杨酸、乙酸，和其他未知降解杂质，均得到有效分离，不干扰赖氨酸的测定，本方法专属性良好。试验结果见下表9：表9赖氨酸含量测定方法专属性试验分离度及峰纯度破坏条件主峰与相邻杂质的分离度峰纯度指数酸水解34.1470.999951碱水解32.8680.999899氧化破坏17.5800.999955高温破坏7.1900.999583强光破坏36.8470.999868实施例10：测定实施例1色谱条件：用磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂，以20mmol/L磷酸二氢钾-乙腈(85：15)为流动相，检测波长为205nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃。供试品的规格为：0.9g/支。取5支供试品，测得供试品的平均装量为0.9102g/支。精密称取供试品82.60mg，置50ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(C样＝82.60/50＝1.6520mg/ml)；精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，每个供试品溶液进样2次；另精密称取盐酸赖氨酸对照品50.44mg，置50ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液(C对＝50.44×0.999×0.8004/50＝0.80664mg/ml)，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中赖氨酸含量为44.61％。供试品和对照品的色谱图见图2。A样：供试品溶液中赖氨酸峰面积均值；A对：对照品溶液中赖氨酸峰面积均值。实施例11：测定实施例2色谱条件：用磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂，以25mmol/L磷酸二氢钠-乙腈(80：20)为流动相，检测波长为208nm，流速为0.8ml/min，柱温为30℃。供试品的规格为：0.9g/支。取5支供试品，测得供试品的平均装量为0.9098g/支。精密称取供试品98.51mg，置50ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(C样＝98.51/50＝1.9702mg/ml)；精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，每个供试品溶液进样2次；另精密称取盐酸赖氨酸对照品50.12mg，置50ml量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液(C对＝50.12×0.999×0.8004/50＝0.80152mg/ml)，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中赖氨酸含量为44.70％。供试品和对照品的色谱图见图3。A样：供试品溶液中赖氨酸峰面积均值；A对：对照品溶液中赖氨酸峰面积均值。当前第1页1 2 3