本发明涉及到一种人参叶中人参皂苷类成分的含量测定方法，属中药技术领域，具体的，涉及一种人参叶中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、20(S)-人参皂苷F 1和人参皂苷Rd六种成分同时测定的含量测定方法。
背景技术：
人参叶为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥叶。秋季采收，晾干或烘干。人参叶苦、甘、寒，归肺、胃二经，始载于《本草纲目拾遗》，具有“清肺，生津，止渴”、“补中带表，生胃津，祛暑气，降虚火，利四肢头目”、“生津润燥，益肺和肝，培补元气”等功能。现代研究表明，人参叶的药理作用与人参极为相似，对肿瘤、肝炎、冠心病、阿狄森氏病有较好的治疗效果。同时，人参叶也能提高神经活动过程的灵活性。可改善睡眠和情绪，提高脑力、体力等人体机能，有显著的抗疲劳、利尿及抗辐射作用。能增加机体对各种有害刺激的防御能力。对心肌营养不良、冠状动脉硬化、神经衰弱等均有一定的防治作用。人参叶虽好，不可滥用，随着人参叶的功效渐渐为人们所熟知，近年来渐有滥用之势，甚至造成多种毒副作用的出现。科学、合理地使用人参叶已成为不可忽视的问题，因此，人参叶的质量标准有待进一步的提高完善。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种人参叶中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、20(S)-人参皂苷F1和人参皂苷Rd 六种成分同时测定的含量测定方法。
本发明含量测定方法采用超高效液相色谱法，该方法如下：
色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的微经柱；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A由18％渐变至20％；9～13分钟，流动相A由20％渐变至28％；13～28分钟，流动相A为28％渐变至35％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；
混合对照品溶液的制备
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rb2对照品、20(S)-人参皂苷F1对照品、人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 100μg、人参皂苷Re 500μg、人参皂苷Rb1 50μg、人参皂苷Rb2 80μg、20(S)-人参皂苷F1 50μg、人参皂苷Rd 200μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取人参叶粉末，过四号筛，约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60～80％甲醇25ml，密塞，称定重量，置75～82℃水浴上回流提取2.5～3小时，放冷，再称定重量，用同浓度甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1～2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。
本发明含量测定方法中，供试品溶液制备中水浴回流提取时间优选为2.5小时；测定法中分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液的量优选为2μl，注入液相色谱仪。
本发明含量测定方法最优的技术方案为：
色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的微经柱；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A由18％渐变至20％；9～13分钟，流动相A由20％渐变至28％；13～28分钟，流动相A为28％渐变至35％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；
混合对照品溶液的制备
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rb2对照品、20(S)-人参皂苷F1对照品、人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 100μg、人参皂苷Re 500μg、人参皂苷Rb1 50μg、人参皂苷Rb2 80μg、20(S)-人参皂苷F1 50μg、人参皂苷Rd 200μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取人参叶粉末，过四号筛，约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，置82℃水浴上回流提取2.5小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。
为了验证测定含量方法的稳定性、准确性、专属性及系统适应性，对方法进行了以下方法学验证实验，以确保该含量测定方法可以用于人参叶的质量控制。
1、仪器与试药
仪器：Acquity超高效液相色谱仪(二元泵，DAD检测器)
Ultimate 3000超高效液相色谱仪(四元泵，DAD检测器)
LC20～AT超高效液相色谱仪(二元泵，DAD检测器)
对照品：人参皂苷Rg1(中检院，批号：110703～201530)
人参皂苷Re(中检院，批号：110754～201525)
人参皂苷Rb1(中检院，批号：110704～201424)
人参皂苷Rb2(中检院，批号：111715～201203)
20(S)-人参皂苷F1(南通飞宇生物科技有限公司，批号：FY15401226)
人参皂苷Rd(中检院，批号：111818～201302)
试剂：乙腈为色谱纯，水为去离子水，其它试剂均为分析纯。
2.色谱条件的确定
参照中国药典2015年版一部收载的人参色谱条件，确定本品色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(微经柱)；以乙腈～水为流动相进行梯度洗脱，经反复试验确定以下的梯度洗脱程序(见表1)。流速：0.4mL/min，柱温：30℃，检测波长：203nm，进样量：2μl。理论板数按人参皂苷Re峰计算应不低于10000。
表1 流动相梯度洗脱表
3.提取方法的确定
3.1提取方式的选择
取同一批样品适量，选取80％甲醇作为提取溶剂，分别采用超声、回流两种提取方式进行试验，按拟定色谱条件测定。结果表明，采用回流的方式，六种成分的含量测定结果均高于超声，因此选用回流作为本实验的提取方式(结果见表2)。
表2 不同提取方式六种成分的含量测定结果
3.2提取溶剂选择
取同一批样品适量，分别以甲醇、80％甲醇、60％甲醇、40％甲醇作为提取溶剂，回流提取2h。结果表明，人参皂苷Rg1采用以上四种提取溶剂含量测定结果无明显差别；人参皂苷Re的含量随提取溶剂中水量的增加而略有上升；人参皂苷Rb1、20(S)人参皂苷F1与人参皂苷Rb2采用80％甲醇与60％甲醇提取时含量较高；人参皂苷Rd采用40％甲醇提取时含量最低，其余三种溶剂差别太大。综合以上结果考虑，选用80％甲醇作为本实验的提取溶剂(结果见表3)。
表3 不同提取溶剂六种成分的含量测定结果
3.3回流时间的选择
取同一批样品适量，回流提取时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，按拟定色谱条件测定。结果表明回流时间在2.5h之内时，随着回流时间的增加，所测成分的含量明显增加，而在2.5h之后，六种成分的含量测定结果没有明显区别，故选择提取时间为2.5h。(结果见表4)
表4 不同提取时间六种成分的含量测定结果
通过实验，提取方法确定为：取本品粉末(过四号筛)约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，置82℃水浴上回流提取2.5小时，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品和供试品色谱图见图1。由图1可见，人参皂苷类各成分峰形对称，分离良好，样品中也没有相应干扰峰存在，专属性较好。
4.方法学考察
4.1线性考察
分别精密吸取不同浓度的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、20(S)-人参皂苷F1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd对照品溶液，分别注入超高效液相色谱仪，按2.3项下的色谱条件测定，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。人参皂苷Rg1在0.01922μg～1.922μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝895293x+461(r＝0.9999)；人参皂苷Re在0.09687μg～9.687μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝775587x+18759(r＝0.9999)；人参皂苷Rb1在0.01162μg～1.162μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝644122x+2088(r＝0.9999)；20(S)-人参皂苷F1在0.01230μg～1.230μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝1044583x+5271(r＝0.9999)；人参皂苷Rb2在0.01164μg～1.164μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝681704x+1356(r＝0.9999)；人参皂苷Rd在0.03802μg～3.802μg之间呈良好的线性关系，回归方程为：y＝760002x+2946(r＝0.9999)。(实验结果见表5、表6)。
表5 线性关系考察结果(1)
表6 线性关系考察结果(2)
4.2重复性试验
取同一人参叶样品(2号)适量，粉碎，过四号筛，混匀，共称取9份，编号为1～9，其中1～3号0.2g，4～6号0.4g，7～9号0.6g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，依法制成供试品溶液，测定含量。结果见表7，表明重复性良好。
表7 重复性试验结果(未折水分)
4.3加样回收率试验
取同一批人参叶样品(2号)适量，粉碎，过四号筛，混匀，取粉末9份，每份约0.2g精密称定，每三份为一组，分别加入用80％甲醇溶液配制的低、中、高三个浓度的对照品溶液25ml，按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液。按拟定的色谱条件测定，计算回收率。结果见表8～13。表明本方法回收率较好。
表8 人参皂苷Rg1回收率试验结果
表9 人参皂苷Re回收率试验结果
表10 人参皂苷Rb1回收率试验结果
表11 20(S)-人参皂苷F1回收率试验结果
表12 人参皂苷Rb2回收率试验结果
表13 人参皂苷Rd回收率试验结果
结论：经试验，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、20(S)-人参皂苷F1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd的加样回收率分别为99.3％、101.8％、98.3％、99.95％、101.0％、101.4％，RSD分别为1.5％、1.0％、1.8％、0.9％、1.5％、1.1％，表明各成分加样回收率良好。
4.4稳定性试验
依次在0、2、6、10、16、24h精密吸取同一供试品溶液注入超高效液相色谱仪，测定，结果见表13，表明供试品溶液至少在24小时内稳定。
表13 稳定性试验结果
4.5样品测定
取收集到的人参叶共10批，测定，计算含量，结果见表14。
表14 人参叶样品含量测定结果
附图说明
图1人参叶中六种人参皂苷类成分含量测定色谱图(峰1：人参皂苷Rg1；峰2：人参皂苷Re；峰3：人参皂苷Rb1峰；4：人参皂苷F1；峰5：人参皂苷Rb2；峰6：人参皂苷Rd)；
具体实施方式
实施例1
色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的微经柱；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A由18％渐变至20％；9～13 分钟，流动相A由20％渐变至28％；13～28分钟，流动相A为28％渐变至35％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；
混合对照品溶液的制备
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rb2对照品、20(S)-人参皂苷F1对照品、人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1 100μg、人参皂苷Re500μg、人参皂苷Rb150μg、人参皂苷Rb280μg、20(S)-人参皂苷F1 50μg、人参皂苷Rd200μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取人参叶粉末，过四号筛，约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，置75℃水浴上回流提取2.5小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。
实施例2
色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的微经柱；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A由18％渐变至20％；9～13分钟，流动相A由20％渐变至28％；13～28分钟，流动相A为28％渐变至35％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；
混合对照品溶液的制备
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rb2对照品、20(S)-人参皂苷F1对照品、人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1100μg、人参皂苷Re500μg、人参皂苷Rb150μg、人参皂苷Rb280μg、20(S)-人参皂苷F1 50μg、人参皂苷Rd200μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取人参叶粉末，过四号筛，约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，称定重量，置82℃水浴上回流提取3小时，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。
实施例3
色谱条件与系统适用性试验色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的微经柱；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0～9分钟，流动相A由18％渐变至20％；9～13分钟，流动相A由20％渐变至28％；13～28分钟，流动相A为28％渐变至35％；检测波长为203nm；流速0.4ml/min；
混合对照品溶液的制备
称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rb2对照品、20(S)-人参皂苷F1对照品、人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1100μg、人参皂苷Re500μg、人参皂苷Rb150μg、人参皂苷Rb280μg、20(S)-人参皂苷F1 50μg、人参皂苷Rd200μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取人参叶粉末，过四号筛，约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，置75℃水浴上回流提取3小时，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，以外标法计算含量，即得。
上述实施例均按照药典进行方法学验证，结果显示方法准确可靠、灵敏、专属，各项指标均符合质量控制的要求。