中枢神经系统损伤的代谢组学图谱分析的制作方法

本发明的领域涉及诊断中枢神经系统（CNS）的损伤的代谢组学和方法，所述损伤包括所有脑脊髓损伤。更具体地，本发明涉及诊断以下损伤的代谢组学和方法：轻度外伤性脑损伤，包括震荡损伤和冲击损伤；轻度脊髓损伤，包括由脊柱屈曲过度、伸展过度、旋转、横向应力、压迫、牵引和脊髓部分横断引起的损伤；以及由中风、中毒、心理困扰、化学品、感染、炎症、自身免疫性疾病、退行性过程、缺氧、缺血、代谢紊乱和癌症/辐射引起的非外伤性CNS损伤。
背景技术：
：获得性脑损伤（ABI）和获得性脊髓损伤（ASI）分别为由在子宫、围产期以及产后发生的事件引起的脑和脊柱损伤。这些损伤由外伤性脑损伤（例如机械、压力波等）或者来源于内部或外部起因（例如中风、肿瘤、感染、中毒、缺氧、缺血、辐射、物质滥用等）的非外伤性损伤造成。外伤性脑损伤（traumaticbraininjury,TBI）是来自外部的机械力对脑的损害，导致认知、身体和心理社会功能的永久或暂时的损伤，伴有相关的意识状态的削弱或改变（包括震荡损伤和冲击损伤）。美国康复医学会头部损伤跨学科特别兴趣小组（TheHeadInjuryInterdisciplinarySpecialInterestGroupoftheAmericanCongressofRehabilitationMedicine）将“轻度”TBI（mTBI）定义为“外伤性地诱发的脑功能的生理破坏”，表现为下列情形之一：任何期间的意识丧失（LOC）、对事件之前或之后的事件的任何记忆丧失、在该事件时的精神状态上的任何改变和局灶性神经功能缺陷（其可以是或可以不是瞬时的）。在眼睛、语言和运动反应的基础上，格拉斯哥昏迷量表（GCS）帮助定义了TBI的严重程度（3-8，重度；9-12，中度；13-15，轻度）。公众健康的主要关注的是TBI的流行病比例，其在美国具有1.6至3.2百万例的年发病率。轻度的TBI或mTBI（其中震荡损伤和冲击波损伤为亚集）是最常见形式，代表了所有TBI的几乎75%[http://www.cdc.gov/TraumaticBrainInjury]。轻度的TBI可以由冲击力引起，其中头部撞击某物或被某物或冲力撞击，其中头部移动而它本身不受到外伤（例如，当胸部碰撞某物并且头部突然前移时）。从非常年轻的人至长者，全部的年龄组都遭受震荡伤。某些活动与震荡伤更频繁地相关，其包括运动员和兵役，但是它们也起因于由机动车碰撞、从高处掉落和袭击造成的一般的外伤。震荡伤通常导致明显的急性症状，并且在一些个体中导致长期的神经机能障碍。压力波（例如炸弹爆炸）可以引起从轻度至重度的TBI的整个严重程度范围，并且可以包括来自抛射体的穿透损伤。冲击相关的TBI的病理生理学是区别性的，其损伤量级取决于几种因素，其包括冲击能量以及与爆炸中心的距离（Rosenfeld,etal.,LancetNeurol.2013Sep;12(9):882-93.）。冲击损伤是起因于直接或间接暴露至爆炸的物理外伤的复杂类型。(Rosenfeld,etal.,LancetNeurol.2013Sep;12(9):882-93.)原发性损伤是由爆炸的超压波或冲击波引起的。当人接近爆炸的弹药（例如地雷）时，这些是特别可能的。动物模型表明，大脑易受原发性爆炸损伤的伤害。来自超压的剪切波和压力波可以潜在地直接地引起TBI（例如，震荡伤、出血、水肿、弥漫性轴索损伤）。所述原发性冲击机制也可以导致由于冲击性肺损伤以及随后的气栓形成导致的脑梗塞["BlastInjuries:TraumaticBrainInjuriesfromExplosions",Brainline.org]。尽管中度至重度的TBI的诊断是明确的，但在震荡和爆炸事件后的轻度TBI是诊断不足的。["BlastInjuries:TraumaticBrainInjuriesfromExplosions",Brainline.org]即，尽管基于临床征象容易诊断中度和重度的TBI，但轻度TBI可由于不易察觉的、瞬时的或缺乏的临床征象而被错过。后者需要客观的诊断法，例如敏感的、特异的以及可重复的血液测试。临床上显著的mTBI的诊断可以是困难的，决定停止玩耍或活动也一样。同样不清楚的是，何时mTBI患者应当恢复日常活动。因此，人们对在mTBI中有帮助的生物标记物的发现有极大兴趣，其包括原发性脑冲击损伤和震荡伤的诊断、预后和复原。目前，没有单一的生物标记物具有足够的敏感性和特异性。非外伤性脑损伤（非TBI）也可以导致轻度异常的神经系统症状。考虑到非TBI损伤的难以捉摸的性质，可以用客观的诊断测试（例如敏感的、特异的和可重复的血液测试）更好地识别它们。外伤性脊髓损伤（traumaticspinalcordinjury,TSI；例如由脊柱屈曲过度、伸展过度、横向应力、旋转、压迫、牵引和脊髓部分横断引起的损伤；通常由机动车碰撞、从高处掉落、运动等引起）以及非外伤性脊髓损伤（非TSI；例如椎间盘疾病、血液供应的中断、感染、电击、癌症、辐射等）也可导致轻度的外周症状（例如“不完整的”损伤）。考虑到TSI和非TSI损伤的通常难以捉摸的性质，可以用客观的诊断测试（例如，敏感的、特异的和可重复的血液测试）更好地识别它们。代谢组学（metabolomics）是相对新的研究领域，其测量人的小分子代谢物图谱（profile）（<1500道尔顿）。用于代谢组学的两种常见的方法是核磁共振（NMR）光谱法和质谱分析法（MS）。前者测量大量的代谢物但缺乏敏感度（微摩尔级范围），而后者对于定量氨基酸、酰基肉碱、甘油磷脂、鞘脂和糖非常敏感（皮摩尔级范围）。代谢组学的吸引力在于代谢物落入遗传、转录组学、蛋白质组学和环境变异的下游，因此提供了表型和身体状况的最完整的和动态的测量。技术实现要素：本发明涉及代谢组学图谱分析或个别代谢物作为生物标记物来诊断中枢神经系统（CNS）损伤的应用，所述损伤包括获得性脑损伤（ABI）和获得性脊髓损伤（ASI）。这些损伤可以是外伤性的（mTBI和mTSI）以及非外伤性的（非TBI和非TSI），包括震荡伤或挫伤、冲击（blast）损伤、以及中风、中毒、心理困扰（psychologicaldistress）、化学品、感染、炎症、自身免疫、退行性、缺氧、缺血、代谢的和癌症/辐射诱导的脑/脊髓损伤。本发明涉及代谢组学图谱分析或个别代谢物作为生物标记物来特异性地诊断脑和/或脊髓损伤的应用。仅为了本文的目的，术语“ACNSI”（获得性CNS损伤）将被用于意指“ABI和/或ASF”。同样，非CNSI（非CNS损伤）将被用于意指正常或对照的对象。在一个实施方式中，本发明是在对象中诊断ACNSI的方法，其包括：从所述对象获得代谢物图谱（metaboliteprofile）；以及（b）使用多变量统计分析和机器学习，以将所述对象的图谱与ACNSI的代谢物图谱的预设集（predeterminedset）和非CNSI的代谢物图谱的预设集进行比较，以诊断所述对象是否患有ACNSI。在所述诊断ACNSI的方法的一个实施方式中，通过从已知患有ACNSI的对象的群体中获得第一代谢物图谱以及从对照的非ACNSI（称为“正常”）对象的群体中获得第二代谢物图谱，获得ACNSI和非ACNSI代谢物图谱的预设集。在所述诊断ACNSI的方法的另一个实施方式中，所述对象的代谢物图谱以及ACNSI和非ACNSI图谱的第一和第二预设集被提供作为多维代谢组学数据的集，并且其中步骤（b）包含：向所述多维代谢组学数据的集施加（i）维数降低（dimensionalityreduction）、（ii）特征选择（featureselection）、或（iii）维数降低和特征选择两者，以获得降低的代谢组学数据集。在所述诊断ACNSI的方法的另一个实施方式中，步骤（b）包含：将对象的代谢物图谱的集以及ACNSI和非ACNSI的预设的代谢物图谱的集进行标准化，以获得矩阵，并且直接在该代谢物矩阵上执行主成分分析（principalcomponentsanalysis）。在另一个实施方式中，本发明是在对象中诊断ACNSI的方法，其包括：（a）从所述对象获得代谢物图谱；（b）在所述对象的代谢物图谱和ACNSI图谱的预设集和非ACNSI图谱的预设集之间，创建两两相关（pairwisecorrelations）的矩阵，并且在该相关矩阵中识别ACNSI集群和非ACNSI集群（cluster）；以及（c）确定所述患者的图谱是否落入所述ACNSI集群或非ACNSI集群之内。在对象中诊断ACNSI的上述方法的一个实施方式中，通过从已知患有ACNSI的群体中获得代谢物图谱的第一集以及从对照的非ACNSI（正常）对象的群体中获得代谢物图谱的第二集，分别地获得代谢物图谱的预设的ACNSI集和非ACNSI集。在另一个实施方式中，本发明是在ACNSI患者中跟踪或追踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的方法，所述方法包括：（a）在医疗干预（康复治疗）期间在不同时间从所述患者中获得代谢物图谱；以及（b）使用多变量统计分析和机器学习，以将在所述不同时间中的每一个的所述患者的图谱与ACNSI的代谢物图谱的预设集和非ACNSI的代谢物图谱的预设集进行比较，以追踪在所述患者中的医疗干预（康复治疗）的效率。在本发明的在ACNSI患者中跟踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的所述方法的一个实施方式中，通过从已知患有ACNSI的对象的群体中获得第一代谢物图谱以及从对照的非ACNSI（称为“正常”）对象的群体中获得第二代谢物图谱，获得ACNSI和非ACNSI代谢物图谱的预设集。在本发明的在ACNSI患者中跟踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的所述方法的另一个实施方式中，所述患者的代谢物图谱以及ACNSI和非ACNSI代谢物图谱的第一和第二预设集被提供作为多维代谢组学数据的集，并且其中步骤（b）包含：向所述多维代谢组学数据的集施加（i）维数降低、（ii）特征选择、或（iii）维数降低和特征选择两者，以获得降低的代谢组学数据集。在本发明的在ACNSI患者中跟踪或追踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的所述方法的另一个实施方式中，步骤（b）包含：将所述患者的代谢物图谱以及ACNSI和非ACNSI的预设的代谢物图谱的集进行标准化以获得矩阵，并且直接地在代谢物矩阵上执行主成分分析。在本发明的在ACNSI患者中跟踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的所述方法的另一个实施方式中，将ACNSI和非ACNSI的代谢物图谱的预设集匹配下述的一种或多种：年龄、性别、活力（activity）、身体体质（bodyhabitus）、营养、药物和发病率（morbidity）。在本发明的在ACNSI患者中跟踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的所述方法的另一个实施方式中，使用代谢组学获得所述患者的代谢物图谱和代谢物图谱的预设集。在本发明的在ACNSI患者中跟踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的所述方法的另一个实施方式中，使用以下中的一种或多种执行所述代谢组学：高效液相色谱、薄层色谱、电化学分析、质谱（MS）、折射率光谱、紫外光谱、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱、核磁共振（NMR）、光散射分析、气相色谱（GC）、或与MS结合的GC、与LC-MS/MS结合的直接注入（directinjection，DI）。在本发明的在ACNSI患者中跟踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的所述方法的另一个实施方式中，使用适当地程序化（编程）的计算机执行所述获得、使用、创建以及确定步骤。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的一个实施方式中，将ACNSI和非ACNSI的预设图谱匹配下述的一种或多种：年龄、性别、活力、营养、身体体质、药物、以及共同发病率（co-morbidity）。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，使用代谢组学获得所述对象/患者的代谢物（包括脂质和脂肪酸）图谱以及代谢物图谱的预设集。在根据任何一个前述的实施方式的另一个实施方式中，使用以下中的一种或多种执行所述代谢组学（包括脂质和脂肪酸）：高效液相色谱、薄层色谱、电化学分析、质谱（MS）、折射率光谱、紫外光谱、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱、核磁共振（NMR）、光散射分析、气相色谱（GC）、或与MC结合的GC、与LC-MS/MS结合的直接注入（DI）。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，使用适当地程序化的计算机执行所述获得、使用、创建以及确定步骤。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，从生物学测试样品中获得所述代谢物图谱，所述生物学测试样品选自：血液、血浆、血清、唾液、滑液（cynovialfluid）、尿液、脊髓液、支气管肺泡灌洗液和提取物。在一个方面，所述代谢物包括磷脂、甘油磷脂、脂质、缩醛磷脂、脂肪酸、糖、氨基酸、核苷酸、在细胞过程中形成的中间体、或其组合。在另一个方面，所述代谢物包括脂质和脂肪酸或其组合。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，所述代谢物图谱包括下述的代谢物：C5、PCaaC32:l、PCaaC32:2、PCaaC36:5、PCaaC36:6、PCaeC34:0、PCaeC34:3、PCaeC36:0、PCaeC36:l、PCaeC36:2、PCaeC38:l、PCaeC38:2、PCaeC38:3、腐胺、甲酸盐、甲醇和琥珀酸盐。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，所述代谢物图谱包括下述的代谢物：C5、PCaaC30:2、、PCaaC32:0、PCaaC32:l、PCaaC32:2、PCaaC32:3、PCaaC34:4、PCaaC36:6、PCaaC42:6、PCaeC30:0、PCaeC30:l、PCaeC32:l、PCaeC34:0、PCaeC34:2、PCaeC34:3、PCaeC36:0、PCaeC36:2、PCaeC38:l、PCaeC38:3、SMC22:3、SMC24:0、SMC24:l、α-氨基己二酸、反式-OH-脯氨酸、腐胺、甜菜碱、甲酸盐、葡萄糖、甘油、甲醇和丝氨酸。在根据任何一个前述的本发明的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，所述ACNSI选自mTSI和非TSI。在此实施方式的一个方面中，所述mTSI包括脊髓挫伤（contusion）、拉伸和/或部分的横断，并且所述非TSI包括由椎间盘疾病、电、中风、中毒、化学品、感染、缺血、代谢、炎症、自身免疫、退化、缺氧引起的损伤以及癌症/辐射诱导的脊髓损伤。在根据任何一个前述的本发明的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，所述ACNSI选自mTBI和非TBI。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，所述ACNSI是mTBI。在此实施方式的一个方面中，mTBI是震荡伤（concussion）或在冲击诱导的外伤性脑损伤中的原发性冲击伤（primaryblast）。在根据任何前述的本发明的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，所述ACNSI是非TBI。在此实施方式的一个方面，所述非TBI选自电诱导的脑损伤（电击）、惊厥（seizure）诱导的脑损伤、手术诱导的脑损伤、中风诱导的脑损伤、中毒诱导的脑损伤、心理性脑损伤、化学性脑损伤、感染性脑损伤、缺血性脑损伤、代谢性脑损伤、炎症性脑损伤、自身免疫性脑损伤、退行性脑损伤、缺氧性脑损伤以及癌症/辐射诱导的脑损伤。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，所述ACNSI是震荡伤。在根据任何一个前述的实施方式的所述方法的另一个实施方式中，所述ACNSI是在冲击诱导的外伤性脑损伤中的原发性冲击伤。在另一个实施方式中，本发明是用于与计算机系统结合使用的计算机程序产品，所述计算机程序产品包括计算机可读取的存储介质以及植入其中的计算机程序机制，所述计算机程序机制包含可执行指令，所述可执行指令用于执行在对象中诊断ACNSI的方法，所述可执行指令包括：（a）使用多变量统计分析和机器学习，以将对象的代谢物图谱与ACNSI代谢的图谱的预设集和正常的代谢的图谱的预设集进行比较，以及（b）基于所述的比较，确定所述对象是否患有ACNSI。在本发明的所述计算机程序产品的一个实施方式中，所述程序机制进一步包含用于以下的可执行指令：（i）识别在来自已知具有ACNSI的对象的群体的生物学样品的第一集中的代谢物、以及在来自对照的非ACNSI（称为“正常”）对象的群体的生物学样品的第二集中的代谢物，从而使用所述ACNSI和正常代谢物矩阵获得所述预设的ACNSI图谱和所述预设的正常图谱。在本发明的所述计算机程序产品的另一个实施方式中，通过t-SNE，在所述对象的代谢物图谱上以及在预设的ACNSI和正常的图谱中执行初始的维数降低。在根据任何一个本发明的前述的实施方式的计算机程序产品的另一个实施方式中，所述ACNSI选自mTSI和非TSI。在此实施方式的一个方面，所述mTSI包括脊髓挫伤、拉伸和/或部分的横断，并且所述非TSI包括由椎间盘疾病、电、中风、中毒、化学、感染、缺血、代谢、炎症、自身免疫、退化、缺氧引起的损伤以及癌症/辐射诱导的脊髓损伤。在根据任何一个前述的本发明的实施方式的所述计算机程序产品的另一个实施方式中，所述ACNSI选自mTBI和非TBI。在根据任何一个本发明的前述的实施方式的所述计算机程序产品的另一个实施方式中，所述ACNSI是mTBI。在此实施方式的一个方面中，所述mTBI是震荡伤或在冲击诱导的外伤性脑损伤中的原发性冲击伤。在根据任何本发明的前述的实施方式的所述计算机程序产品的另一个实施方式中，所述ACNSI是非TBI。在此实施方式的一个方面，所述非TBI选自电诱导的脑损伤（电击）、惊厥诱导的脑损伤、手术诱导的脑损伤、中风诱导的脑损伤、中毒诱导的脑损伤、心理性脑损伤、化学性脑损伤、感染性脑损伤、缺血性脑损伤、代谢性脑损伤、炎症性脑损伤、自身免疫性脑损伤、退行性脑损伤、缺氧性脑损伤以及癌症/辐射诱导的脑损伤。在另一个实施方式中，本发明提供了评估人类ACNSI的非人类动物模型的方法，所述方法包括：（a）从ACNSI的非人类动物模型中获得代谢物图谱；以及（b）使用多变量统计分析和机器学习，以将所述非人类动物模型图谱与人类ACNSI的代谢物图谱的预设集和人类非ACNSI的代谢物图谱的预设集进行比较，以确定所述非人类动物是否分类为ACNSI。在评估ACNSI的非人类动物模型的所述方法的一个实施方式中，通过从已知患有ACNSI的对象的群体中获得第一代谢物图谱以及从对照的非ACNSI（称为“正常”）对象的群体中获得第二代谢物图谱，以获得人类ACNSI和非ACNSI代谢物图谱的预设集。在评估ACNSI的非人类动物模型的所述方法的另一个实施方式中，ACNSI的非人类动物模型的代谢物图谱以及ACNSI和非ACNSI图谱的第一和第二预设集，被提供作为多维代谢组学数据的集，并且其中步骤（b）包含：向所述多维代谢组学数据的集施加（i）维数降低、（ii）特征选择、或（iii）维数降低和特征选择两者，以获得降低的代谢组学数据集。在评估ACNSI的非人类动物模型的所述方法的另一个实施方式中，步骤（b）包含：将所述非人类动物的代谢物图谱的集以及ACNSI和非ACNSI的预设代谢物图谱的集进行标准化，以获得矩阵，并且直接地在代谢物矩阵上执行主成分分析。在根据任何一个本发明的前述的实施方式的评估ACNSI的非人类动物模型的另一个实施方式中，所述ACNSI选自mTSI和非TSI。在此实施方式的一个方面，所述mTSI包括脊髓挫伤、拉伸和/或部分的横断，以及所述非TSI包括由椎间盘疾病、电、中风、中毒、化学、感染、缺血、代谢、炎症、自身免疫、退化、缺氧引起的损伤以及癌症/辐射诱导的脊髓损伤。在根据任何一个本发明的前述的实施方式的评估ACNSI的非人类动物模型的所述方法的实施方式中，所述ACNSI选自mTBI和非TBI。在根据任何一个本发明的前述的实施方式的评估ACNSI的非人类动物模型的所述方法的另一个实施方式中，所述ACNSI是mTBI。在此实施方式的一个方面，所述mTBI是震荡伤或在冲击诱导的外伤性脑损伤中的或原发性冲击伤。在根据任何本发明的前述的实施方式的评估ACNSI的非人类动物模型的所述方法的另一个实施方式中，所述ACNSI是非TBI。在此实施方式的一个方面，所述非TBI选自中风诱导的脑损伤、中毒诱导的脑损伤、心理性脑损伤、化学性脑损伤、感染性脑损伤、缺血性脑损伤、代谢性脑损伤、炎症性脑损伤、自身免疫性脑损伤、退行性脑损伤、缺氧性脑损伤以及癌症/辐射诱导的脑损伤。附图说明下述附图阐明了本发明的各个方面以及优选的和替代性的实施方式。图1：在降低的2-维空间中描绘的个体对象的图，以阐明t-SNE维数降低的步骤的能力（12例震荡伤对象-实心圆、17例对照对象-空心圆）。图2：阐明了聚集的完全连锁层次聚类（agglomerativecomplete-linkagehierarchicalclustering）的图，其产生3个最高级的集群：绿色（“G”）集群-全部有震荡伤，但2蓝绿色（“C”）集群-全部有震荡伤，红色（“R”）集群-两例有震荡伤、一例对照。图3：阐明了接受者操作曲线（ROC）的图。注意ROC0倍、ROC1倍、以及ROC2倍的曲线被叠加。图4：在首要的3个成分的3-维散点图中描绘个体动物的图（15例冲击伤动物-实心圆，15例对照动-“X”）。图5：在降低的2-维空间中描绘个体对象的图，以阐明t-SNR维数降低步骤的能力（冲击伤大鼠-空心圆，对照大鼠-实心圆）。图6：皮尔逊积矩相关系数以两两比较在对象之间的代谢物图谱。图7：阐明了聚集的完全连锁层次聚类的图，其产生2个最高级的集群：冲击伤（“B”）集群（n=15）以及对照（C）集群（n=15）。图8：阐明了在本发明的实施方式中使用的数据分析的方法以及建模的方法的图。发明详述缩写MS代谢物表格C0（肉碱）酰基肉碱C10(癸酰基肉碱)酰基肉碱C10:l(癸烯酰基肉碱)酰基肉碱C10:2(癸二烯基肉碱)酰基肉碱C12(十二烷酰基肉碱)酰基肉碱C12-DC(十二烷二酰基肉碱)酰基肉碱C12:l(十二烷烯酰基肉碱)酰基肉碱C14(十四烷酰基肉碱)酰基肉碱C14:l(十四烷烯酰基肉碱)酰基肉碱C14:l-OH(羟基十四烷烯酰基肉碱)酰基肉碱C14:2(十四烷二烯基肉碱)酰基肉碱C14:2-OH(羟基十四烷二烯基肉碱)酰基肉碱C16(十六烷酰基肉碱)酰基肉碱C16-OH(羟基十六烷酰基肉碱)酰基肉碱C16:l(十六烷烯酰基肉碱)酰基肉碱C16:1-OH(羟基十六烷烯酰基肉碱)酰基肉碱C16:2(十六烷二烯基肉碱)酰基肉碱C16:2-OH(羟基十六烷二烯基肉碱)酰基肉碱C18(十八烷酰基肉碱)酰基肉碱C18:1(十八烷烯酰基肉碱)酰基肉碱C18:1-OH(羟基十八烷烯酰基肉碱)酰基肉碱C18:2(十八烷二烯基肉碱)酰基肉碱C2(乙酰基肉碱)酰基肉碱C3(丙酰基肉碱)酰基肉碱C3-OH(羟基丙酰基肉碱)酰基肉碱C3:1(丙烯酰基肉碱)酰基肉碱C4(丁酰基肉碱)酰基肉碱C4-OH(C3-DC)(羟基丁酰基肉碱)酰基肉碱C4:l(丁烯基肉碱)酰基肉碱C5(戊酰基肉碱)酰基肉碱C5-DC(C6-OH)(戊二酰基肉碱)酰基肉碱C5-M-DC(甲基戊二酰基肉碱)酰基肉碱C5-OH(C3-DC-M)(羟基戊酰基肉碱)酰基肉碱C5:l(甲基巴豆酰基肉碱，Tiglylcarnitine)酰基肉碱C5:1-DC(戊烯二酰基肉碱)酰基肉碱C6(C4:1-DC)(己酰基肉碱)酰基肉碱C6:l(己烯酰基肉碱)酰基肉碱C7-DC(庚二酰基肉碱)酰基肉碱C8(辛酰基肉碱)酰基肉碱C9(壬酰基肉碱)酰基肉碱丙氨酸氨基酸精氨酸氨基酸天冬酰胺氨基酸天冬氨酸氨基酸瓜氨酸氨基酸谷氨酸氨基酸谷氨酰胺氨基酸甘氨酸氨基酸组氨酸氨基酸异亮氨酸氨基酸亮氨酸氨基酸赖氨酸氨基酸甲硫氨酸氨基酸鸟氨酸氨基酸苯丙氨酸氨基酸脯氨酸氨基酸丝氨酸氨基酸苏氨酸氨基酸色氨酸氨基酸酪氨酸氨基酸缬氨酸氨基酸乙酰鸟氨酸生物胺氨基己二酸生物胺不对称的二甲基精氨酸生物胺肌肽生物胺肌酸酐生物胺多巴生物胺多巴胺生物胺组胺生物胺羟脯氨酸生物胺犬尿氨酸生物胺蛋氨酸亚砜生物胺硝基酪氨酸生物胺苯乙胺生物胺腐胺生物胺肌氨酸生物胺血清素生物胺亚精胺生物胺精胺生物胺对称性二甲基精氨酸生物胺牛磺酸生物胺总二甲基精氨酸生物胺己糖碳水化合物lysoPCaC14:0磷脂lysoPCaC16:0磷脂lysoPCaC16:l磷脂lysoPCaC17:0磷脂lysoPCaC18:0磷脂lysoPCaC18:l磷脂lysoPCaC18:2磷脂lysoPCaC20:3磷脂lysoPCaC20:4磷脂lysoPCaC24:0磷脂lysoPCaC26:0磷脂lysoPCaC26:l磷脂lysoPCaC28:0磷脂lysoPCaC28:l磷脂PCaaC24:0磷脂PCaaC26:0磷脂PCaaC28:l磷脂PCaaC30:0磷脂PCaaC30:2磷脂PCaaC32:0磷脂PCaaC32:l磷脂PCaaC32:2磷脂PCaaC32:3磷脂PCaaC34:l磷脂PCaaC34:2磷脂PCaaC34:3磷脂PCaaC34:4磷脂PCaaC36:0磷脂PCaaC36:l磷脂PCaaC36:2磷脂PCaaC36:3磷脂PCaaC36:4磷脂PCaaC36:5磷脂PCaaC36:6磷脂PCaaC38:0磷脂PCaaC38:l磷脂PCaaC38:3磷脂PCaaC38:4磷脂PCaaC38:5磷脂PCaaC38:6磷脂PCaaC40:l磷脂PCaaC40:2磷脂PCaaC40:3磷脂PCaaC40:4磷脂PCaaC40:5磷脂PCaaC40:6磷脂PCaaC42:0磷脂PCaaC42:l磷脂PCaaC42:2磷脂PCaaC42:4磷脂PCaaC42:5磷脂PCaaC42:6磷脂PCaeC30:0磷脂PCaeC30:l磷脂PCaeC32:l磷脂PCaeC32:2磷脂PCaeC34:0磷脂PCaeC34:l磷脂PCaeC34:2磷脂PCaeC34:3磷脂PCaeC36:0磷脂PCaeC36:l磷脂PCaeC36:2磷脂PCaeC36:3磷脂PCaeC36:4磷脂PCaeC36:5磷脂PCaeC38:0磷脂PCaeC38:l磷脂PCaeC38:2磷脂PCaeC38:3磷脂PCaeC38:4磷脂PCaeC38:5磷脂PCaeC38:6磷脂PCaeC40:l磷脂PCaeC40:2磷脂PCaeC40:3磷脂PCaeC40:4磷脂PCaeC40:5磷脂PCaeC40:6磷脂PCaeC42:0磷脂PCaeC42l磷脂PCaeC42:2磷脂PCaeC42:3磷脂PCaeC42:4磷脂PCaeC42:5磷脂PCaeC44:3磷脂PCaeC44:4磷脂PCaeC44:5磷脂PCaeC44:6磷脂SM(OH)C14:1鞘脂SM(OH)C16:1鞘脂SM(OH)C22:l鞘脂SM(OH)C22:2鞘脂SM(OH)C24:l鞘脂SMC16:0鞘脂SMC16:1鞘脂SMC18:0鞘脂SMC18:1鞘脂SMC20:2鞘脂SMC22:3鞘脂SMC24:0鞘脂SMC24:l鞘脂SMC26:0鞘脂SMC26:l鞘脂定义除非另有定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有如由本发明所属
技术领域：
的普通技术人员中的一员通常理解的相同含义。同样，除非另有说明，否则除了在权利要求之内，“或”的使用包括“和”并且反之亦然。非限制的术语不被解释为限制，除非明确地说明或上下文中另有清楚地表明（例如，“包括”、“具有”、和“包含”通常表明“包括但不限于”）。在权利要求中包括的单数形式例如“一个”、“一种”和“所述”包括复数的指代，除非另有明确地说明。为了帮助理解和准备本发明，提供了以下的说明性的、非限制性的例子。在此文档中，“轻度外伤性脑损伤”“mTBI”（其也可在文献中被称为轻度头部损伤或震荡伤）的定义，采用自美国康复医学会（AmericanCongressofRehabilitationMedicine,ACRM;JHeadTraumaRehabil1993;8(3):86-87），并且它指已经患有外伤地诱导的脑功能的生理性损坏的人，表现为以下中的至少一种：1.任何期间的意识丧失；2.对事件之前或之后的事件的任何记忆丧失；3.在该事件时的在精神状态上的任何改变（例如，感到眩晕、失去方向感、或神志不清）；以及4.局灶性神经学缺损，其可以是瞬时的或可以不是瞬时的；但其中损伤的严重程度不会超过以下：失去意识接近30分钟或更短；在30分钟后，初始的格拉斯哥昏迷量表（GCS）为13-15；以及外伤后健忘症（PTA）不大于24小时。此定义包括：1.头部被撞击，2.头部撞击物体，以及3.脑部经历了加速/减速运动（即鞭击）而没有对头部造成直接的外部创伤。计算机断层扫描、核磁共振成像、脑电图、近红外光谱、正电子放射断层扫描或常规神经学评估可以是正常的。由于医疗应急的缺乏或某些医疗系统的现实，一些患者在急性阶段中可能没有将上述因素进行医学记录。在这样的病例中，考虑症状学是恰当的，当联系至外伤性脑损伤时，其可以表明mTBI的存在。“非外伤性脑损伤”（非TBI）包括可能是以下的结果的脑损伤：中风、中毒、心理困扰、化学品、感染、炎症、自身免疫性疾病、退行性过程、缺氧、缺血、代谢紊乱和癌症/辐射。在本文中，“轻度外伤性脊髓损伤”“mTSI”的定义是具有一种或多种可随时间解决的脊髓症状的不完全性损伤（例如，肠或膀胱控制的丧失，血压和体温的不良调节、疼痛、感知不良、身体姿势不佳、性功能障碍等）。mTSI的起因可以包括挫伤、拉伸过度、和部分脊柱横断。“非外伤性脊髓损伤”（非TSI）包括可能是以下的结果的脊髓损伤：中风、中毒、心理困扰、化学品、感染、炎症、自身免疫疾病、退行性过程、缺氧、缺血、代谢紊乱和癌症/辐射。“代谢组（metabolome）”指在生物细胞、组织、器官或有机体中的全部代谢物的集合，其是细胞进程的终产物。“代谢组”包括脂质组（lipidome）、糖、核苷酸和氨基酸。脂质组是在生物细胞、组织、器官或有机体中的完整的脂质图谱。“代谢组学图谱分析”是指在生物标本或样品中的小分子代谢物的表征和/或测量，所述标本或样品包括细胞、组织、器官、有机体或其任何衍生部分以及液体（例如血液、血浆、血清、唾液、滑液、尿液、支气管肺泡灌洗液和组织提取物等）。代谢物图谱可以包括例如在样品中存在的小分子的数量和/或种类的信息。本领域的普通技术人员将知晓，必要的和/或足够的信息将根据“代谢物图谱”的预期用途而变化。例如，可以使用单一的技术确定用于某一预期用途的“代谢物图谱”，但是可能需要使用几种不同的技术以用于其他的预期用途，这取决于以下因素：涉及的疾病状态、在特定靶定的细胞区室中存在的小分子的类型、被检测的细胞区室本身、等等。根据被编译的信息（例如光谱）的预期用途，在“代谢物图谱”中的相关信息也可以变化。例如对于某些预期用途，特定的代谢物或特定类别的代谢物的数量可以是相关的，但对于其他用途，代谢物的类型的分布可以是相关的。可以通过几种方法生成代谢物图谱，例如HPLC、薄层色谱（TLC）、电化学分析、质谱（MS）、折射率光谱（RI）、紫外光谱（UV）、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱（近IR）、核磁共振（NMR）、荧光光谱、双偏振干涉、计算方法、光散射分析（LS）、气相色谱（GC）、或与MS结合的GC、与LC-MS/MS结合的直接注入（DI）和/或本领域已知的其他方法或方法的组合。术语“小分子代谢物”包括有机和无机的分子，其存在于细胞、细胞区室、或细胞器中，通常具有低于2000或1500的分子量。该术语不包括大大分子，例如大蛋白（例如分子质量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的蛋白）、大核酸（例如分子质量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的核酸）、或大多糖（例如分子量超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的多糖）。细胞的小分子代谢物通常被发现游离在细胞质或在其他细胞器（例如线粒体）中的溶液中，其中它们形成了可以被进一步代谢或用于生产大分子（称为高分子）的中间体的池。术语“小分子代谢物”包括在将源于食物的能量转化为可用的形式的化学反应中的信号分子和中间体。小分子代谢物的例子包括磷脂、甘油磷脂、脂质、缩醛磷脂、糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、在细胞进程期间形成的中间体、异构体和在细胞内发现的其他小分子。在一个实施方式中，本发明的小分子是被分离的。优选的代谢物包括脂质和脂肪酸。如本文所用的术语“对象”，是指动物界的全部成员，包括哺乳动物，优选人类。如本文所用的术语“患者”，是指被怀疑患有中枢神经系统的获得性损伤（ACNSI）的对象。在本文中，ACNSI包括获得性脑损伤（ABI）以及获得性脊髓损伤（ASI）。这些损伤可以是外伤性的（mTBI和mTSI）以及非外伤性的（非TBI和非TSI）。mTBI包括震荡伤和冲击伤，包括冲击超压波损伤。非TBI包括电诱导的脑损伤（电击）、惊厥诱导的脑损伤、手术诱导的脑损伤、中风诱导的脑损伤、中毒诱导的脑损伤、心理性脑损伤、化学性脑损伤、感染性脑损伤、缺血性脑损伤、代谢性脑损伤、炎症性脑损伤、自身免疫性脑损伤、退行性脑损伤、缺氧性脑损伤以及癌症/辐射诱导的脑损伤。mTSI包括脊髓震荡、拉伸和/或部分的横断，并且非TSI包括椎间盘疾病、电、中风、中毒、化学品、感染、缺血、代谢、炎症、自身免疫、退行性、缺氧以及癌症/辐射诱导的脊髓损伤。概述本发明涉及在诊断获得性中枢神经系统（ACNSI）中的代谢组学图谱分析的应用，所述ACNSI包括ABI和ASI。ABI包括mTBI和非TBI。ASI包括mTSI和非TSI。对于脑和脊髓的外伤性损伤可包括震荡伤和冲击伤，包括冲击超压波损伤以及脊髓挫伤、拉伸和/或部分横断。非外伤性损伤（非TBI和非TSI）可以包括电诱导的（电击）、惊厥诱导的、手术诱导的、中风、中毒、心理困扰、化学品、感染、炎症、自身免疫疾病、退行性进程、低氧、缺血、代谢紊乱以及癌症/辐射（同样，对于非TSI为椎间盘疾病）。本发明还涉及在对象中诊断ABI（例如mTBI和非TBI）以及ASI（例如mTSI和非TSI）中的单一的生物标记物。申请人发现，代谢物图谱分析以相对高度的确定性识别了ACNSI的形式。截至本发明之日，本发明的方法的预测能力可能是至今用于mTBI诊断的最好的生物学测试。本发明的方法和计算机程序可以被用在现场即时（point-of-care）代谢组学测试中，该测试使用生成代谢物图谱的可携带的桌面/台面的或手持的设备。代谢组学图谱分析因为代谢物以非常宽的浓度范围存在并且展现了化学多样性，没有仪器可以在单次分析中可靠地测量在非人类或人类代谢组中的全部的代谢物。相反，代谢组学图谱分析的实践者通常使用一套仪器，其大多数通常涉及与MS结合的液相色谱（LC）或气相色谱（GC）的不同组合，以获得宽的代谢物覆盖。[Circulation.2012;126:1110-1120]。尽管在本发明中使用了NMR和直接注入LC-MS/MS（DI/LC-MS/MS）代谢图谱分析，应当理解的是，也可以使用其他的仪器，例如电化学分析、RI、UV、近-IR、LS、GC等。采用无监督的维数降低技术，单独地分析从已知患有mTBI和非mTBI个体（“对照”或“正常”）获得的NMR和DI-LC-MS/MS代谢图谱；使用有监督的机器学习方法，构建mTBI预测分类器。具体地：将从生物学标本获得的原始的DI-LC-MS/MS和/或NMR数据标准化，并且进行主成分分析（PCA）以及t分布随机邻域嵌入（t-distributedstochasticnearestneighborembedding,t-SNE）中的一种或两种。在PCA的所有情况中，首要的10个特征向量解释了超过80%的方差，所以丢弃了尾部的特征向量。将在前10个特征向量中的代谢物载荷进行记录，并且将每一个对象投影进PCA空间以检查对象-成分载荷。领先的2个（或3个）成分的二维和三维散点图显示了mTBI对比对照对象的强的集群（图1和图4）。基于此结果的强度，训练线性核支持向量机（SVM），以从输入的代谢图谱中分类mTBI对象。进行分类器的10倍交叉验证，其在单独的DI-LC-MS/MS原始数据上产生的准确度大于约80%，并且在代谢物数量减少的单独的DI-LC-MS/MS数据上为约90-92%之间，在单独的NMR数据上的准确度大于约65%，并且在结合的DI-LC-MS/MS和NMR数据上的准确度为约92%。最后完成在每一对患者的代谢图谱之间的皮尔森积矩系数，以生成相关矩阵。在该相关矩阵中可见清晰的结构，所以在该矩阵上进行完全连锁层次聚类，其有效地将个体群集成“mTBI”组、“非mTBI”组以及小异构组。基于人类患者的血浆代谢组学图谱分析（DI-LC-MS/MS和NMR一起、或单独的DI-LC-M/MS），预测mTBI的确定性大约为92%。可以开发现场即时测试（例如桌面MS）来识别ABI（包括mTBI和非TBI）患者，以及来预测他们的脑损伤。因此，在一个实施方式中，本发明提供了在对象中诊断或预测ACNSI（包括获得性脑损伤（ABI）和获得性脊髓损伤（ASI））的方法。所述方法可以包括以下步骤：（a）从所述对象获得代谢物图谱；以及（b）使用多变量统计分析和机器学习，以将所述对象的图谱与ACNSI损伤的代谢物图谱的预设集和非ACNSI（称为“对照”或“正常”）的代谢物图谱的预设集进行比较，以确定或诊断所述患者是否患有ACNSI损伤或预测所述ACNSI。可以为经诊断的ABI病例（包括mTBI和非TBI）建立代谢物图谱的资料库（library）。例如，以下的代谢图谱的资料库：震荡伤，在冲击诱导的外伤性脑损伤中的原发性冲击伤，电诱导的脑损伤（电击），惊厥诱导的脑损伤，手术诱导的脑损伤，中风诱导的脑损伤，中毒诱导的脑损伤，心理性脑损伤，化学性脑损伤，感染性脑损伤，缺血性脑损伤，代谢性脑损伤，炎症性脑损伤，自身免疫性脑损伤，退行性脑损伤，缺氧性脑损伤，和癌症/辐射诱导的脑损伤，以及任何其他可能形式的ABI。可以使用此资料库作为ABI的代谢图谱的预设集。相似地，可以为经诊断的ASI病例建立资料库，以获得ASI的代谢图谱的预设集。可以从已知没有患有ABI和/或ASI的形式的对象中获得正常代谢图谱的预设集。使用多变量统计分析和机器学习，可以将所述对象的图谱与ABI/ASI的代谢物图谱的预设集和非ABI/非ASI（称为“对照”或“正常”）的代谢物图谱的预设集进行比较，以不仅确定所述患者是否患有ABI/ASI，而且还确定所述的ABI/ASI的类型（即，震荡伤、在冲击诱导的外伤性脑损伤中的原发性冲击伤、电诱导的脑损伤（电击）、惊厥诱导的脑损伤、手术诱导的脑损伤、中风诱导的脑损伤、中毒诱导的脑损伤、心理性脑损伤、化学性脑损伤、感染性脑损伤、缺血性脑损伤、代谢性脑损伤、炎症性脑损伤、自身免疫性脑损伤、退行性脑损伤、缺氧性脑损伤以及癌症/辐射诱导的脑损伤等）以及预后。可以在计算机产品（记忆棒、作为手持设备（例如平板和移动电话等）的应用）中提供预设的图谱（ABI、ASI和对照）的资料库，或它们可被上传至计算机系统的内存，该计算机系统包括大型机、台式机、笔记本电脑、手持设备（例如平板和移动电话）。可以从被怀疑患有ABI和/或ASI的患者中取得血液或任何其他体液，例如全血、血浆、血清、唾液、滑液、尿液、脊髓液、支气管肺泡灌洗液、泪液、汗液和提取物等。可以使用任何已知技术（例如高效液相色谱、薄层色谱、电化学分析、质谱（MS）、折射率光谱、紫外光谱、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱、核磁共振（NMR）、光散射分析、气相色谱（GC）、或与MS结合的GC、与LC-MS/MS结合的直接注入（DI）等），从该对象的液体中获得代谢物图谱。然后可以将该对象的代谢物图谱上传至计算机系统（大型机、台式机、笔记本电脑、手持设备等）。然后操作者可以使用多变量统计分析和机器学习，将该对象的图谱与ABI和/或ASI的代谢物图谱的预设集和非ABI/非ASI（称为“对照”或“正常”）的代谢物图谱的预设集进行比较，以不仅确定所述患者是否患有ABI和/或ASI，而且还确定ABI和/或ASI的类型、或治疗是否有效。该操作者可以选择多变量分析和机器学习的类型。恢复至正常的代谢组学图谱可以作用来协助追踪受ABI、ASI、mTSI、非TSI、mTBI和/或非TBI影响的个体的医疗干预（包括康复治疗），并且引导恢复至在ABI前/在ASI前的玩乐、学校、工作和/或日常活动。因此，在另一个实施方式中，本发明是在ACNSI患者（包括mTSI患者、非TSI患者、mTBI患者和非TBI患者）中跟踪或追踪医疗干预（包括康复治疗）的效率的方法，所述方法包括：（a）在医疗干预（包括康复治疗）期间在不同时间从所述患者中获得代谢物图谱；以及（b）使用多变量统计分析和机器学习，以将在所述不同时间中的每一个期间或之处的所述患者的图谱与ACNSI的代谢物图谱的预设集和非ACNSI（正常对照）的代谢物图谱的预设集进行比较，以追踪在所述患者中的医疗干预的效率。恢复至所述患者的正常代谢组学图谱可以作用来评估所述患者的所述医疗干预（包括康复治疗）是否已经成功。在一个实施方式中，本发明是评估人类ACNSI（包括mTBI和非TBI以及mTSI和非TSI）的非人类动物模型的方法。所述方法可被用于确定最能代表人类情况的动物模型，其对于治疗干预和发现是有用的。在一个实施方式中，所述方法可以包括：（a）从ACNSI的非人类动物模型中获得代谢物图谱；以及（b）使用多变量统计分析和机器学习，以将所述非人类动物模型图谱与人类ACNSI的代谢物图谱的预设集和人类非ACNSI的代谢物图谱的预设集进行比较，以确定所述非人类动物是否患有ACNSI。如果其被分类为ACNSI，则所述非人类动物模型可以被认为是人类ACNSI的准确的、可靠的并且可重复的模型。如果其被以预设的准确度或确定性分类为ACNSI，则所述非人类动物模型可以是人类ACNSI的模型。为了帮助理解和制备本发明，提供了下述说明性的、非限制性的实施例。实施例实施例1材料和方法韦仕敦大学（WesternUniversity）人类研究道德委员会批准了此研究。从法定监护人获得了知情同意书，并且从青少年对象获得了同意书。对象招募：招募了来自加拿大安大略省西南部的男性青少年冰上曲棍球运动员（雏量级，年龄12-14岁）来参加此研究。为了帮助招募，在冰上曲棍球城市阿瑞纳斯展示了研究的信息海报以及阿瑞纳斯官方的同意书，并且已经对几个地区的曲棍球董事会和教练做了口头陈述。对在韦仕敦大学福勒肯尼迪运动医学诊所的首诊医生处出现疑似震荡伤的青少年曲棍球运动员进行筛选并且取得了同意。当在典型的震荡症状发病之后观察到损伤机制并且没有结构性损伤时，诊断为运动震荡伤。对照对象是年龄、性别和活动匹配的未受伤的曲棍球球员，并且其过去没有遭受过震荡伤。排除具有已知的神经损害或疾病的任何对象。在招募后，对全部研究对象分配用于识别的随机的研究编号。没有使用进一步的对象标识以保护身份。有震荡伤的对象和对照对象（包括他们父母/监护人）完成了运动震荡评估工具-第三版[SCAT3，13-14岁的年龄；(Guskiewiczetal.,2013)]或儿童-SCAT3[被推荐用于12岁年龄的儿童或年轻人的改进的工具，其考虑了在表现中的发展差异(Glavianoetal.,2015)]。具有在震荡伤管理中的专业知识的运动医学医师使所有受伤的运动员经历了完整的病史、身体和神经系统检查。所述受伤的运动员被提供了由初级保健运动医学医师引导的用于震荡伤的标准化照料。在首次就诊时，由认证的抽血者、护士或临床医生抽取所有对象20ml的血液进入EDTA真空采血管。该血液被离心，然后等分血浆并储存在-80°C。DI-LC/MS/MS使用直接注入质谱(AbsolutelDQ™Kit)和反相LC/MS/MS试剂盒(BIOCRATESLifeSciencesAG,Austria)的组合，将靶标的定量的代谢组学方法应用来分析血浆样品。此试剂盒，与ABI4000Q-Trap(AppliedBiosystems/MDSSciex)质谱仪结合，可以被用于多达180种不同的内源性代谢物的靶标的识别和定量，所述代谢物包括氨基酸、酰基肉碱、生物胺、甘油磷脂、鞘脂和糖。所述方法将分析物的衍生化和提取与使用多反应监测对的选择性的质谱检测结合。将同位素标记的内部标准品和其他的内部标准品整合在所述试剂盒板式过滤器中用于代谢物定量。所述AbsolutelDQ试剂盒含有具有用密封带连接的过滤板的96深孔板、以及用于准备板分析的试剂和溶剂。将在试剂盒中的开始的14个孔用作每一个试剂盒提供的1个空白、3个零样品、7个标准品以及3个质量对照样品。使用AbsolutelDQ试剂盒方案，根据用户手册，分析全部的血浆样品。简要地，在冰上解冻血浆样品，然后涡旋并在13,000xg离心。将每一个血浆样品（10μL）加载在上部的96孔试剂盒板上的过滤器的中心上，并且在氮气流中干燥。随后，加入20μL的5%异硫氰酸苯酯的溶液用于衍生化。在孵育后，使用蒸发器再次干燥过滤点。然后通过加入含有5mM醋酸铵的300μL甲醇，实现代谢物的提取。通过离心进入下部的96深孔板中以获得提取物，然后使用试剂盒MS运行溶剂进行稀释。在装备了溶剂输送系统的API4000Qtrap®串联质谱仪器(AppliedBiosystems/MDSAnalyticalTechnologies,FosterCity,CA)上执行质谱分析。先后通过LC和DI，将样品输送至质谱仪。从样品登记至代谢物浓度的自动计算，使用BiocratesMetlQ软件来控制整个分析的工作流程。使用靶标的图谱分析方案，使用多反应监测、中性丢失和前体离子扫描，来定量地筛选已知的小分子代谢物。NMR如前所述，通过超滤将血浆样品脱去蛋白质(Psychogiosetal,2011)。在过滤之前，每次用0.5mL的H2O冲洗5次3KDa拦截离心过滤器单元(AmiconMicroconYM-3)，然后离心（10,000rpm，10分钟），以去除结合至过滤器膜的残留甘油。然后将等分的每一个血浆样品转移进入该离心过滤器装置，并且离心（10,000rpm，20分钟），以从该样品中移除高分子（主要蛋白和脂蛋白）。目视检查该滤液的膜受损的任何证据，并且对于这些样品，用不同的过滤器重复过滤过程并且再一次检查滤液。收集随后的滤液并且记录体积。如果样品的总体积小于600μL，则从50mMNaH2PO4缓冲液（pH7.0）加入适当的量，直到样品的总体积为600μL。将不得不加入缓冲液来使溶液体积变为600μL的任何样品注释稀释因子，并且在随后的分析中校正代谢物浓度。随后，将70μl的D2O以及30μl的标准缓冲液（11.7mMDSS（2,2-二甲基-2-硅氧烷戊烷-5-磺酸二钠）、730mM咪唑、和0.47％在H2O中的NaN3）加入至样品。然后将血浆样品(700μL)转移至标准的NMR试管，用于随后的光谱分析。在500MHzInova(VarianInc.PaloAlto,CA)光谱仪上收集所有1H-NMR光谱，所述光谱仪装备有5mmHCNZ-梯度脉冲场梯度室温探针。在25°C使用NOESY-预饱和脉冲序列的第一个瞬态获取1H-MR光谱，选择它的高度的定量精度(Saudeetal,2006)。全部FID（自由感应衰减）被零填充（zero-filled）至64K数据点，并且进行0.5Hz的谱线增宽。使用由DSS甲基基团生成的单谱线（singlet）作为内部标准以用于化学位移参考（设为0ppm），并且为了进行定量，使用ChenomxNMRSuiteProfessionalSoftwarepackageversion7.1(ChenomxInc,Edmonton,AB)处理及分析全部的1H-MR光谱。通过将光谱特征从内部数据库手动地拟合至光谱，ChenomxNMRSuite软件允许NMR光谱的定性和定量分析。具体地，使用标准的Chenomx500MHz代谢物资料库，完成对于代谢物的光谱拟合。通常地，90%的可见峰被分配至化合物，并且使用Chenomx光谱分析软件可以常规地拟合超过90%的光谱面积。用化合物名字注释大部分的可见峰。之前已经示出了，此拟合过程提供了90%或更好的绝对浓度准确度。通过至少两个NMR光谱学者评估和分析每一个光谱，以最小化化合物错误识别及错误定量。我们使用样品尖峰（samplespiking）来确认指定化合物的身份。样品尖峰涉及加入20-200μΜ的被怀疑的化合物并检查生成的光谱，以确定相对的NMR信号强度是否如预期改变。数据分析人口统计学和震荡伤工具数据被报道为平均值±标准偏差（SD），将P值<0.05当作我们的统计学显著性的标准。提取每一个对象的原始的NMR和MS数据，并且在对象之间在每一个代谢物标记物之内进行标准化。更具体地，调节每一个代谢的标记物的数据以具有单位标准。最初的探索性分析涉及通过代谢物矩阵直接在对象上执行主成分分析（PCA）。由数据的固有维度明显低于代谢标记物的数量这一观察结果所驱动，使用了t分布随机邻域（t-SNE）嵌入算法(vanderMaatenandHinton,2008)在完整数据矩阵上执行非线性的维数降低。与强行进行数据的脆弱的、正交的、线性的重构的PCA不同，t-SNE假定数据的“最优”的代表存在于这样的流形上，该流形具有复杂的几何形状、但是维度低、被嵌入原始数据的完整维度空间中。使用t-SNE将完整的代谢数据集降低至仅二维。然后我们在维数降低并且完整的数据集上训练单独的支持向量机(SVM)（其具有线性核），以将对象分类为有震荡伤的或非震荡伤。我们使用留一法交叉验证了我们的分类器，并且针对通过重新采样生成的零分布评估了统计学显著性。为了调查该被训练的分离器的稳健性，生成了接受者操作特征（ROC）曲线；对4倍交叉验证的方法的每一倍生成一个曲线，其中在数据的亚集上训练用于每一倍的分类器，然后在未被用于训练的不相交的、保留的亚集上进行测试。所述ROC曲线描绘了该分类器的真阳性率与假阳性率；图的左上角是“理想的”并且主对角线会被仅仅在标签上随机猜测的分类器占据。结果代谢组学分析来自男性青少年冰上曲棍球球员的血浆：12例有震荡伤（13.4±2.3岁的年龄）以及17例非损伤的对照（12.9±1.0岁的年龄；P=0.213）。从震荡伤发生到首诊时的抽血的预估的时间是2.3±0.7天。根据SCAT3（n=11）的自我报道的症状评估揭露的的总的症状评分以及总的症状严重程度分别为11.6±4.8和29.3±22.8（表1）。使用儿童SCAT评估了一个震荡伤的患者，并且其总的症状评分为6以及总症状严重程度为12。使用SCAT3（n=17）评估全部非损伤对照，其揭露的总的症状评分以及总的症状严重程度分别为0.5±1.5和0.6±1.8。通过DI/LC-MS/MS（表2）和NMR（表3），分别地测试血浆的143种和31种代谢物。PCA使用PCA，证明了首要的10个成分解释了数据中82%的方差，10个成分中的每一个被加权到许多下面的代谢物上（表4）。最引人注目的观察是在震荡伤的和非震荡伤的对象之间血浆中的甘油磷脂的较高的方差。t-SNE使用t-SNE使完整的代谢数据集下降至二维，因为该数据的固有维度显著低于代谢物的数量（图1）。在此维数降低步骤之后，训练支持向量机（SVM）（其具有线性核），以将对象分类为震荡伤的或非震荡伤的。使用留一法的分类器的交叉验证证明了在青少年冰上曲棍球球员中诊断震荡伤精确度为92%。将分类准确度作为我们的检验统计量，我们通过排列检验调查了我们观察的准确度的显著性。我们通过对分类标签进行随机混排；对每一个混排的标签集训练和测试新分类器；并且记录分类率，生成了零分布。将我们观察到的92%准确度与10,000例样品的零分布进行比较，其中零分类器都没有达到92%的准确度，我们计算出p＜0.0001。然后我们将实现合理的分类准确度所需的代谢物的数量最小化。使用卡方检验从而以单变量方式来选择信息化的代谢物，我们通过仅17种代谢物继续观察到了92%的分类准确度（表5，栏1）。然后使用回归特征消除来证实准确度，然后使用31种代谢物得到了90%的相似的分类准确度（表5，栏2）。作为最终步骤，我们通过其代谢组学图谱的直接比较，将震荡伤和非震荡伤的对象进行群集。我们计算了每一对（正常的）对象代谢图谱的皮尔逊积矩相关系数，以生成相关矩阵。使用聚集的完全连锁层次聚类（图2），在该相关矩阵中最佳地识别集群。通过SVM在4倍交叉验证上生成了接受者操作曲线（图3），证明了当鉴别力阈变化时二元分类器的性能，并且生成了0.91的平均ROC。表1.通过SCAT3进行的症状评估（由于进行了儿童SCAT，1例患者未示出）**1例患者未显示，因为他们通过儿童SCAT3进行了症状评价，（经报道的症状：难以集中；I幻想过多；头疼；头晕；很累；并很容易疲倦）。表2.DI-LC/MS/MS（143个代谢物）。表3.NMR（31个代谢物）2-羟基丁酸盐丙二醇3-羟基丁酸盐丙酮酸盐3-羟基异戊酸盐丝氨酸醋酸盐琥珀酸盐丙酮苏氨酸丙氨酸酪氨酸甜菜碱缬氨酸肉碱柠檬酸盐肌酸肌酸甲酸盐葡萄糖谷氨酰胺甘油甘氨酸组氨酸异亮氨酸乳酸亮氨酸赖氨酸甲醇苯并氨酸脯氨酸表4:PCA识别了10个首要成分（“Comp.”）的每一个的前10个加权代谢物表4(续)表5.相似的分类准确度，使用两种独立的分析技术，用更少的代谢物获得。在此研究中，我们在震荡伤的青少年冰上曲棍球球员以及匹配的对照上执行了代谢组学图谱分析。使用多变量统计分析和机器学习，我们预测的震荡伤的个体的确定性高达92%。观察到的最引人注目的模式之一是该模型在血浆甘油磷脂的改变上的可靠性，其解释了在震荡伤和非震荡伤的对象之间接近50%的方差。用机器学习的代谢组学图谱分析是新的具有高敏感性的诊断方法。我们具体地调查了在青少年冰上曲棍球球员中的震荡伤。在我们的区域，青少年男性具有最高的震荡伤风险，并且在冰上曲棍球竞技场的运动相关的活动中最经常被震荡(Stewartetal.,2014)。由于青少年患者的脑仍在发育中，所以在这些青少年患者中的震荡伤是特别关注的(Halsteadetal.,2010;Toledoetal.,2012)。由于头盖骨更薄、颈部肌肉更弱、髓鞘形成更少、脑含水量更多、代谢需求更高、蛛网膜下腔（其中脑可以更自由地移动）更大，更年轻的患者更易受到损伤影响(Karlin,2011;Morrisonetal.,2013)。随后，震荡伤的发生率在年轻人中更高，并且相对于成年人复原的时间更长(Lovelletal.,2004;Pellmanetal.,2006)。事实上，脑损伤通过打断智力发展和社会发展对于青少年可以具有终生后果(Toledoetal.,2012)。因为适当的早期治疗和康复服务的迅速部署可能会终生改变这个弱势群体的生活，所以精准的震荡伤诊断对于青少年是特别重要的。目前，震荡伤的诊断仅仅基于临床判断。在我们的研究中通过具有典型的震荡伤症状的损伤机制诊断震荡伤患者。用SCAT3、或用于一个12岁对象的儿童SCAT3评估患者，因为它们对于这些年龄组是推荐的震荡评估工具(Guskiewiczetal.,2013;Glavianoetal.,2015)。基于自我报道症状的平均数量和症状严重程度评分，我们的数据表明了我们的受震荡伤的男性运动员的轻中度症状的严重程度。再者，据我们所知，我们的研究是报道用于非损伤的青少年男性运动员的规范的SCAT3值的首次研究。由于评估的主观性，症状的自我报道是复杂的，并且运动员通常少报道了症状(LovellandSolomon,2013;Meieretal.,2015)。震荡伤诊断学仍然存在问题，其中临床判断作为金标准(McCroryetal.,2013)。因此已经主动寻找诊断性血液生物标记物（例如GFAP、Tau、NFL）。尽管有许多研究，但是没有单一的生物标记物或生物标记物组已经被识别用于广泛诊断学，这可能是由于不适当的敏感性、特异性或重复性(Jeteretal.,2013)。单一的生物标记物或数量较少的生物标记物不能准确地反应患者以及发生在脑外伤中的损伤异质性。额外的关注涉及与震荡伤的可变定义比较的个别的生物标记物、涉及常见临床和生物标记物相关的数据元素的不一致的使用、涉及结果测量的可变时间以及涉及缺乏对个体时域剖面线的理解(Papaetal.,2015)。我们的代谢组学图谱分析，检查了174个代谢物并且分类准确度仅需少至17个代谢物，可以有用于开发未来的现场即时测试以及用于未来的震荡伤诊断学的决策支持系统（即网络界面）。常规的数据是模型驱动的，它们基于以下假设：存在相对小数量的重要变量、以及精心的变量选择是好的模型表现的关键。此方法已经提供了群体的重要的临床信息，但是对于理解个体中的疾病来说显著地受到限制。对常规数据的补充是机器学习，其通过检测潜在模式让该数据创建模型(Shouvaletal.,2014)。代谢组学理想地适用于机器学习技术，因为模型的最终表现依赖于每一个数据集包含多少信息。代谢组学图谱分析需要同时分析所有被检测的代谢物，其中最常用的是PCA分析技术(Bujaketal.,2014)。与强行进行数据的脆弱的、正交的、线性的重构的PCA不同，t-SNE假定数据的“最优”的代表存在于这样的流形上，该流形具有复杂的几何形状、但是维度低、被嵌入原始数据的完整维度空间中(vanderMaatenandHinton,2008)。一旦在降低的2维空间中描绘了个体对象，就可看到t-SNE维数降低步骤的作用。使用前述的分析，我们确定了在震荡伤和非震荡伤对象之间的代谢物上的变化对于甘油磷脂是最明显的。甘油磷脂是动态的分子，其根据它们在细胞膜内的结构、组合物和定位以不同的速率翻转。至于脑，甘油磷脂占了25%的干重，并且大量地集中在髓磷脂(Farooquietal.,2000)。甘油磷脂调节膜流动性和渗透性，并且它们是各种第二信使的储存库。甘油磷脂的降解通过磷脂酶发生。一旦将代谢物数量减少，但仍保持高的分类准确度，则最具信息的是胆碱甘油磷脂以及若干的胆碱缩醛磷脂（例如PCaeC34:0、PCaeC34:3、PCaeC36:0、PCaeC36:l、PCaeC36:2、PCaeC38:l、PCaeC38:2和PCaeC38:3）。缩醛磷脂在髓磷脂中具有显著的数量，>70%的髓磷脂甘油磷脂是缩醛磷脂(BravermanandMoser,2012)。缩醛磷脂被认为具有几种功能，其包括帮助膜结构、作为膜抗氧剂使用以及作为第二信使分子的来源。在分类准确度上，酰基肉碱C5也具有突出的作用。C5的作用是复杂的，并且涉及能量代谢、脂肪酸运输和线粒体脂肪酸氧化、酮症、氧化应激和线粒体膜损伤。C5在支链氨基酸亮氨酸和异亮氨酸的分解代谢期间产生。C5酰基肉碱的升高可能是在异戊酰-CoA脱氢酶和短/支链酰基-CoA脱氢酶的水平的阻断的指标。其他用于精准分类的重要的代谢物包括腐胺、甲醇、甲酸盐和琥珀酸盐。将后者的这些代谢物拿到一起，这些发现表明了在这些年轻运动员震荡后在脑能量代谢中的急性改变(Sikogluetal.,2015)。大多数的信息性代谢物（例如甘油磷脂）聚集成代谢物组。尽管如此，开发统一的理论很难。被识别的代谢物可以反映对原发性震荡损伤的次级后果，或原发性震荡伤本身可以具有次级代谢影响。使用TBI的动物模型的进一步的实验可以是信息化的，其中并行地分析脑和血浆。代谢物的标准化可以反映组织愈合及复原，并且帮助引导震荡伤康复以及安全地回归玩乐和其他日常活动。提供客观的代谢组学恢复措施，有很大的潜力加强脑震荡伤的管理，其进一步标准化了回归玩乐和回归学习实践，这超出了立法和政策目前能够提供的。这可以使运动员免于过早回归活动，其可导致重复震荡伤、其他损伤和症状延长的风险增加(Harmonetal,2013)。最后，临床判断实际上是用于震荡伤诊断的“金标准”，并且因此震荡伤在有震荡伤的群组中可能已经被过度诊断。同样，在“对照”组中以前的震荡伤可能已经被错过，而亚临床的脑损伤将不能被准确地呈现。总之，使用血浆代谢组图谱分析，连同多变量统计分析与机器学习一起，我们识别有震荡伤个体的确定性为92%。在所使用的两种分析技术NMR及DI-LC/MS/MS之中，用串联的MS测量的代谢物似乎提供更好的预测能力。事实上，大多数被观察到的在组之间的变化是由于血浆中的甘油磷脂及C5的改变。代谢组学图谱分析代表了mTBI的新诊断方法，并且其适于现场即时的代谢组测试。用于实施例1的参考文献BravermanNE,MoserAB.Functionsofplasmalogenlipidsinhealthanddisease.BiochimBiophysActa2012;1822(9):1442-52.BujakR,Struck-LewickaW,MarkuszewskiMJ,KaliszanR.Metabolomicsforlaboratorydiagnostics.Journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis2014.FarooquiAA,HorrocksLA,FarooquiT.Glycerophospholipidsinbrain:theirmetabolism,incorporationintomembranes,functions,andinvolvementinneurologicaldisorders.Chemistryandphysicsoflipids2000;106(1):1-29.GlavianoNR,BensonS,GoodkinHP,BroshekDK,SalibaS.BaselineSCAT2AssessmentofHealthyYouthStudent-Athletes:PreliminaryEvidencefortheUseoftheChild-SCAT3inChildrenYoungerThan13Years.ClinJSportMed2015;25(4):373-9.GuskiewiczKM,Register-MihalikJ,McCroryP,McCreaM,JohnstonK,MakdissiM,etal.Evidence-basedapproachtorevisingtheSCAT2:introducingtheSCAT3.BrJSportsMed2013;47(5):289-93.HarmonKG,DreznerJA,GammonsM,GuskiewiczKM,HalsteadM,HerringSA,KutcherJS,PanaA,PutakianM,RobertsWO.AmericanMedicalSocietyofSportsMedicinepositionstatement:Concussioninsport.BritishJournalofSportsMedicine.2013;47(1):1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5）。在维数降低步骤后，训练具有线性核的SVM，以将大鼠分类为冲击伤或对照。使用留一法的我们的分类器的交叉验证，证明了在从对照大鼠中识别原发性冲击中的准确率高达86%（范围80-86%）（11-倍交叉验证）。图6是两两比较在对象之间的代谢物图谱的皮尔逊积矩相关系数。图7阐明了在图6的距离矩阵上的层次聚类。图6的层次聚类显示了在其左边的较大的集群，该集群全部为对照（C）。在右边上的更大的集群主要是冲击伤（B），但也有少量对照。在图6和7中的标签0-15是冲击伤大鼠，16-31是对照大鼠。将分类准确度作为我们的检验统计量，我们通过排列检验调查了我们观察的准确度的显著性。我们通过对分类标签进行随机混排；对每一个混排的标签集训练和测试新分类器；并且记录分类率，生成零分布。使用置换法生成的1000个零分布得到p<0.0001的80%（保守的）分类率。表6:PCAl."Com."=成分。实施例3-预后代谢组学分析来自三组的参与者的血浆：（1）具有第一次震荡伤的参与者，（2）具有两个或多个被报道的震荡伤的参与者，以及（3）没有震荡伤病史的对照参与者。将全部的震荡伤的和非震荡伤的对照进行临床评估，以确定震荡伤症状和严重程度。还根据被接受的标准的诊断标准，评估参与者。通过DI/LC-MS/MS和MR，分析血浆的代谢物。PCA使用PCA，证明了首要的10个成分解释了在数据中的方差的大部分，该10个成分的每一个被加权至许多下面的代谢物。t-SNE使用t-SNE，将全部的代谢数据集降低至二维，因为该数据的固有维度显著低于代谢物的数量。在此维数降低步骤之后，训练支持向量机（SVM）（其具有线性核），以将对象分类为震荡伤或非震荡伤的。使用留一法的分类器的交叉验证，证明了在诊断首次震荡伤与多次震荡伤中的高百分比的准确度。将分类准确度作为我们的检验统计量，可以通过排列检验来测试准确度的显著性。通过对分类标签进行随机混排；对每一个混排的标签集训练和测试新分类器并且记录分类率，生成零分布。使用卡方检验以单变量方式选择信息化的代谢物，将实现合理的分类准确度所需的代谢物的数量最小化，并且观察最小化的代谢物的集的分类准确度百分比。作为最终步骤，可以通过它们的代谢组学（包括脂质组）图谱的直接比较，将三个不同的组进行集群。可以计算每一对（正常的）对象代谢图谱的皮尔逊积矩系数，以生成相关矩阵。使用聚集的完全连锁层次聚类，在该相关矩阵中最佳地识别集群。可以通过SVM在4倍交叉验证上生成接受者操作曲线，以证明当鉴别力阈变化时二元分类器的性能。实施例4-ACNSI的分化类型代谢组学分析来自六组的参与者的血浆：（1）具有震荡的mTBI参与者（震荡伤组），（2）具有在冲击诱导的外伤性脑损伤中的原发性冲击的mTBI参与者（冲击组），（3）具有心理困扰（例如PTSD）脑损伤的非TBI参与者（心理组），（4）具有脊髓挫伤的mTSI参与者（挫伤组），（5）非TSI参与者（非TSI组），以及（6）没有脑/脊髓损伤病史的对照参与者。根据被接受的标准的诊断标准，评估该参与者。通过DI/LC-MS/MS和NMR来分析血浆的代谢物。PCA使用PCA，证明了首要的10个成分解释了在数据中的方差的大部分，该10个成分的每一个被加权至许多的下面的代谢物。t-SNE使用t-SNE，将全部的代谢数据集降低至二维，因为该数据的固有维度显著低于代谢物的数量。在此维数降低步骤之后，训练支持向量机（SVM）（其具有线性核），以将对象分类为震荡伤或非震荡伤的。使用留一法的分类器的交叉验证，证明了在诊断脊柱损伤、震荡伤、冲击及心理性脑损伤中的高百分比的准确度。将分类准确度作为我们的检验统计量，可以通过排列检验来测试准确度的显著性。通过对分类标签进行随机混排；对每一个混排的标签集训练和测试新分类器并且记录分类率，生成零分布。使用卡方检验以单变量方式选择信息化的代谢物，将实现合理的分类准确度所需的代谢物的数量最小化，并且观察最小化的代谢物的集的分类精确度百分比。作为最终步骤，可以通过它们的代谢组学（包括脂质组）图谱的直接比较，将四个不同的组进行集群。可以计算每一对（正常的）对象代谢图谱的皮尔逊积矩系数，以生成相关矩阵。使用聚集的完全连锁层次聚类，在该相关矩阵中最佳地识别集群。可以通过SVM在4倍交叉验证上生成接受者操作曲线，以证明当鉴别力阈变化时二元分类器的性能。通过被阐明和描述的实施方式，描述了制造和使用本发明的当前预期的最佳模式。无需进一步详细阐述，应当认为的是本领域普通技术人员可以基于本文给出的描述，充分地利用本发明。在本文中引用的全部出版物都以引用的方式被并入本文中。尽管上述的说明含有许多特异性，但是这些不应被解释为限制本发明的范围，而应解释为仅仅提供了本发明的一些当前的实施方式的说明。当前第1页1 2 3