本发明涉及用于测定试样中的凝血酶(t)-抗凝血酶(at)复合体(tat)的试剂和方法。
背景技术：
：凝血酶-抗凝血酶复合体(tat)是在进行血液凝固时在血液中所产生的蛋白复合体，血液中的tat的定量对于弥漫性血管内凝血(dic)等血栓形成的诊断有用。然而，tat的存在量为游离抗凝血酶的存在量的约十万分之一，因此不容易测定。现在，主流的tat定量法包括使用采用了西门子公司的enzygnost(注册商标)tatmicro等酶免疫测定法(elisa)的试剂盒及采用了lsimedience公司的stacia(注册商标)cleiatat等化学发光酶免疫测定法(cleia)的试剂盒的方法，但均为需要固相-液相分离(b/f分离)的测定法，需要烦杂的清洗作业，并且需要手工作业或专用设备。在专利文献1～4中报道了使用不需要b/f分离的乳胶凝集法的试剂体系，但均是通过利用缓冲液稀释在体外合成的tat而制作的样品的测定，并且没有涉及使用乳胶凝集法能够对人体标本中的tat进行准确浓度测定的试剂的报道。另外，这些文献均依赖抗体的特异性来构建tat测定试剂，或者利用添加剂来避免由该交叉反应性带来的影响。专利文献5公开了有关基于使用不具有交叉反应性的抗体的夹心测定法的tat测定，但是，因为要在临床上进行利用，所以灵敏度不够。因此，在测定简便的乳胶凝集法中，要求高灵敏度-高精度地测定活体试样中的tat的试剂及方法。本发明人等报道了能够使用不需要b/f分离的乳胶凝集法而对人标本中的tat准确地进行浓度测定的试剂(专利文献6、7)，但是为了临床应用，还有进一步改善的余地。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2001－289850号公报专利文献2：日本特开2001－221800号公报专利文献3：日本特开平7－238099号公报专利文献4：日本特开2002－316999号公报专利文献5：日本特开平3－48158号公报专利文献6：日本特愿2015－074168号专利文献7：日本特愿2015－074173号技术实现要素：发明要解决的课题如图1记载的那样，在基于乳胶凝集法的tat的测定中，使用与抗凝血酶侧结合来识别tat的抗体及与凝血酶侧结合来识别tat的抗体两种抗体。而且，在原理上，仅在有tat存在时两抗体结合而引起乳胶凝集，能够进行tat的定量。然而，作为如专利文献6、7中所使用的与tat的抗凝血酶侧结合的抗体，即便使用对于tat的反应性为对于抗凝血酶的反应性的100倍以上的单克隆抗体，在血栓栓塞或dic的治疗等中作为抗凝血药使用的肝素(尤其是未分馏肝素)的影响下产生非特异性反应，得出不准确的测定结果，这在本发明人等的研究中越发明显。认为这大概是由于：肝素在血中与抗凝血酶形成复合体，将抗凝血酶多聚体化。认为这样的肝素－抗凝血酶复合体与通常的抗凝血酶相比更接近于形成tat时的抗凝血酶的结构，并且认为进一步形成多聚体。因此，若测定给药肝素患者的标本，则即便使用结合有对于tat的反应性为对于抗凝血酶的反应性的100倍以上的单克隆抗体的乳胶粒子，其也会识别肝素－抗凝血酶复合体，其单独产生凝集，这导致其作为非特异反应而追加于本反应。此种基于肝素－抗凝血酶复合体的非特异性反应是在能够b/f分离的测定法中不会产生的问题，是本发明人首次发现的使用乳胶凝集法的tat测定试剂中特有的问题。作为以往基于乳胶凝集法的tat测定试剂中的抗凝血酶的影响避免方法，已知如专利文献1、2那样的方法，但其对于由肝素产生抗凝血酶多聚体、由肝素而多聚体化的抗凝血酶的影响避免策略并无任何暗示。为此，本发明提供能够在使用了无需b/f分离或清洗作业的乳胶凝集法的、活体试样中的tat的测定试剂及测定方法中避免肝素等的影响而准确进行tat的测定的试剂及方法。用于解决课题的手段为了解决该课题而进行了深入研究，结果发现：本发明人通过在tat测定试剂中添加海美溴铵等聚阳离子，从而避免由肝素－抗凝血酶复合体所致的非特异性的凝集，能够准确地测定活体试样中的tat，以至完成本发明。即，本发明提供以下发明。[1]一种试剂，其特征在于，其是用于利用乳胶凝集法对来自被试者的血液试样中的凝血酶-抗凝血酶复合体(tat)进行测定的试剂，该试剂包含聚阳离子。[2]根据[1]所述的试剂，其中，上述被试者为被给药肝素的患者。[3]根据[1]或[2]所述的试剂，其中，上述聚阳离子选自海美溴铵、脱乙酰壳多糖类、改性葡聚糖、氨基葡聚糖、羟基甲基纤维素三甲基胺、溶菌酶、精胺、亚精胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、硫酸鱼精蛋白、羟基乙基纤维素三甲基胺、肝素结合蛋白、聚烯丙基胺、聚烯丙基胺盐酸盐、聚(二烯丙基二烷基胺)、聚酰胺-胺、多胺、聚乙烯基苄基三甲基氯化铵、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚丙基吖丙啶、聚咪唑啉、聚乙烯基胺、聚乙烯基吡啶、聚(丙烯酰胺/甲基丙烯酰氧基丙基三甲基溴化铵)、聚(二芳基二甲基氯化铵/n－异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸二甲基氨基乙酯/丙烯酰胺)、聚甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、聚二甲基氨基表氯醇、聚乙烯亚氨基表氯醇、聚甲基丙烯酰氧基乙基三甲基溴化铵、羟基丙基(甲基丙烯酰氧基乙基)二甲基氯化铵、聚(甲基丙烯酸甲基二乙基氨基乙酯/丙烯酰胺)、聚(甲基/胍)、聚甲基乙烯基吡啶鎓溴化物、聚(乙烯基吡咯烷酮－甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯)及聚乙烯基甲基吡啶鎓溴化物。[4]根据[1]或[2]所述的试剂，其中，上述聚阳离子选自海美溴铵、聚乙烯亚胺、聚丙基吖丙啶等聚亚烷基胺、硫酸鱼精蛋白质、聚赖氨酸、聚鸟氨酸及氨基葡聚糖。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的试剂，其中，上述试剂包含第1抗tat抗体和第2抗tat抗体，所述第1抗tat抗体与结合在乳胶上的抗凝血酶侧结合来识别tat，所述第2抗tat抗体与结合在乳胶上的凝血酶侧结合来识别tat。[6]根据[5]所述的试剂，其中，上述第1抗tat抗体是对于tat的反应性为对于游离抗凝血酶的反应性的100倍以上的抗体。[7]一种tat的测定方法，其特征在于，其是对来自被试者的血液试样中存在的tat进行测定的方法，其通过使用[1]～[6]中任一项所述的试剂进行乳胶凝集法，从而测定tat。[8]根据[7]所述的方法，其中，上述被试者为被给药肝素后的患者。发明效果根据本发明，利用乳胶凝集法的试剂，能够在避免肝素的影响的同时对活体试样中的微量tat进行准确测定(定量)。由此，即使是给药肝素患者血浆(或利用肝素采血管采集的血浆)，也能准确地进行基于乳胶凝集法的tat测定，即使在dic的治疗中也能准确地测定所使用的肝素给药后的患者标本中的tat，这在诊断上是有用的。附图说明图1为基于乳胶凝集法的tat测定方法的示意图。图2为基于间接抑制elisa法的反应体系的示意图。图3为表示对基于间接抑制elisa法的克隆tat－5在各抗原上的结合性进行评价的结果的图。图4为表示肝素添加血浆(模型标本)中的海美溴铵的效果的图。图5为表示对加肝素处理血液或未加肝素处理血液分别改变海美溴铵的浓度时的检测结果的图。图6为表示在加肝素处理血液或未加肝素处理血液中按照使tat浓度达到50ng/ml的方式进一步添加血清并对其分别改变海美溴铵(聚凝胺)的浓度时的检测结果的图。下方的图表示对上方的图放大后的图。图7为表示对加肝素处理血液或未加肝素处理血液分别改变硫酸鱼精蛋白的浓度时的检测结果的图。下方的图表示对上方的图放大后的图。图8为表示在有(+)无(－)海美溴铵的情况下使用第2试剂a或第2试剂b来评价临床标本的测定结果的图。具体实施方式本发明的tat测定试剂是用于利用乳胶凝集法对来自被试者的血液试样中的凝血酶-抗凝血酶复合体(tat)进行测定的试剂，该试剂包含聚阳离子。以下，将本发明的tat测定试剂的一例记载为实施的一个方案，但是，本发明的范围并不限定于此。本发明的tat测定试剂，优选为用于对活体试样中的tat进行测定的、使用了分别结合有2种抗tat抗体的乳胶粒子的基于夹心体系中的乳胶凝集法的免疫测定试剂。可以在本发明中使用的抗体，例如可以将与抗凝血酶侧结合来识别tat的抗体(第1抗体)和与凝血酶侧结合来识别tat的抗体(第2抗体)组合使用。作为第1抗体，只要是能够与抗凝血酶侧结合来识别tat的抗体即可。优选使用对于tat的反应性与对于游离抗凝血酶的反应性至少差100倍以上的抗体。第1抗体对于tat的反应性只要为对于游离抗凝血酶的反应性的100倍以上即可，更优选为200倍以上，进一步优选为1000倍以上，特别优选为10000倍以上。交叉反应性越小越好，因此上限并无特别限制，但例如可以为不足100000倍或不足50000倍。在制备该抗体时，对于除人以外的动物，可以是免疫了游离抗凝血酶的抗体，也可以是免疫了tat的抗体，只要是能够与抗凝血酶侧结合来识别tat的抗体，就可以在本发明中使用。在此，本发明中“与抗凝血酶侧结合”是指：在试样中存在最多的游离状态的抗凝血酶与游离凝血酶结合而形成复合体(tat)的状态，其与该状态的抗凝血酶结合。因此，在将具有形成了复合体时的结构的抗凝血酶称作复合体型结构抗凝血酶、并且将具有未形成复合体时的结构的抗凝血酶称作游离型结构抗凝血酶(游离抗凝血酶)的情况下，“与抗凝血酶侧结合”是指与复合体型结构抗凝血酶结合。游离型结构抗凝血酶具有与复合体型结构抗凝血酶不同的结构。这是由于：游离型结构抗凝血酶以通过与游离凝血酶结合而形成复合体从而其结构发生了变化的状态存在。活体内的tat与未形成tat的游离抗凝血酶的存在比例，参考健康人的测定值宽度认为在1：60000～1：110000之间，但一般认为以约1：100000存在。另外，已知在败血症或肝疾病患者中有时该存在比例发生变化，但是，即使在游离抗凝血酶量变少的情况下，也为1：50000左右。因此，若第1抗体对游离抗凝血酶也显示反应性，则难以进行tat的定量。为此，在定量tat时需要使用对游离抗凝血酶的反应性低的抗体，因此，使用对于tat的反应性为对于游离抗凝血酶的反应性的100倍以上的抗体。在本发明中，关于“对于tat的反应性为对于游离抗凝血酶的反应性的100倍以上”，可列举对各抗原的亲和性之比为100倍以上的情况、在后述的以间接抑制elisa进行评价时显示一定比例的抑制率所需的抗原量之比为100倍以上的情况等。对于tat的反应性为对于游离抗凝血酶的反应性的100倍以上的抗体，可以利用后述的实施例中记载的方法来得到，但是，以下对利用间接抑制elisa评价或筛选该抗体的情况进行说明。首先，准备与抗凝血酶侧结合来识别tat的抗体(第1抗体的候选抗体)。此种抗体只要在利用后述的基于杂交瘤的单克隆抗体产生法等得到抗体后选择结合部位为抗凝血酶侧的对tat进行识别的抗体即可。当然，在存在结合部位为抗凝血酶侧的对tat进行识别的抗体的情况下，只要预先将其供于以下的评价体系即可。即，使候选抗体与包含一定量(例如0.1、0.5、1、5、10、50μg/ml)的tat、或可以抑制tat的反应的抗原的溶液反应充分的时间(例如12小时)。接着，使上述反应液与将tat固定化后的基材反应一定时间。之后，进行清洗操作后，使用标记2次抗体，测定与基材上的tat结合的抗体的量(抗体残留率)。例如，首先，在没有抑制该抗体的反应的抗原存在的条件下，将一定量的tat固相化在板等基材上。固相化在基材上的抗原(tat)的量可以由本领域技术人员考虑所使用的抗原的分注量与评价对象的抗体的种类的关系进行适当设定。在没有抑制该抗体的反应的抗原存在的条件下，使各浓度(例如0.04～1μg/ml)的上述第1抗体的候选抗体与固定化了上述tat的基材反应一定时间。之后，进行清洗操作后，使用标记2次抗体(抗小鼠igg－hrp)，测定与基材上的tat结合的抗体的量。确定吸光度处于1.0附近(若为表1的记载方法，则为1000)的抗体浓度。可以将该抗体浓度设为基于抗原的抑制时的抗体浓度(表3；反应时浓度(μg/ml))。接着，使由上述方法确定的浓度的候选抗体与包含一定量(例如0.1、0.5、1、5、10、50μg/ml)的tat或游离抗凝血酶的溶液反应充分的时间(例如12小时)。接着，使上述反应液与固定化了tat的基材反应一定时间。之后，进行清洗操作后，使用标记2次抗体(抗小鼠igg－hrp)，测定与基材上的tat结合的抗体的量(抗体残留率)。予以说明，抗体残留率可以将未实施基于抗原的吸收时所得的检测值设为100％来计算。在抗体对于游离抗凝血酶的反应性高的情况下，能够与tat结合的抗体的量减少，因此利用标记2次抗体检测的抗体的量变少(抗体残留率变低)，另一方面，在抗体对游离抗凝血酶的反应性低的情况下，残留大量能够与tat结合的抗体，因此利用标记2次抗体检测的抗体的量变多(抗体残留率变高)。将该抗体残留率与最初使tat与抗体反应(利用tat进行抑制反应)后再使反应液与固体化tat反应时的抗体残留率进行比较。而且，例如在加入50μg/ml游离抗凝血酶进行抑制反应时的抗体残留率为50％的情况下，由上述的利用tat进行抑制时的结果计算显示相同抗体残留率所需的tat的量。在利用tat进行抑制时，若抗体残留率达到50％所需的tat抑制抗原的量不足0.50μg/ml，则可以使对于tat的反应性为对于游离抗凝血酶的反应性的100倍以上。可以选择这样选择的抗体作为第1抗体。予以说明，在第1抗体为单克隆抗体的情况下，对于tat的亲和性(kd)优选为10－8以下，本领域技术人员能够参考对于tat的亲和性的值来适当选择适合于乳胶试剂的抗体。在选择能够与抗凝血酶侧结合来识别tat的抗体作为第1抗体的情况下，作为第2抗体，只要是能够与凝血酶侧结合来识别tat的抗体即可，可以使用对于凝血酶特异性反应的抗体。在试样中，几乎不存在游离凝血酶，因此大多情况下即使是对于游离凝血酶具有交叉反应性的抗体也能够进行利用。本领域技术人员可适当选择使用。在制备该抗体时，对于除人以外的动物，可以是免疫了游离凝血酶的抗体，也可以是免疫了tat的抗体，若为能够与凝血酶侧结合来识别tat的抗体，则可以在本发明中使用。在此，本发明中“与凝血酶侧结合”，是指与试样中存在的游离状态的凝血酶同抗凝血酶结合而形成复合体(tat)的状态的凝血酶结合。因此，在将具有形成了复合体时的结构的凝血酶称作复合体型结构凝血酶、并且将具有未形成复合体时的结构的凝血酶称作游离型结构凝血酶的情况下，“与凝血酶侧结合”是指与复合体型结构凝血酶结合。认为游离型结构凝血酶可能具有与复合体型结构凝血酶不同的结构。这是由于：游离型结构凝血酶以通过与抗凝血酶结合而形成复合体从而其结构发生了变化的状态存在。作为第2抗体，只要是与凝血酶侧结合来识别tat的抗体，则并无特别限制。在单克隆抗体的情况下，对于tat的亲和性(kd)优选为10－8以下，但本领域技术人员能够参考对于tat的亲和性的值而适当选择适合于乳胶试剂的抗体。另外，作为在本发明中使用的抗体，例如为与tat特异性结合的抗体、即不与凝血酶或抗凝血酶反应而仅与tat特异性反应的抗体，也可以将表位不同的两种抗体组合使用。上述的第1抗体及第2抗体可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种。这些抗体可以由本领域技术人员按照公知的手法取得。作为在抗体制作用途中对免疫原免疫的动物，可以使用羊、马、山羊、兔、小鼠、大鼠等，在多克隆抗体制作中特别优选兔、山羊等。另外，也可以利用制作杂交瘤细胞的公知的方法得到单克隆抗体，在该情况下，优选小鼠、大鼠或者兔等。杂交瘤及单克隆抗体的制备可以按照通用方法、例如续生化学实验讲座(日本生化学会编)或免疫生化学研究法(日本生化学会编)中记载的方法来进行。作为免疫原，可以如上述那样使用tat，在本申请发明中也可以使用制作结合有玻连蛋白的vtat作为免疫原的抗体。另外，在第1抗体的情况下，可以使用抗凝血酶，在第2抗体的情况下，可以使用凝血酶。这些免疫原可以使用以从活体采集的试样作为原料所纯化的tat，也可以使用将游离凝血酶和游离抗凝血酶混合而在体外(invitro)合成的tat。作为合成tat，例如可以为在试管内培育能够作为生物制剂获得的凝血酶和抗凝血酶而得到的tat，也可以使用回收在大肠杆菌、哺乳动物细胞、感染了颗粒症病毒的昆虫细胞等中使用已知的翻译表达体系所表达的物质并经纯化得到的tat作为免疫原。另外，在能够仅利用部分肽使立体结构的不同进行免疫的情况下，具体而言，在要特定抗体的结合部位而制作抗体的情况下，在第1抗体时，可以使用抗凝血酶来制作，在第2抗体的情况下，也可以使用凝血酶的部分肽来制作。作为此时的抗原的肽序列的选择、肽片断的合成方法、免疫方法，可以使用已知的方法。在本发明所使用的抗体中包含抗体片断。上述抗体片断是所期望的抗体的片断，而且是与原本的抗体具有相同反应性的抗体片断。可以在本发明使用的抗体片断中包含例如fab、fab’、f(ab’)2或fv等。这些片断例如可以通过按照常规方法利用蛋白质分解酶将抗体消化，接着，按照蛋白质的分离-纯化的常规方法得到。这些片断可以直接固相化在乳胶粒子上来使用，也可以制备成fab’片断或f(ab’)2片断后固相化在乳胶粒子上。从避免抗体对fc片断的非特异反应的观点出发，更优选fab’或f(ab’)2。本发明中使用的抗体可以通过以下方式得到，即，首先，利用基于杂交瘤的单克隆抗体产生法等得到tat抗体(候选抗体)，之后，从tat抗体(候选抗体)中利用如上所述的手法及基准选择第1抗体及第2抗体而得到。第1抗体与第2抗体的组合，只要能够在乳胶凝集法中进行tat的测定，则并无特别限制，优选选出血浆等活体试样中所含的基质(background)的影响最小的抗体组合。tat测定试剂所要求的灵敏度，需要可以测定能够将健康人和患者明确区别的基准值或者其2倍的浓度，因此本发明的试剂优选为能够定量活体试样中的10～15ng/ml的tat的试剂，更优选为能够定量3～4ng/ml的tat的试剂，进一步优选为即使是1ng/ml左右的浓度也能进行定量的试剂。使上述的第1抗体及第2抗体结合的乳胶粒子，只要是可以在乳胶凝集反应中使用的乳胶粒子，则并无特别限制，但平均粒径优选为0.05μm～0.5μm，更优选为0.2～0.4μm。所使用的乳胶粒子的种类，可以仅使用1种乳胶粒子，也可以使用多种乳胶粒子。例如可以将粒径不同的乳胶粒子组合使用。对于乳胶粒子而言，由于实质上难以以单一粒径来制造，因此以粒子全体的平均粒径来进行规定。因此，在平均粒径为0.05μm～0.5μm的情况下，即使是包含不含在该范围的乳胶粒子的情况，有时也属于本发明。对于本领域技术人员而言，包含粒径不同的乳胶粒子是常识性的范围内，本领域技术人员能够使用包含在其粒径分布中没有大偏差的粒子群的溶液来构建乳胶试剂。予以说明，该平均粒径能够利用公知的方法进行测定，例如利用使用了透射型电子显微镜装置的图像解析来进行计算。作为本发明的乳胶粒子，只要是通常在该领域中使用的乳胶粒子，则并无特别限定，但可列举例如：含有使苯乙烯、氯乙烯、丙烯腈、乙酸乙烯酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等乙烯基系单体聚合而成的均聚物(例如聚苯乙烯、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物等)的粒子；含有丁二烯系共聚物(例如苯乙烯－丁二烯共聚物、甲基丙烯酸甲酯－丁二烯共聚物、丙烯腈－丁二烯共聚物等)的粒子；含有除此以外的共聚物(例如苯乙烯－苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸酯共聚物、丙烯酸酯共聚物、氯乙烯－丙烯酸酯共聚物等)的粒子。可列举具有羧基、伯氨基、氨基甲酰基(－conh2)、羟基、醛基等作为官能团且基体含有上述有机系微粒的粒子。作为将抗体固相化在乳胶粒子上的方法，只要依据公知的方法进行即可，例如可以使抗体与乳胶粒子悬浮在缓冲液中，并使其在25℃下反应1小时后，利用离心分离、封闭处理等通常在该领域中进行的处理而得到。另外，也可以选择利用化学结合将抗体和乳胶粒子固相化的方法、利用生物素－亲和素反应将抗体固相化的方法。在使抗体结合到乳胶粒子上时，在能够使抗体维持上述的对tat的反应性及特异性的条件下进行。从容易进行适合的试剂的制备的方面出发，作为将第1抗体固相化的第1乳胶粒子、将第2抗体固相化的第2乳胶粒子，也可以按照抗体的种类制备固相乳胶液，还可以使第1抗体和第2抗体固相化到1种乳胶粒子上来进行试剂的制备。本领域技术人员可以适当设计如何使抗体和乳胶粒子固相化而进行试剂的制备。可以在本发明的试剂中应用的被检试样，只要是具有含有tat的可能性的被检试样，则并无特别限定，但优选为活体试样，更优选为来自哺乳动物的试样，进一步优选为来自人的试样。作为来自活体的试样，可以特别适合使用血清、血浆。优选可以特别适合用于来自在被给药肝素(例如最终浓度为1～2u/ml)后的人的血液试样的测定，进一步优选可以特别适合用于来自被给药肝素后的人的血浆的测定。优选为来自哺乳动物的试样，更优选为来自人的试样。本发明的试剂，可以为1试剂体系，也可以为2试剂体系。在本发明的试剂为1试剂体系的情况下，对活体试样添加分别固相化了上述第1抗体及第2抗体的乳胶粒子悬浮液和包含海美溴铵等聚阳离子的反应液，发生抗原抗体反应，由此可以测定活体试样中的tat。在本发明的试剂为2试剂体系的情况下，对活体试样添加以缓冲液成分为主体且包含海美溴铵等聚阳离子的第1试剂后，再添加包含分别固相化了上述第1抗体、第2抗体的乳胶粒子的第2试剂，由此产生抗原抗体反应，可以测定活体试样中的tat。予以说明，可以使第2试剂中同时含有聚阳离子和抗体结合乳胶粒子。为了更准确地进行测定，优选2试剂体系。作为聚阳离子，只要是与试样中的肝素结合而抑制肝素与抗凝血酶的结合的聚阳离子即可，例如可以使用如以下那样的聚阳离子。作为天然产生的聚阳离子，可列举：甲基乙二醇脱乙酰壳多糖等脱乙酰壳多糖类；二乙基氨基乙基改性葡聚糖等改性葡聚糖；氨基葡聚糖、羟基甲基纤维素三甲基胺、溶菌酶、精胺、亚精胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、硫酸鱼精蛋白、羟基乙基纤维素三甲基胺及蛋白质。作为蛋白质，只要具有与肝素结合的性质即可，作为肝素结合基肽，可以使用已知的具有bxxb、bbxb、bbbxxb、bxxbbxb(其中，b是指碱性氨基酸，x是指任意的氨基酸)的序列的蛋白质-肽。具体为活化第x因子、肝素结合性生长因子、乳铁蛋白、转铁蛋白、玻连蛋白、核酸内切酶、脂肪酶、类固醇受体、组蛋白等dna结合蛋白、pf4等。合成聚阳离子的例子为聚烯丙基胺、聚烯丙基胺盐酸盐、聚(二烯丙基二烷基胺)、聚酰胺-胺、多胺、聚乙烯基苄基三甲基氯化铵、海美溴铵、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚丙基吖丙啶、聚咪唑啉、聚乙烯基胺、聚乙烯基吡啶、聚(丙烯酰胺/甲基丙烯酰氧基丙基三甲基溴化铵)、聚(二芳基二甲基氯化铵/n－异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酸二甲基氨基乙酯/丙烯酰胺)、聚甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、聚二甲基氨基表氯醇、聚乙烯亚氨基表氯醇、聚甲基丙烯酰氧基乙基三甲基溴化铵、羟基丙基(甲基丙烯酰氧基乙基)二甲基氯化铵、聚(甲基丙烯酸甲基二乙基氨基乙酯/丙烯酰胺)、聚(甲基/胍)、聚甲基乙烯基吡啶鎓溴化物、聚(乙烯基吡咯烷酮－甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯)及聚乙烯基甲基吡啶鎓溴化物。在这些聚阳离子中，可列举海美溴铵、聚乙烯亚胺、聚丙基吖丙啶等聚亚烷基胺、硫酸鱼精蛋白、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、氨基葡聚糖等，特别优选使用海美溴铵或者硫酸鱼精蛋白。作为聚阳离子的分子量，已知以重均分子量计为数百～数百万，但可以在本发明中优选使用的聚阳离子可以使用分子量为1000～100000、更优选1000～10000的聚阳离子。聚阳离子优选在反应体系中以最终浓度0.0002～1w/v％存在，更优选以0.0005～0.1w/v％存在，进一步优选以0.001～0.05w/v％存在。在乳胶粒子上通常存在so3－、so4－、coo－这样的负电荷，因此认为在试剂中添加聚阳离子时，即使在没有测定对象物存在的情况下也容易因聚阳离子的正电荷而引起凝集，由于担心对测定体系的影响，因此通常会犹豫其使用。但是，本发明人发现：在标本中肝素与抗凝血酶结合而产生的抗凝血酶多聚体会因海美溴铵等聚阳离子而解离。令人意外的是：通过使用上述聚阳离子，从而在不产生此种副作用(凝集)的情况下，仅避免由肝素带来的影响，能够准确地测定tat。乳胶粒子的凝集程度例如使用吸光度来测定，从预先求得的标准品的校准曲线求得该浓度，由此可以定量标本中的tat浓度。予以说明，只要在吸光度的测定波长通常为340nm～1000nm、优选500nm～900nm下进行测定即可。对乳胶凝集反应进行测光的时间，可以利用在发生乳胶凝集反应的时间内的单位时间的变化速度或一定时间的变化量来测光。例如，在测定吸光度的情况下，可以利用从乳胶凝集反应开始起的30秒钟后～5分钟后的单位时间的吸光度变化速度、或一定时间的吸光度变化量来测光。反应温度优选为10～50℃，更优选为20～40℃。反应时间可以适当决定，例如在通用自动分析机中可以按照10～15分钟的反应时间进行测定。予以说明，对于本领域技术人员而言，可以在使用光学设备或通用自动分析机的分析中按照公知的方法适当决定反应温度、反应时间、测定波长、测定时间、试剂构成、乳胶浓度、乳胶固定化的抗体浓度、各种添加剂浓度。本发明中使用的乳胶粒子的浓度，只要是能够应用于基于乳胶凝集法的免疫学测定试剂的浓度，则并无特别限定，但用于测定tat所需的反应时的乳胶粒子的浓度优选为0.005w/v％～0.2w/v％，更优选为0.01w/v％～0.1w/v％。本发明的试剂除将抗体固定化后的乳胶粒子以外还可以进一步含有能够添加到基于乳胶凝集法的免疫学测定试剂的添加剂、例如缓冲液、凝集促进剂、非特异反应抑制剂、敏化剂等。作为能够添加到本发明的试剂中的敏化剂，可列举海藻酸钠、海藻酸丙二醇酯等。另外，作为能够添加到本发明的试剂中的凝集促进剂，适合使用水溶性高分子、蛋白质。可列举例如：葡聚糖、硫酸葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮等水溶性高分子；牛血清白蛋白等白蛋白类；γ－球蛋白等球蛋白类。作为上述缓冲液，例如可以使用在ph值5.8～6.6具有缓冲能力的缓冲液。更优选为6.0～6.4，进一步优选为6.1～6.3，特别优选为6.15～6.25。若为1试剂体系，则只要将试剂的ph调节为上述范围即可，若为2试剂体系，则只要以在混合时使ph达到上述范围的方式构成即可。例如在由以缓冲液成分为主体的第1试剂和包含将抗体固相化后的乳胶粒子的第2试剂构成的情况下，可列举将第1试剂的ph调节为上述范围且在将两试剂混合时使混合液的ph达到上述范围的实施方式。ph可以利用ph调节剂来调节，但是优选利用缓冲液来调整。适合使用tris缓冲液、bis-tris缓冲液、磷酸缓冲液或good’s缓冲液等，反应时的缓冲液浓度优选为10～500mmol/l，更优选为20～200mmol/l。作为能够添加到本发明的试剂中的非特异反应抑制剂，可列举：针对非特异反应的原因物质的抗体或受体；tris缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液或good’s缓冲液等缓冲液类；edta、cydta、dtpa、egta、nta、ntp等螯合剂；氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钙、硫酸镁、碳酸钙、碳酸钠等盐类；脂肪酸二乙醇酰胺、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、脂肪酸山梨糖醇酐酯、烷基聚葡糖苷、烷基单甘油基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺、烷基糖苷等非离子性表面活性剂。本发明的试剂可以含有能够作为标准物质使用的tat。tat可以是由活体纯化的tat，也可以是利用基因重组等合成的tat。作为合成tat，例如可以通过在试管内培育能够作为生物制剂获得的凝血酶和抗凝血酶而得到。另外，也可以回收在大肠杆菌、哺乳动物细胞、感染了颗粒症病毒的昆虫细胞等中使用已知的翻译表达体系表达的物质并经纯化后混合所得物质来合成tat。实施例实施例1合成tat的制备将市售的人凝血酶制剂(日本血液制剂机构制)和抗凝血酶制剂(日本血液制剂机构制)用pbs(将dulbeccopbs(－)粉末“nissui(日水制药株式会社制)”按照9.6g/l溶解)进行稀释，以1：3的摩尔比混合后，使其在37℃下反应30分钟。30分钟后，添加dfp(氟磷酸二异丙酯、和光纯药公司制)，使其达到0.75mm，停止反应。在所得的反应物中包含未反应的凝血酶、抗凝血酶，因此通过预先利用包含500mm的nacl的50mmtris－hcl缓冲液(ph7.4)加以平衡化的hiload26/60superdex200hr(gehealthcare公司制)进行了纯化。tat馏分利用sds－page确认后，进行了回收。将所得的tat用包含0.5％的bsa的生理食盐水进行稀释，使用cleia试剂(stacia(注册商标)cleiatat、lsimedience公司制)进行了数值标定。将其作为合成tat来使用。实施例2抗tat抗体的制备细胞融合法按照安藤民卫-岩崎辰夫/著“单克隆抗体/杂交瘤与elisa”(讲谈社)进行了实施。将实施例1中制备的合成tat50μg与弗氏完全佐剂(difco公司制)混合，作为给药抗原。对balb/c小鼠(雌性、4周龄)以2周间隔给药3次，第4次给药是静脉注射半量25μg。1周后，从脾脏分离淋巴细胞，与骨髓瘤细胞p3x63－ag.8混合后，使用聚乙二醇(peg4000、merck公司制)实施了细胞融合。利用hat选择培养基选择杂交瘤，以对合成tat的结合活性为指标，筛选在第1周后产生目标抗体的杂交瘤。即，用0.05m碳酸缓冲液(ph9.5)分别将合成tat稀释成0.2μg/ml，在免疫板(maxisorp、nunc公司制)上添加50μl/孔。在4℃下反应过夜(overnight)后，用包含0.05％tween-20的pbs清洗3次，对各孔添加100μl包含1.0％bsa的pbs，进行封闭。接着，培养上清在各孔中添加50μl，使其在37℃下反应1小时后，用包含0.05％tween-20的pbs清洗3次。将过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(dako公司制)用包含0.05％tween-20的pbs稀释成1000倍，在各孔中添加50μl。在37℃反应1小时后，同样地清洗5次，对各孔添加邻苯二胺溶液(和光纯药公司制)50μl。在室温下反应5～10分钟后，用2n硫酸溶液停止反应。利用板分光光度计(el312e、bio－tekinstruments公司制)测定了492nm的吸光度。选择产生与合成tat的反应良好的抗体的细胞，利用极限稀释法进行克隆。10天后，进行筛选，取得产生与合成tat反应的抗体的杂交瘤。实施例3抗凝血酶抗体的制备利用与实施例2同样的方法，以免疫抗原作为凝血酶，得到抗凝血酶抗体。选择对凝血酶特异性反应的抗体，使用其中的1克隆作为抗凝血酶抗体(t－1)。实施例4基于间接抑制elisa的抗体特异性的评价利用间接抑制elisa法，进行了各抗体的反应性的评价。基于间接抑制elisa法的反应体系的示意图如图2所示。将想要评价的0.04～0.4μg/ml浓度的对tat进行识别的抗体(抗tat抗体)候选与抑制抗原(凝血酶原(enzymeresearch公司制)、凝血酶、抗凝血酶、合成tat)混合，进行培育。将被部分抑制的该抗体候选作为一次抗体，使其与固相化到96孔板上的合成tat结合。进而使过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(dako公司制)作为二次抗体进行结合，添加显色基质，测定了吸光度。另外，由发色的变化率计算抗体的残留率。对于特定的抗体(tat－5)而言，使用各抑制抗原时的吸光度如表1所示，由吸光度计算的抗体的残留率如表2所示。例如，tat的抑制抗原浓度为10μg/ml时的残留率为285/1066×100＝26.7(％)。由各抗体的各抗原浓度计算了残留率。予以说明，在表中，pro-t表示凝血酶原，t表示凝血酶，at表示抗凝血酶。【表1】表1间接抑制elisa的测定结果抑制抗原pro-ttattat010661066106610660.01610741059105910630.0810621062105910450.41085106710659652106410491033661101071105710012855010721056789112(抑制抗原浓度：μg/ml，吸光度(492nm×1000)，各n＝2测定(平均值))【表2】表2抗体残留率(％)抑制抗原pro-ttattat0100.0％100.0％100.0％100.0％0.016100.8％99.3％99.3％99.7％0.0899.6％99.6％99.3％98.1％0.4101.8％100.1％99.9％90.5％299.8％98.4％96.9％62.0％10100.5％99.2％93.9％26.7％50100.6％99.1％74.0％10.5％(抑制抗原浓度：μg/ml)另外，计算与以抗凝血酶50μg/ml施加抑制时的残留率为同等的抑制率的tat抗原量，进行比较，由此求得对于抗凝血酶的tat的反应性差(倍率)。若该差异大，则意味着：与抗凝血酶相比，对于tat的特异性更强。描绘tat的抑制曲线(抑制抗原添加浓度对数-残留率％)，使用样条函数来进行计算。例如，在tat-5的情况下，抗凝血酶50μg/ml的残留率为74.0％，与该残留率同样的tat抗原量为1.144μg/ml。即，反应性之差为50/1.144＝44倍。(图3)。此外，对27种抗体克隆进行了上述倍率的计算。添加tat与抗凝血酶的量的差异(倍率)为100倍以上的抗体存在13种，为1000倍以上的抗体存在7种，为10000倍以上的抗体存在2种。5种抗体如表3所示。【表3】表3实施例5肝素添加血浆(模型标本)中的海美溴铵的效果第1试剂：使用100mmbis－tris(同仁化学公司制)ph6.2、700mmnacl(和光纯药公司制)、0.05％emulgen150(花王公司制)、0.20％海藻酸钠(和光纯药公司制)、0.15％bsa(sigmaaldrich公司制)、0.05％海美溴铵(sigmaaldrich公司制)作为第1试剂。另外，比较例使用从上述第1试剂除去海美溴铵后的试剂。第2试剂：分别使用如下的试剂作为第2试剂，即，将吸附有对于tat的反应性为对于抗凝血酶的反应性的100倍以上的与tat的抗凝血酶侧反应的小鼠单克隆抗体tat－1的聚苯乙烯乳胶粒子、和吸附有抗凝血酶小鼠单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶粒子，以使各抗体致敏粒子在700nm下的吸光度达到1.0的方式用0.05％叠氮化钠溶液进行稀释并混合得到的试剂(第2试剂a：乳胶粒子浓度0.01％)；或者，仅将吸附有对于tat的反应性为对于抗凝血酶的反应性的100倍以上的与tat的抗凝血酶侧反应的小鼠单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶粒子，以使其在700nm下的吸光度达到1.0的方式，用0.05％叠氮化钠溶液进行稀释并混合得到的试剂(第2试剂b)。样品：对按照达到1或2u/ml的方式添加了肝素钠注射液“tanabe”(田边三菱制药公司制)的正常人合并血浆或未添加肝素的正常人合并血浆分别进行了测定。测定设备：7170s(hitachihigh-technologies公司制)参数：设定为样品量12μl、第1试剂90μl、第2试剂90μl、主波长570nm、副波长800nm，将从测光点第34点的吸光度减去第20点的吸光度所得的值作为δabs，实施了测定。结果-考察结果如图4所示。在使用比较例(无海美溴铵)的第1试剂的情况下，第2试剂a、b均确认到同等程度的肝素浓度依赖性的非特异性凝集，与此相对，在使用实施例(有海美溴铵)的第1试剂的情况下，均未确认到凝集。由此暗示着：由吸附有对tat的抗凝血酶侧进行识别的抗体的粒子引起基于肝素－抗凝血酶复合体的非特异性凝集，并且通过添加海美溴铵，从而消除肝素－抗凝血酶复合体。实施例6海美溴铵添加量的研究第1试剂：除了使海美溴铵添加量在0～0.05w/v％之间发生变化以外，与实施例5同样。第2试剂：使用实施例5的第2试剂a。样品：添加了2u/ml肝素钠注射液“tanabe”的正常人合并血浆或添加2u/ml肝素钠注射液“tanabe”且按照使tat浓度达到50ng/ml的方式添加了血清的正常人合并血浆测定设备-参数：与实施例5同样地进行。结果-考察：结果如图5、图6所示。对于2u/ml的肝素，添加0.0005％(最终浓度0.0002％)的海美溴铵(聚凝胺)时，确认到效果。另外，确认到直至添加0.05％(最终浓度％0.023％)在未添加肝素的基质血浆中未产生来自海美溴铵的正电荷的乳胶粒子的非特异性凝集。因此可知：海美溴铵优选为0.0005％(最终浓度0.0002％)以上，更优选为0.005％(最终浓度0.002％)以上。予以说明，如图6(a)所示，利用聚阳离子的添加，也确认到未对作为目标的tat检测反应带来大幅影响。图6(b)为将基线附近放大后的图。实施例7硫酸鱼精蛋白的效果第1试剂：代替海美溴铵而使硫酸鱼精蛋白(和光纯药公司制)的添加量在0～0.01w/v％之间变化，除此以外，与实施例5同样地进行制备。第2试剂：使用实施例5的第2试剂a。样品：添加了2u/ml肝素钠注射液“tanabe”的正常人合并血浆测定设备-参数：与实施例5同样地进行。结果-考察结果如图7所示。与未添加硫酸鱼精蛋白的情况相比，在添加0.001％(最终浓度0.0005％)以上硫酸鱼精蛋白的情况下，添加肝素的血浆的吸光度大幅减少，观察到改善。进而，在添加了0.01％(最终浓度0.005％)硫酸鱼精蛋白的情况下，与添加海美溴铵时同样地确认到大致抑制了由添加肝素所致的非特异性凝集。因此可知：硫酸鱼精蛋白优选为0.001％(最终浓度0.0005％)以上，更优选为0.01％(最终浓度0.005％)以上。实施例8实际标本中的海美溴铵的效果第1试剂：与实施例5同样。第2试剂：使用了实施例5的第2试剂a、b。样品：使用由确认到非特异反应而推断为给药了肝素制剂的柠檬酸na血浆(标本1、2)2种标本。测定设备-参数：与实施例5同样地进行。结果-考察结果如图8所示。在不添加海美溴铵时，即使在使用第2试剂a、第2试剂b中的任一者的情况下，均检测到高信号。另一方面，通过添加海美溴铵来消除非特异性凝集，在使用第2试剂a、即2种抗体的情况下，能够进行tat特异性检测。综上，即使在实际的血浆标本中也确认到海美溴铵的效果。如以上所示，在标本中肝素与抗凝血酶结合而产生的抗凝血酶多聚体被海美溴铵等聚阳离子解离，这是本发明人发现的预料之外的效果。通过使用聚阳离子，从而在不产生此种副作用的情况下仅避免由肝素带来的影响，能够准确地测定tat。当前第1页12