细胞中次氯酸原位快速检测方法与流程

本发明涉及生物分析技术或是化学分析技术领域，是利用表面增强拉曼光谱效应对细胞进行原位快速检测的技术，具体地说，是对细胞中次氯酸进行原位快速检测的一种方法。

背景技术：

活性氧物种在生物体内发挥着十分关键的生物学效应，可引起DNA损伤、影响信号传导、调节蛋白活性等等。有研究表明：次氯酸与心血管疾病、炎症、癌症、糖尿病、神经系统病变等诸多生理或病理过程密切相关。但是，由于缺乏强有力的分析检测手段，对次氯酸的很多生物学功能还不十分清楚。因此，灵敏而精准的对细胞内次氯酸进行原位检测的技术对信号传导过程分析、病理生理机制阐释以及新型药物筛选等诸多领域均具有重要的应用价值。

目前，用于检测细胞内次氯酸的方法主要有比色分析、色谱分析、电化学分析、荧光分析等。这些方法在一定程度上为次氯酸的检测分析提供了技术支持，但是，它们仍然无法很好地满足对细胞内次氯酸进行原位检测的需求。其中，比色分析较为简便、技术要求低，但其灵敏度也较低且难以实现细胞内次氯酸的检测分析；色谱分析虽具有较好的定性能力和灵敏度，但仍然难以实现对细胞的原位分析；电化学分析虽具有很高的灵敏度，但其定性分析能力较弱，且对细胞的原位分析也存在一定困难。比较而言，荧光分析倒能够在一定程度上克服上述分析方法的不足，可进行细胞的原位分析，但是，荧光分析会受到光漂白、光毒性的影响并且光谱谱带较宽而不易进行原位监测。

表面增强拉曼光谱技术是一种能从分子水平上获得物质结构及化学组成信息的高灵敏表面分析技术，可提供指纹识别谱图，具有检测速度快、不受水干扰、灵敏度高、定性能力强、适合多组份分析、抗光漂白、细胞自身荧光干扰小等优点；其在物理化学、分析化学、生命科学、环境科学、纳米材料等许多方面的应用研究引起了本领域专家学者的浓厚兴趣，并在生物物理、生物化学以及生物医学等研究领域展现了巨大的应用潜力。

细胞中的次氯酸因其拉曼活性小或者靶向作用弱难以获取特征表面增强拉曼光谱信号，相关的表面增强拉曼光谱检测研究较为少见。然而，如能突破这方面的技术瓶颈，研究建立基于表面增强拉曼光谱的细胞内次氯酸的原位检测技术，将有助于充分发挥表面增强拉曼光谱的技术优势、克服现有检测方法的技术不足，提升细胞内次氯酸的研究水平。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞中次氯酸原位快速检测方法，它是利用表面增强拉曼光谱技术对细胞中的次氯酸进行原位快速的检测，具有检测和分析速度快、灵敏度高、样品用量少、定性能力强、抗光漂白、水干扰小等优点，可对细胞中的次氯酸进行原位快速定性和定量检测，检测灵敏度可达1μM以下。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案。

一种细胞中次氯酸原位快速检测方法，其特征在于，含有以下步骤：

（1）合成次氯酸识别分子

将反应物与强碱溶液按一定的当量比混合在一起；

将所述混合溶液在氮气保护下搅拌6～7小时，然后加入2～3M酸溶液，用酯类物质提取产物后洗涤，在真空中富集产物，获得次氯酸识别分子；

（2）制备高浓度表面增强拉曼光谱活性基底

取质量比为1～2%的氯金酸溶液4.5～4.8mL，将其加入到90～100mL的超纯水中，加热至95～100℃，逐滴加入质量比为0.1～0.2%的柠檬酸钠溶液，持续煮沸并搅拌20分钟后冷却至室温，得到稳定的红色表面增强拉曼光谱活性基底——金胶；

将所述金胶放入离心管内高速离心5～10 分钟，取下层高浓度金胶胶体以备用；

（3）制备纳米探针

取浓度为10^-3～10^-4 M的次氯酸识别分子溶液，将其与步骤（2）获得的高浓度金胶胶体混合均匀，静置10～20分钟；然后将其放入离心管内高速离心5～10 分钟，取出上清液后将底部高浓度混合物重新分散，获得纳米探针；

（4）建立特征峰强度-浓度标准曲线图

将步骤（3）获得的纳米探针用便携式拉曼光谱仪对次氯酸钠溶液（体外实验建立标准曲线后测细胞内的次氯酸）进行表面增强拉曼光谱检测，获得其用于定性分析的表面增强拉曼光谱指纹图谱，建立特征峰强度-浓度标准曲线图，可用于定量分析；

（5）获得细胞中次氯酸的表面增强拉曼光谱图

取适量步骤（3）获得的纳米探针加入到细胞培养液中，使所述纳米探针孵化到样品细胞内；用便携式拉曼光谱仪对细胞中次氯酸进行表面增强拉曼光谱检测以获得该样品细胞中次氯酸的表面增强拉曼光谱图；

（6）对照和检测

将步骤（5）检测得到的表面增强拉曼光谱图与步骤（4）获得的表面增强拉曼光谱指纹图谱以及特征峰强度-浓度标准曲线图进行比较，定性和定量分析步骤（5）检测的细胞中的次氯酸。

进一步，步骤（1）所述的识别分子为能与次氯酸发生特异性反应的分子-2-巯基-4甲氧基苯酚。

进一步，步骤（1）所述的反应物为5-甲氧基-2-氧代-1,3-苯并氧硫杂环戊烯。

进一步，步骤（1）所述的强碱溶液为氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液。

进一步，步骤（1）所述的酸溶液为氯化氢溶液。

进一步，步骤（1）所述的酯类物质为乙酸乙酯。

进一步，步骤（2）所述的纯水为超纯水。

进一步，以步骤（2）的方法制备表面增强拉曼光谱活性基底——银胶胶体，具体方法如下：取硝酸银溶于纯水，配制质量比为0.01～0.02%的硝酸银溶液，加热至90～95℃，逐滴加入质量比为0.01～0.02%柠檬酸钠溶液，持续煮沸并搅拌20分钟后冷却至室温，得到稳定的灰色表面增强拉曼光谱活性基底——银胶；将所述银胶放入离心管内高速离心5～10 分钟，取下层高浓度银胶胶体以备用。

本发明细胞中次氯酸原位快速检测方法的积极效果是：

提供了一种利用表面增强拉曼光谱技术对细胞中次氯酸原位快速检测的新的方法，它具有检测和分析速度快、灵敏度高、样品用量少、定性能力强、抗光漂白、水干扰小等优点，可对细胞中的次氯酸进行原位快速定性和定量检测，检测灵敏度可达1μM以下。

附图说明

图1为本发明细胞中次氯酸原位快速检测方法的流程框图。

图2为实施例1的金胶胶体透射电镜图片。

图3为实施例1的探针分子的表面增强拉曼光谱指纹图。

图4为实施例1的探针分子与次氯酸反应后的表面增强拉曼光谱指纹图。

图5为实施例1的探针分子与次氯酸反应后的表面增强拉曼光谱指纹图特征峰强度-浓度标准曲线（1642cm^-1）。

图6为实施例1的探针孵化到细胞内的明场图。

图7为实施例1的探针孵化到细胞内的暗场图。

图8为实施例1细胞内次氯酸与纳米探针反应后的表面增强拉曼光谱原位快速检测图。

图9为实施例2细胞内次氯酸与纳米探针反应后的表面增强拉曼光谱原位快速检测图。

图10为实施例3的银胶胶体透射电镜图片。

图11为实施例3细胞内次氯酸与纳米探针反应后的表面增强拉曼光谱原位快速检测图。

图12为实施例4细胞内次氯酸与纳米探针反应后的表面增强拉曼光谱原位快速检测图。

具体实施方式

以下结合附图给出本发明细胞中次氯酸原位快速检测方法的具体实施方式，以对本发明进行详细的说明，但本发明的保护范围不限于以下的实施介绍，凡依照本发明的方法所作的等效的变化或变通，都应视为本发明保护的范畴。

实施例1

一种细胞中次氯酸原位快速检测方法，含有以下步骤（参见图1）：

（1）合成次氯酸识别分子

将5-甲氧基-2-氧代-1,3-苯并氧硫杂环戊烯与氢氧化钾溶液按1.5的当量比混合在一起，将所述混合溶液在氮气保护下搅拌6小时，然后加入2M氯化氢溶液，用乙酸乙酯提取产物后洗涤，在真空中富集产物，获得次氯酸识别分子。

（2）制备高浓度表面增强拉曼光谱活性基底

取质量比为1%的氯金酸溶液4.8mL，将其加入到100mL的超纯水中，加热至100℃（沸腾），逐滴加入质量比为0.1%的柠檬酸钠溶液10mL，持续煮沸并搅拌20分钟后冷却至25℃，得到稳定的红色表面增强拉曼光谱活性基底——金胶（参见图2）；将其放入离心管内高速离心5分钟，取下层高浓度金胶胶体以备用。

（3）制备纳米探针

取浓度为10^-3 M的次氯酸识别分子溶液，将其与步骤（2）获得的金胶胶体混合均匀，静置10分钟，然后将其放入离心管内高速离心5分钟，取出上清液后将底部高浓度混合物用超纯水重新分散至原体积，获得纳米探针。用便携式拉曼光谱仪获得所述纳米探针的表面增强拉光谱指纹图谱见图3。

（4）建立特征峰强度-浓度标准曲线图

将步骤（3）获得的纳米探针用便携式拉曼光谱仪对次氯酸钠溶液进行表面增强拉曼光谱检测，获得其用于定性分析的表面增强拉曼光谱指纹图谱（参见图4），建立特征峰强度-浓度标准曲线图（参见图5）可用于定量分析。

（5）获得细胞中次氯酸的表面增强拉曼光谱图

取适量步骤（3）获得的纳米探针加入到细胞培养液中，使所述纳米探针孵化到样品细胞内（参见图6、图7），用便携式拉曼光谱仪对细胞中次氯酸进行表面增强拉曼光谱检测以获得该样品细胞中次氯酸的表面增强拉曼光谱图（参见图8）。

（6）对照和检测

将步骤（5）检测得到的表面增强拉曼光谱图与步骤（4）获得的表面增强拉曼光谱指纹图谱以及特征峰强度-浓度标准曲线图进行比较，可初步定性确认步骤（5）获得的表面增强拉曼光谱图所对应的次氯酸浓度约为3μM。

实施例2

一种细胞中次氯酸原位快速检测方法，含有以下步骤：

（1）合成次氯酸识别分子

将5-甲氧基-2-氧代-1,3-苯并氧硫杂环戊烯与氢氧化钠溶液按1.5的当量比混合在一起，将所述混合溶液在氮气保护下搅拌7小时，然后加入3M氯化氢溶液，用乙酸乙酯提取产物后洗涤，在真空中富集产物，获得次氯酸识别分子。

（2）制备高浓度表面增强拉曼光谱活性基底

取质量比为2%的氯金酸溶液4.5mL，将其加入到90mL的超纯水中，加热至95℃（微沸），逐滴加入质量比为0.2%的柠檬酸钠溶液10mL，持续煮沸并搅拌20分钟后冷却至25℃，得到稳定的红色表面增强拉曼光谱活性基底——金胶；将其放入离心管内高速离心5分钟，取下层高浓度金胶胶体以备用。

（3）制备纳米探针

取浓度为10^-4M的次氯酸识别分子溶液，将其与步骤（2）获得的金胶胶体混合均匀，静置20分钟，然后将其放入离心管内高速离心10分钟，取出上清液后将底部高浓度混合物用超纯水重新分散至原体积，获得纳米探针。

（4）建立特征峰强度-浓度标准曲线图（同实施例1）。

（5）获得细胞中次氯酸的表面增强拉曼光谱图（同实施例1，参见图9）。

（6）对照和检测

将步骤（5）检测得到的表面增强拉曼光谱图与步骤（4）获得的表面增强拉曼光谱指纹图谱以及特征峰强度-浓度标准曲线图进行比较，可初步定性确认步骤（5）获得的表面增强拉曼光谱图所对应的次氯酸浓度约为5μM。

实施例3

一种细胞中次氯酸原位快速检测方法，含有以下步骤：

（1）合成次氯酸识别分子（同实施例1）。

（2）制备高浓度表面增强拉曼光谱活性基底

取硝酸银溶于纯水，配制质量比为0.01%的硝酸银溶液，加热至90℃（微沸），逐滴加入质量比为0.01%柠檬酸钠溶液2mL，持续煮沸并搅拌20分钟后冷却至25℃，得到稳定的灰色表面增强拉曼光谱活性基底——银胶（参见图10）；将其放入离心管内高速离心5分钟，取下层高浓度银胶胶体以备用。

（3）制备纳米探针

取浓度为10^-3M的次氯酸识别分子溶液，将其与步骤（2）获得的银胶胶体混合均匀，静置20分钟，然后将其放入离心管内高速离心5分钟，取出上清液后将底部高浓度混合物用超纯水重新分散至原体积，获得纳米探针。

（4）建立特征峰强度-浓度标准曲线图（同实施例1）。

（5）获得细胞中次氯酸的表面增强拉曼光谱图（同实施例1，参见图11）。

（6）对照和检测

将步骤（5）检测得到的表面增强拉曼光谱图与步骤（4）获得的表面增强拉曼光谱指纹图谱以及特征峰强度-浓度标准曲线图进行比较，可初步定性确认步骤（5）获得的表面增强拉曼光谱图所对应的次氯酸浓度约为1μM。

实施例4

一种细胞中次氯酸原位快速检测方法，含有以下步骤：

（1）合成次氯酸识别分子（同实施例2）。

（2）制备高浓度表面增强拉曼光谱活性基底

取硝酸银溶于纯水，配制质量比为0.02%的硝酸银溶液，加热至95℃，逐滴加入质量比为0.02%柠檬酸钠溶液2mL，持续煮沸并搅拌20分钟后冷却至25℃，得到稳定的灰色表面增强拉曼光谱活性基底——银胶；将其放入离心管内高速离心10 分钟，取下层高浓度银胶胶体以备用。

（3）制备纳米探针

取浓度为10^-4M的次氯酸识别分子溶液，将其与步骤（2）获得的银胶胶体混合均匀，静置20分钟，然后将其放入离心管内高速离心10分钟，取出上清液后将底部高浓度混合物用超纯水重新分散至原体积，获得纳米探针。

（4）建立特征峰强度-浓度标准曲线图（同实施例1）。

（5）获得细胞中次氯酸的表面增强拉曼光谱图（同实施例1，参见图12）。

（6）对照和检测

将步骤（5）检测得到的表面增强拉曼光谱图与步骤（4）获得的表面增强拉曼光谱指纹图谱以及特征峰强度-浓度标准曲线图进行比较，可初步定性确认步骤（5）获得的表面增强拉曼光谱图所对应的次氯酸浓度约为0.1μM。