一种利用指纹快速检测糖尿病的试剂盒的制作方法

本发明属于糖尿病检测技术领域，具体涉及一种对指纹上吸附物质成分进行表面增强拉曼光谱检测的试剂盒，更具体的说是利用所制备的高活性的表面增强拉曼活性的银-氧化亚铜/石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物基底溶液的试剂盒，通过浸泡指纹催化TMB显色反应，利用表面增强拉曼光谱技术区别糖尿病患者与正常人的SERS光谱信号。

背景技术：

糖尿病目前已经成为严重危害人类健康的一种疾病，糖尿病的预防和治疗已引起社会和医学界的广泛关注和医学界的高度重视，正确诊断糖尿病对于糖尿病的治疗和预防具有重要意义。糖尿病人需要长期监控血糖水平并服用药物，目前的常见的测血糖方法大都需要抽取血液，麻烦且有健康风险，因此，一种无损检测糖尿病的方法是很有价值的。目前已有无创性血糖监测系统已应用于临床，通过接触唇粘膜，利用分析吸收光谱测得；也有研究表明，利用红外热像图分析代谢参数，利用人体温度变化间接反映糖尿病病情，提高诊断的准确性。美国化学会评选出2016年10大研究成果其中之一是可穿戴传感器，韩国首尔大学Dae-Hyeong Kim教授领导的研究团队报告了基于石墨烯的可穿戴设备在糖尿病治疗领域的新用途(Nat.Nano.2016，11,566)。Kim等人发明的这种可穿戴贴片，贴在皮肤上，通过涉及葡萄糖氧化酶的电化学反映测量人体汗水中的葡萄糖含量来检测血糖水平，不过会造成任何创伤。然而该文章也介绍人体汗水中的葡萄糖含量是非常低的，需要通过给予糖尿病患者服用一定剂量的葡萄糖，再进行采样收集检测。另外目前仍未有无创性诊断糖尿病的标准，因此进行相关的此类研究具有一定的意义。

近几年来指纹学的研究取得了很大的进展，已经累计了丰富的资料，此类研究可以分为指纹特征形貌的研究和指纹上吸附物质的研究。前者主要研究潜指纹显现技术，这对案件的鉴定和分析的作用至关重要。后者为了检测指纹中的生物物质，常常利用抗原-抗体结合，免疫识别的方式，间接检测指纹中的物质。然而，真正采取指纹的信息直接读取识别指纹中的物质还很少见，因为人体内的葡萄糖主要存在于血液里，指纹之中随汗液分泌的葡萄糖含量是极低的，由于没有相关的超灵敏的检测方法，至今未有报道，因此，能够直接检测指纹中的化学物质-葡萄糖，提高技术的便捷性是很有意义的。

表面增强拉曼光谱(SERS)效应在近几年的应用非常广泛，SERS基底表面为微纳米结构，且具有选择性好、灵敏度高等特点。对于某些分子的检测，SERS检测的灵敏度可以比常规拉曼光谱的检测高出数百万倍。在SERS的应用过程中，快速制备出稳定的SERS基底，为SERS手段的快速检测奠定了基础。近年来，SERS在生物医学领域的应用越来越广泛，SERS不仅可以快速得到分析结果，而且还可以监控反应过程，最主要是其高灵敏度，对痕量物质的检测具有十分重要的意义，因此制备一种具有高灵敏度的SERS基底，为检测指纹中的生物物质提供了可能。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种无创伤的利用指纹快速检测糖尿病的试剂盒，进而可以利用指纹信息快速区分糖尿病患者与正常人。该试剂盒包括：一个指纹收集装置和一种指纹葡萄糖快速检测试剂。指纹需在洗手后30～40min后收集；所述的指纹收集装置为干净的玻璃片；所述的指纹葡萄糖快速检测试剂由3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液和银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液组成。其中复合物SERS基底溶液既具有SERS活性，又具有催化活性，催化活性可以催化TMB的电荷转移反应，SERS活性可以使TMB氧化产物的拉曼信号得到极大增强。

此种试剂盒的优点：一是利用此种试剂盒检测糖尿病的无创性，可以减轻患者检查时的痛苦；二是此种试剂盒的SERS基底溶液制备更加便捷，制备过程中无需加热或其他条件限制，制备时间短，对制备人员无技术要求；三是此种试剂盒的SERS基底溶液可回收检测，性能十分稳定；四是指纹葡萄糖快速检测试剂具有葡萄糖氧化酶及类过氧化物酶的性质，可以催化显色反应，实现对葡萄糖的超低浓度检测，并且可以通过SERS信号的强度定性的对糖尿病患者和正常人的指纹信息进行识别，此种试剂盒主要的功能是区分血糖浓度在10～20mM的糖尿病患者与正常人。

本发明通过在室温下两步原位还原成功制备银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底；催化葡萄糖反应以及TMB反应并且能够原位监控反应；利用指纹对糖尿病人及正常人进行区分等步骤。通过简单的步骤制备了SERS试剂盒，负载葡萄糖氧化酶后得到的基底可以与葡萄糖发生反应，并且可以串联引发TMB的催化反应并对其进行检测。此方法制备的SERS试剂盒方法简便，省时省力。制备的基底更稳定，可重复使用，便于检测。对葡萄糖的检测实现了超低检测限，并能够利用指纹对糖尿病人和病人进行区分。本发明所述基底对于生物传感，刑侦调查及医学诊断具有潜在的应用价值。

利用本发明所述的试剂盒通过指纹快速检测糖尿病的具体步骤包括：(a)收集糖尿病患者和正常人的指纹；(b)制备银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液；(c)利用此种试剂盒实现对葡萄糖的超灵敏检测和超低检测限，其是将复合物SERS基底悬浊液加入到TMB溶液中，得到葡萄糖快速检测试剂，用于检测葡萄糖，得到SERS谱图；(d)用该基底区别糖尿病患者和正常人的指纹，得到SERS谱图。

上述步骤(a)所述的收集糖尿病患者和正常人指纹的过程：糖尿病患者和正常人用清水洗手30～40min后，在洗干净的玻璃片上按下指纹，然后放置在3～5℃冰箱中保存；

上述步骤(b)制备银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液的过程：配制浓度为0.4～0.6mg/mL氧化石墨烯水分散液，取氧化石墨烯分散液加入到0.9～1.1mg/mL的硝酸铜水溶液(氧化石墨烯和硝酸铜的质量量比例为1.5：45～55，搅拌1.5～2.5h，利用静电作用使二者吸附；

配置浓度为4.8～5.2mM的水合肼(N₂H₄·H₂O)水溶液，取1mL水合肼水溶液加入上述溶液中，反应1.5～2.5h后，将反应溶液于4000～6000rad/min转速下离心，再分别用水和乙醇洗涤沉淀3～5次，产物于50～70℃干燥10～20h，得到氧化亚铜/还原石墨烯复合物；

配置0.15～0.25mg/mL的氧化亚铜/还原石墨烯复合物水溶液，取40mL该水溶液加入15mL、4.8～5.2mM的硝酸银水溶液中，搅拌反应1～2h，将反应溶液于5000～8000rad/min转速下离心，再分别用水和乙醇洗涤沉淀3～5次，产物于50～70℃干燥10～20h，得到银-氧化亚铜/还原石墨烯复合物SERS基底；

配置0.9～1.2mg/mL的银-氧化亚铜/还原石墨烯复合物SERS基底的水溶液，等体积加入到1.0～1.4mg/mL葡萄糖氧化酶水溶液中，得到银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液；

上述步骤(c)所述将该基底用于葡萄糖检测的过程：首先配制3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的二甲基亚砜溶液，再用pH＝4.0～4.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释，得到浓度为2.8～3.2mM的TMB显色液；然后取多份20μL上述TMB显色液分别与20μL、不同浓度的葡萄糖水溶液(浓度为10^-3～10^-8mol/L)混合后分别加入到多份、20μL步骤(b)制备的银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液中，30～40℃条件下分别浸泡20～30min后，由于复合物SERS基底具有类过氧化物酶的催化性质，可以生成一种显色物，又由于该基底具有较高的SERS增强能力，进而可以利用SERS原位检测葡萄糖浓度；

上述步骤(d)所述的指纹检测过程：首先配制3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的二甲基亚砜溶液，再用pH＝4.0～4.2的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释，得到浓度为2.8～3.2mM的TMB显色液；再将印有糖尿病患者指纹或正常人指纹的玻璃片、100μL上述TMB显色液加入到100μL步骤(b)制备的银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液中，30～40℃条件下分别浸泡20～30min后进行SERS检测，从而通过对糖尿病患者和正常人指纹中葡萄糖SERS谱图信息的比对，实现对糖尿病患者的筛查。

附图说明

图1：实施例1所述的加入不同浓度葡萄糖溶液后的SERS光谱图。其中曲线0M表示不添加葡萄糖溶液的空白对照谱图，其他曲线分别表示加入葡萄糖浓度为1×10^-3mol/L、1×10^-4mol/L、1×10^-5mol/L、1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L。从图中可以看出，对葡萄糖的检测下限浓度可以达到1×10^-8mol/L，说明该试剂盒对葡萄糖的检测有很高的灵敏度。

图2：实施例2所述的加入糖尿病患者和正常人指纹后的SERS光谱图。其中曲线19.98mM表示对血糖浓度为19.98mM的糖尿病患者的指纹检测得到的SERS谱图，曲线5.56mM表示对血糖浓度为5.56mM的正常人的SERS谱图。

具体实施方式

实施例1：一种利用指纹快速检测糖尿病的试剂盒对葡萄糖的超低浓度检测

1)配制浓度为0.5mg/mL氧化石墨烯水分散液，取3mL氧化石墨烯分散液加入到50mL硝酸铜(1mg/mL)水溶液中，搅拌2.0h，利用静电作用使二者吸附；然后配置浓度为0.5mM的水合肼(N₂H₄·H₂O)水溶液，取1mL水合肼水溶液加入上述溶液中，反应2h后将反应溶液于5000rad/min转速离心，再分别用水和乙醇洗涤沉淀3次，得到产物60℃干燥12h，还原得到氧化亚铜/还原石墨烯复合物；配置0.2mg/mL的氧化亚铜/还原石墨烯复合物水溶液40mL加入15mL、5mM的硝酸银水溶液中，搅拌反应1.5h后将反应溶液于7000rad/min转速离心，再分别用水和乙醇洗涤沉淀3次，得到产物60℃干燥，得到银-氧化亚铜/还原石墨烯复合物SERS基底；配置10mL、1mg/mL的还原银-氧化亚铜/石墨烯复合物SERS基底的水溶液，等体积加入到10mL、1.2mg/mL葡萄糖氧化酶水溶液中，得到银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液；

2)首先用二甲基亚砜配制15mM的TMB的溶液，然后用pH＝4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释，得到浓度为3mM的TMB显色液；取7份、各20μL的上述TMB显色液分别与20μL不同浓度(1×10^-3mol/L、1×10^-4mol/L、1×10^-5mol/L、1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L、0mol/L)的葡萄糖水溶液混合，然后再分别加入到7份、各20μL步骤(1)制备的SERS基底水溶液中，分别在37℃浸泡26min后进行SERS检测，得到该试剂盒对葡萄糖的检测限。

3)采用LabRAMAN Ramis智能全自动拉曼光谱仪进行检测，得到不同浓度葡萄糖水溶液与SERS基底溶液反应后溶液的SERS谱图，如图1所示。在图1中，其中曲线0M表示不添加葡萄糖水溶液的空白对照谱图，其他曲线分别表示加入葡萄糖浓度为1×10^-3mol/L、1×10^-4mol/L、1×10^-5mol/L、1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L。经过与0M葡萄糖作为背景拉曼谱图的对比可以看出，位于1189cm^-1、1335cm^-1、1605cm^-1处的峰强度随着葡萄糖浓度的降低也呈现减小的趋势，当葡萄糖浓度达到10^-8mol/L时，位于1189cm^-1处的峰强度仍然可以观察到，所以最低的检测浓度可以达到10^-8mol/L，这说明该试剂盒具有对葡萄糖检测具有很高的灵敏度，可以实现对葡萄糖浓度的定量分析。

实施例2：一种利用指纹快速检测糖尿病的试剂盒对指纹的鉴识检测

1))配制浓度为0.5mg/mL氧化石墨烯水分散液，取3mL氧化石墨烯分散液加入到50mL硝酸铜(1mg/mL)水溶液中，搅拌2.0h，利用静电作用使二者吸附；然后配置浓度为0.5mM的水合肼(N₂H₄·H₂O)水溶液，取1mL水合肼水溶液加入上述溶液中，反应2h后将反应产物于5000rad/min转速离心，再分别用水合乙醇洗涤沉淀3次，得到产物60℃干燥12h，还原得到氧化亚铜/还原石墨烯复合物；配置0.2mg/mL的氧化亚铜/还原石墨烯复合物水溶液40mL加入15mL、5mM的硝酸银水溶液中，搅拌反应1.5h后将反应溶液于7000rad/min转速离心，再分别用水和乙醇洗涤沉淀三次，得到产物60℃干燥，得到银-氧化亚铜/还原石墨烯复合物SERS基底；配置10mL、1mg/mL的银-氧化亚铜/还原石墨烯复合物SERS基底水溶液，等体积加入到10mL、1.2mg/mL葡萄糖氧化酶水溶液中，得到银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液；

2)糖尿病患者和正常人用清水洗手30min后，在洗干净的玻璃片上按下指纹，然后放置在4℃冰箱中保存。

用二甲基亚砜配制15mM的TMB溶液，然后用pH＝4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释，得到浓度为3mM的TMB显色液；再取3份各100μL上述TMB显色液，与印有糖尿病人指纹、正常人指纹以及没有指纹附着的玻璃片分别加入到3份各100μL步骤(1)制备的银-氧化亚铜/还原石墨烯/葡萄糖氧化酶复合物SERS基底溶液中，分别在37℃浸泡26min后进行SERS检测。

3)采用LabRAMAN Ramis智能全自动拉曼光谱仪进行检测，得到反应后的SERS谱图，如图2所示。在图2中，其中曲线0M表示没有指纹附着的玻璃片放入复合物SERS基底溶液和TMB溶液后的拉曼图，其中曲线19.98mM表示在取得指纹同时用标准血糖检测方法测得的对血液检测结果，血糖浓度为19.98mM的糖尿病人的指纹检测得到的SERS谱图，曲线5.56mM表示血液检测结果血糖浓度为5.56mM的正常人的SERS谱图，经过与其中曲线0M背景拉曼谱的对比可以看出，位于1189cm^-1处的峰强度在糖尿病人的指纹的反应中才会得以显现，而正常人位于1189cm^-1处的峰强度与曲线0M背景拉曼谱近似，因此可以定性分析区分糖尿病患者和正常人。