一种复方木鸡颗粒质量控制的方法与流程

本发明属于药物分析
技术领域：
，尤其涉及一种复方木鸡颗粒质量控制的方法。
背景技术：
：复方木鸡颗粒是在“木鸡汤”基础上发展而来的，主要由云芝，菟丝子，山豆根，核桃楸皮四味中药组成，自1985年问世以来，因其能够特异性地抑制甲胎蛋白(afp)升高，在临床中广泛应用，主要用于肝炎，肝硬化，肝癌的治疗，其疗效显著；然而，历版的《中国药典》尚未收载复方木鸡颗粒，其仅被收载于《卫生部药品标准》（中药成方制剂第十六册）中，并尚未建立其有机成分的质量控制方法，因此，建立一种复方木鸡颗粒质量控制的方法具有实际意义。目前，中药指纹图谱已成为国内外广泛接受的全面评价多维组分复杂样品质量模式的一种方法，主要采用相应的分析手段，获得能够标示中药材及中药制剂化学特征的图谱，从而用于其质量真实性、优良性和稳定性的评价。本发明采用了中药指纹图谱技术的分析手段，从整体上为合理有效地控制复方木鸡颗粒的质量提供了分析方法，也为明确复方木鸡颗粒的化学成分及其成分之间药效学研究奠定基础；然而，由于复方木鸡颗粒对应病症的不同以及疗效的差异，为准确反应其化学成分与药效之间的关联性，本发明在以药效为导向的基础上，开展复方木鸡颗粒的质量控制方法，不仅为明确地阐述其指纹特征与药效的关系提供依据，也为合理地、有效地控制复方木鸡颗粒中活性成分的质量奠定基础，更为以药效为导向的质量生产和临床合理用药提供理论依据。本发明前期针对中药成方制剂-复方木鸡颗粒申报了“一种治疗肝硬化、肝炎、肝癌的中药及其生产方法”的专利（专利号：cn02144684.9），保护了它的制备工艺，本发明在此基础上，采用高效液相色谱法，建立复方木鸡颗粒中4味药材不同比例组合的色谱图，并测定各配伍组抗肝炎作用的体内药效，利用灰色关联分析软件，将两者结果联系起来，建立有实际意义的中药“谱效关系”，为进一步反映复方木鸡颗粒与其抗肝炎作用的质量标准构建方法，同时，应用液质联用技术对关联系数大于0.67的药效成分进行指认。以药效为导向，运用高效液相色谱仪，测定复方木鸡颗粒中有效成分的含量，并建立了11批次复方木鸡颗粒的指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度的评价系统软件”对其相似度进行评价，从而为其在企业生产上工艺的稳定性和质量的可控性提供准则；本发明的方法能够全面、系统、合理及有效的控制复方木鸡颗粒活性成分质量，可作为评价复方木鸡颗粒内在质量的方法，同时，本发明也可有效的保证其在生产和使用过程中的质量，为其在临床用药的安全性和有效性提供了保障，也为复方木鸡颗粒中多指标的测定提供了一套较完善的检测方法；因此，本发明的方法在实际应用中具有一定的指导性和应用价值。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供一种复方木鸡颗粒质量控制的方法。该方法可以全面、合理、系统和有效的控制复方木鸡颗粒有效成分的质量。为实现上述目的，采用的技术方案是：一种复方木鸡颗粒质量控制的方法，其特征在于包括下述步骤：1、供试品溶液的制备：采用按4因素9水平均匀设计方案，分别称取不同比例组合各单味药材的剂量，混合均匀，即由云芝、山豆根、菟丝子和核桃楸皮四味中药材，组成以下九个配伍组：（1）、核桃楸皮2.455g、山豆根4.909g、菟丝子19.636g，总量27g；（2）、云芝5.063g、核桃楸皮5.063g、山豆根7.875g、菟丝子9.000g、总量27g；（3）、云芝10.800g、核桃楸皮9.000g、山豆根2.400g、菟丝子4.800g，总计27g；（4）、云芝12.150g、核桃楸皮9.450g、山豆根5.400g，总计27g；（5）、云芝14.729g、山豆根0.818g、菟丝子11.456g，总计27g；（6）、云芝15.002g、核桃楸皮2.000g、山豆根3.334g、菟丝子6.668g，总计27g；（7）、云芝18.691g、核桃楸皮4.154g、菟丝子4.154g，总量27g；（8）、云芝18.286g、核桃楸皮5.225g、山豆根2.322g、菟丝子1.161g，总计27g；（9）、云芝13.500g、核桃楸皮4.500g、山豆根3.000g、菟丝子6.000g，总计27g。将上述九组中药材分别混合均匀，并分别置于圆底烧瓶中，加入10倍量水回流提取二次，每次3h，合并滤液并挥干[注是擦干还是烘干]，然后，准确称取各配伍组生药量为27g的干膏细粉，精密加入10ml70%的甲醇溶液超声提取60min，室温静止，称定重量后，加70%甲醇补足失重，取续滤液经0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。2、高效液相色谱条件。采用agilent-1260系列的高效液相色谱仪，应用agilent-c18（4.6mmx100mm，2.7μm）的色谱柱，以乙腈(a）-0.04%甲酸水(b)为流动相依次进行梯度洗脱：0~13min，1%~6%a；13~19min，6%~8%a；19~32min，8%~13%a；32~34min，13%~13%a，34~44min，13%~17%a，44~52min，17%~21%a，52~86min，21%~41%a，流速为1ml·min-1，柱温30℃，检测器：二极管阵列检测器（dad）；检测波长254nm，进样量5µl。特征色谱峰的提取。根据对照指纹图谱（r）中峰面积满足定性及定量要求的色谱峰进行提取，指纹图谱中特征峰的保留时间分别为：4.041min、5.028min、5.691min、6.163min、6.469min、11.850min、13.942min、16.518min、18.463min、19.715min、20.387min、21.372min、23.835min、29.405min、40.395min、41.916min、45.416min、55.307min、76.904min。4、灰色关联分析。将提取得到的色谱峰峰面积作为子序列，将药效指标的综合评分作为母序列进行灰色关联分析，获得不同色谱峰抗肝炎作用的关联系数。5、色谱峰指认。利用液质联用的技术手段，将关联系数大于0.67的色谱峰，依据分子离子峰和碎片离子峰的分子量进行指认后得出以下信息：tr=16.518min的峰为2,6-二没食子酰基-葡萄糖、tr=19.715min的峰为双绿原酸、tr=21.372min的峰为1,6-二没食子酰基-葡萄糖、tr=23.835min的峰为绿原酸、tr=40.395min的峰为异槲皮苷、tr=55.307min的峰为槲皮素。6、对照品溶液的制备。分别精密称取绿原酸对照品、异槲皮苷对照品、槲皮素对照品适量，置于同一10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得绿原酸、异槲皮苷、槲皮素浓度分别为25.880μg·ml-1、24.800μg·ml-1、34.400μg·ml-1的混合对照品溶液。7、复方木鸡颗粒有效成分的含量测定。称取复方木鸡颗粒粉末约10.0g，加100ml70%甲醇超声提取（功率700w，频率40khz）60分钟，取出后，放冷，称定重量，用70%甲醇补足失重，摇匀，滤过并挥至尽干，所得浸膏加40ml水溶解后，再加入等体积的乙酸乙酯，剧烈震荡30s，重复萃取三次，每次静止30min，分取及合并有机层，挥干，然后用甲醇将其转移至10ml容量瓶中，经0.22μm滤膜过滤，即得复方木鸡颗粒供试品溶液；按制备的复方木鸡颗粒供试品溶液及上述色谱条件测定有效成分的峰面积，计算样品中药效成分的含量，并进行专属性、稳定性，重复性，精密度以及线性范围等方法学的考察。8、获得11批次复方木鸡颗粒指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004a）软件”，按中位数法计算生成标准对照指纹图谱，并评价其相似度。本发明的有益效果：本发明首次采用中药指纹图谱技术建立了复方木鸡颗粒的指纹图谱，通过该技术有效地表征了复方木鸡颗粒的化学成分，为以药效为导向的质量控制奠定基础，也为快速，准确的检测木鸡颗粒中化学成分的含量提供分析手段。本发明首次公开了不同批次复方木鸡颗粒的指纹图谱，也首次应用了“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004a）软件”对其相似进行评价，为企业验证复方木鸡颗粒生产工艺的稳定提供了方法，也为合理有效地阐述其质量的稳定性，药效的可靠性提供了理论依据。本发明首次以药效为导向，采用高效液相色谱仪，建立了复方木鸡颗粒中有效成分的质量控制方法，为其在工业生产上的质量控制提供标准，也为其在临床用药的安全性和有效性提供了保障。附图说明图1空白溶液色谱图。图2复方木鸡颗粒供试品溶液色谱图。图311批次复方木鸡颗hplc粒指纹图谱。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述一种复方木鸡颗粒的质量控制方法。一种复方木鸡颗粒质量控制的方法，包括下述步骤：1.仪器与试药1.1仪器安捷伦1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；agilent6550精确质量四极杆飞行时间（q-tof）lc/ms系统（美国安捷伦公司）；超纯水处理装置（milli-q，美国millipore公司）；kq5200b型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；sartoriuscp225d电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；shz-dⅲ型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；hhs型电子恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。1.2试药云芝、山豆根、菟丝子、核桃楸皮药材也由丹东药业集团有限公司提供，通过辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定，分别为多孔菌科真菌彩绒革盖菌coriolusversicolor（l.exfr.）quel的干燥子实体，豆科植物越南槐sophoratonkinensisgagnep.的干燥根和根茎，旋花科植物菟丝子cuscutachinensislam.的干燥种子，桃科胡桃属植物核桃揪juglansmandehurieamaxim.的树皮；不同批次复方木鸡颗粒均来自丹东药业集团有限公司，（批号：1号：151201100；2号:151203102；3号：16010188；4号：16010222；5号：1503032；6号：151107100；7号：15100287；8号：151202101；9号：16050226；10号：16050224；11号：16050225）；绿原酸，异槲皮苷，槲皮素（均购自于成都普菲德生物技术有限公司）；乙腈（色谱纯美国tedia公司）；甲酸（色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水。2.方法与结果2.14味药材不同比例组合的均匀设计关系复方木鸡颗粒由四味药材组成，分别为云芝提取物，核桃楸皮，山豆根，菟丝子；因此，本实验选用u9（96）均匀设计表，以4味药材作为四个考察因素，每个因素设置九个水平安排实验，其中4味药材不同比例组合的具体关系，见表1。表14味药材不同比例组合的均匀设计关系表2.2供试品溶液的制备按4因素9水平均匀设计表安排的实验，分别称取不同比例组合各单味药材的剂量，混合均匀，置圆底烧瓶中，加入10倍量水回流提取二次，每次3h，合并滤液并挥干，然后，准确称取各配伍组生药量为27g的干膏细粉，精密加入10ml70%的甲醇溶液超声提取60min，室温静止，称定重量后，加70%甲醇补足失重，取续滤液经0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。2.3不同配伍组药效的综合评分结果每天相同的时间，将各配伍组大鼠以2.43g·kg-1的剂量灌胃给予相应的药液，空白组、模型组大鼠灌入等体积的生理盐水，同时，每周大鼠以70mg·kg-1的剂量给予1%den，直至4周后，各组大鼠进行摘眼球取血，离心收集血清；并摘取大鼠肝脏后称定重量；用elisa试剂盒检测血清中天门冬氨酸氨基转移酶（ast）、丙氨酸氨基转移酶（alt）的含量、同时，计算肝指数（肝指数=肝脏重量/大鼠体重x100），具体结果见表2。表2不同配伍组药效的综合评分组别肝指数altast综合评分空白组2.204±0.340*41.233±4.767*98.700±20.382*-模型组2.666±0.60359.813±0.601206.381±22.912-配伍12.351±0.44446.296±3.441*162.463±11.8090.711配伍21.956±0.392*50.792±2.823200.804±12.4200.629配伍32.257±0.227*58.435±5.828184.625±10.200.607配伍42.342±0.38651.074±0.682175.038±3.889*0.657配伍52.057±0.308*52.804±10.831185.775±2.0680.637配伍62.192±0.225*35.638±7.320198.363±0.9900.747配伍72.082±0.255*50.554±4.372136.850±16.281*0.756配伍82.092±0.243*64.004±0.224186.838±16.9350.587配伍92.068±0.195*44.107±5.892*148.988±3.217*0.765注：*为p<0.052.4数据处理采用spss19.0统计软件分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，当p<0.05时，表示差异有统计学意义。2.5液相色谱条件采用agilent-1260系列的高效液相色谱仪，应用agilent-c18（4.6mmx100mm，2.7μm）色谱柱，以乙腈(a）-0.04%甲酸水(b)为流动相进行梯度洗脱（0~13min，1%~6%a；13~19min，6%~8%a；19~32min，8%~13%a；32~34min，13%~13%a，34~44min，13%~17%a，44~52min，17%~21%a，52~86min，21%~41%a），流速1ml·min-1，柱温30℃，检测器：二极管阵列检测器（dad），检测波长254nm，进样量5µl。2.6.灰色关联分析根据对照指纹图谱（r）中峰面积满足定性及定量要求的色谱峰进行提取，将提取的19个色谱峰的峰面积与药效的综合评分进行关联，获得其对应的关联系数，具体结果见表3。表3提取的色谱峰峰面积与药效综合评分的关联系数峰号保留时间tr（min）关联系数峰号保留时间tr（min）关联系数14.0410.52861120.3870.545625.0280.50841221.3720.993735.6910.62881323.8350.882746.1630.65691429.4050.604956.4690.66781540.3950.9868611.8500.53351641.9160.5876713.9420.62571745.4160.5952816.5180.69271855.3070.7774918.4630.59111976.9040.61451019.7150.6774---------2.7色谱峰的指认采用uplc-q-tof-ms质谱分析技术，通过对其分子离子峰和碎片离子峰的分子量与相应的对照品及中药数据库进行比对分析后，确定了关联系数大于0.67的色谱峰的化学成分，具体鉴定结果如表4所示。表4色谱峰的指认结果峰号保留时间tr(min)[m-h]-色谱峰指认名称816.518483.08022,6-二没食子酰基-葡萄糖1019.715707.1856双绿原酸1221.372483.08011,6-二没食子酰基-葡萄糖1323.835353.0887绿原酸1540.395463.0903异槲皮苷1855.307301.0370槲皮素3复方木鸡颗粒中有效成分的含量测定3.1复方木鸡颗粒供试品溶液的制备精密称取复方木鸡颗粒粉末约10.0g，加100ml70%甲醇超声提取（功率700w，频率40khz）60分钟，取出后，放冷，称定重量，用70%甲醇补足失重，摇匀，滤过并挥至尽干，所得浸膏加40ml水溶解后，再加入等体积的乙酸乙酯，剧烈震荡30s，重复萃取三次，每次静止30min，分取及合并有机层，挥干，然后用甲醇将其转移至10ml容量瓶中，经0.22μm滤膜过滤，即得复方木鸡颗粒供试品溶液。3.2混合对照品溶液制备分别精密称取绿原酸对照品、异槲皮苷对照品、槲皮素对照品适量，置于同一10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得绿原酸、异槲皮苷、槲皮素浓度分别为25.880μg·ml-1、24.800μg·ml-1、34.400μg·ml-1的混合对照品溶液。3.3复方木鸡颗粒中有效成分的含量测定取复方木鸡颗粒样品，按“3.1”条件下方法制备复方木鸡颗粒供试品溶液，按“2.5”项下的液相色谱条件进行检测，测定复方木鸡颗粒的峰面积和相对保留时间，并以外标一点法，计算绿原酸、异槲皮苷、槲皮素的含量，同时，以槲皮素的含量为基础，计算2,6-二没食子酰基-葡萄糖、1,6-二没食子酰基-葡萄糖的相对含量，以绿原酸的含量为基础，计算双绿原酸的相对含量。则复方木鸡颗粒中有效成分2,6-二没食子酰基-葡萄糖、双绿原酸、1,6-二没食子酰基-葡萄糖、绿原酸、异槲皮苷、槲皮素的含量分别为22.42μg·g-1、49.32μg·g-1、3.56μg·g-1、21.48μg·g-1、11.38μg·g-1、28.30μg·g-1。3.4复方木鸡颗粒的方法学考察3.4.1标准曲线的建立精密吸取“3.2”项下混合对照品溶液，用色谱甲醇稀释成不同质量浓度梯度芦丁，槲皮素混合对照品溶液，按照“2.5”项下色谱条件进样含量测定及图谱采集，以各成分峰面积y为纵坐标，以进样量x（μg）为横坐标，绘制标准曲线并采用标准曲线对供试品含量进行测定，绿原酸线性回归方程为y=1905.8x+0.5553，r=0.9998，线性范围为0.0138~0.1797μg；异槲皮苷线性回归方程为y=3370x+0.625，r=0.9995，线性范围为0.0248~0.1736μg；槲皮素线性回归方程为y=4860x-7.828，r=0.9995，线性范围为0.0344~0.2408μg；绿原酸、异槲皮苷、槲皮素3个成分在线性范围内与峰面积线性关系良好，可用于木鸡颗粒中有效成分的含量测定。3.4.2精密度试验精密吸取同一供试品溶液5μl，按“2.5”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积值。结果绿原酸、异槲皮苷、槲皮素含量的rsd分别为1.00%、1.08%、1.56%，保留时间的rsd分别为0.07%、0.09%、0.05%，表明仪器精密度良好。3.4.3稳定性试验按“3.1”项下方法制备供试品溶液一份，于室温放置0，2，4，6，8，12，24h，按“2.5”项下色谱条件，以峰面积为指标进样分析。结果绿原酸、异槲皮苷、槲皮素含量的rsd分别为0.99%、1.11%、1.45%，保留时间的rsd分别为0.08%、0.11%、0.05%，表明供试品溶液在24h内稳定。3.4.4重复性试验取同一批木鸡颗粒粉末6份，精密称定，按“3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.5”项下色谱条件进行分析。结果绿原酸、异槲皮苷、槲皮素含量的rsd分别为4.82%、3.20%、2.80%，保留时间的rsd值分别为0.08%、0.11%、0.06%，表明方法重复性良好。3.5复方木鸡颗粒指纹图谱的建立取11批复方木鸡颗粒样品，按“3.1”条件下方法制备供试品，按“2.5”条件下的色谱分析方法进行检测，记录86min内色谱峰的峰面积和相对保留时间。分别精密吸取了甲醇溶液、复方木鸡颗粒供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪进行图谱采集，如图1、图2所示。由结果表明，在此条件下空白甲醇无干扰。3.6共有模式的建立及相似度评价将11批复方木鸡颗粒hplc指纹图谱导入中华人民共和国药典委员会指纹图谱相似度评价软件（2004a版）进行分析处理。以中位数进行计算，生成木鸡颗粒的标准指纹图谱，以此为基准，计算样品共有色谱峰与共有模式的相似度，对其相似度进行评价，则11批复方木鸡颗粒指纹图谱如图3所示，其相似度评价的具体结果见表5。表5不同批次复方木鸡颗粒相似度评价结果样品s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10s11s110.9960.9980.9980.9840.9970.9580.9510.9670.9650.965s20.99610.9980.9980.9880.9990.9630.9510.9740.9720.973s30.9980.99810.9990.9880.9990.9620.9550.9720.9710.971s40.9980.9980.99910.9880.9990.9640.9570.9740.9730.972s50.9840.9880.9880.98810.9880.9790.9660.9820.9820.982s60.9970.9990.9990.9990.98810.960.9530.9730.9710.971s70.9580.9630.9620.9640.9790.9610.9780.9880.9870.988s80.9510.9510.9550.9570.9660.9530.97810.990.9910.989s90.9670.9740.9720.9740.9820.9730.9880.9910.9990.999s100.9650.9720.9710.9730.9820.9710.9870.9910.99910.999s110.9650.9730.9710.9720.9820.9710.9880.9890.9990.9991r0.9860.990.990.9910.9930.990.9840.9820.9940.9930.993注；r为对照指纹图谱依据以上结果可知，与对照指纹图谱相比，11批复方木鸡颗粒的相似度均大于0.900，验证了复方木鸡颗粒生产工艺的稳定，同时，本研究建立的中药复方制剂木鸡颗粒的hplc指纹图谱方法具有可行性，因此，为其药效的稳定性，质量的可控性，用药的安全性提供保障。当前第1页12