一种检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法与流程

本发明属于化学检测领域，涉及一种源自人体的血液或尿液中离子的检测方法，尤其涉及一种检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法。

背景技术：

硫化氢(hydrogensulfide,h2s)为无色剧毒气体，有刺激性的臭鸡蛋气味。人体吸入剧毒硫化氢气体后，会损伤肺泡毛细血管，破坏肺泡表面活性物质，可造成呼吸道黏膜的急性损伤和急性肺水肿；吸入少量高浓度硫化氢可引起呼吸骤停，造成电击样死亡。由于在许多工业生产、生活环境中，如采矿、造纸、废水处理、下水道清理等过程中都有硫化氢的存在，因此硫化氢中毒事故频发不断。

源自人体的血液和尿液中硫化氢测定是确认中毒的依据，但一直是临床毒物学和法医毒物学领域的难点。shen等人(measurementofplasmahydrogensulfideinvivoandinvitro[j].freeradicalbiology&medicine,2011,50(9):1021-1031)的研究发现，硫化氢在体内大部分经氧化代谢形成硫代硫酸盐和硫酸盐。硫代硫酸根离子为硫化氢的体内代谢物，在硫化氢中毒判定上非常有价值，这是因为：虽然正常人群血液和尿液中均含有硫代硫酸根离子，但浓度极低；kawanishi等人报道的12例健康成人中(kawanishit,togawat,ishigamia,etal.determinationofthiosulfateinhumanurineandplasmabyhighperformanceliquidchromatographywithadualelectrochemicaldetector.[j].bunsekikagaku,1984,33(7):e295-e300)，血液和尿液中的硫代硫酸根离子平均浓度分别为＜0.003μmol/ml和＜0.007μmol/ml。而且，硫代硫酸根离子在生物检材中稳定，所以，在中毒死亡案例中，血液中硫代硫酸根离子可进一步确证血液中硫离子测定结果；对于中毒抢救病人，吸入硫化氢气体4～15h后血液中已无法检出硫离子和硫代硫酸根离子，因此，目前公认的，对于硫化氢中毒病人，尿液中硫代硫酸根离子是唯一指标(chwatko,balde.determinationofthiosulfateinhumanurinebyhighperformanceliquidchromatography[j].talanta,2009,79(2):229-234)。体液中硫代硫酸根离子含量与中毒者所处场所空气中硫化氢的浓度及进入该环境到死亡之间时间的长短有关；一般而言，若中毒者吸入高浓度的硫化氢，则血液中硫离子浓度较高，死亡较快，尿液中的硫代硫酸根离子浓度较低；反之，如果血液中硫离子浓度较低，则死亡较慢或不会死亡，硫化氢则主要在体内代谢成为硫代硫酸根离子进入尿中。

由此可见，可通过检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的浓度而间接测定硫化氢的中毒情况。

因此，检测源于硫化氢中毒的硫代硫酸根离子浓度，可以为临床急救和刑侦调查提供明确的方向。并且，如何准确地测定源于硫化氢中毒的硫代硫酸根离子浓度，一直是本领域科研人员致力于研究的重点。目前，对硫代硫酸根离子的测定多采用高效液相色谱(姚守仁,于淑坤,罗思泉.水中亚硫酸根、硫离子和硫代硫酸根离子的高速液相色谱分析[j].环境科学,1981(6))，离子色谱(任华忠,封家福,伍朝君.离子色谱法测定注射用硫代硫酸钠中的亚硫酸盐和硫酸盐[j].华西药学杂志,2015,30(1))，电催化氧化和离子色谱检测(ji-mingxu,wangyp,xianyz,etal.electrocatalyticoxidationandionchromatographydetectionofs2o3^2-,so3^2-,i-andscn-atglassycarbonelectrodewithfunctionalizedmulti-wallcarbonnanotubesfilm[j].chemicalresearchinchineseuniversities,2004,20(5):529-533)，分光光度法(熊建华，紫外分光光度法测定溶液中硫代硫酸钠含量[j].医药导报,2004,23(11):866-866)，毛细管电泳(jeffreymi,bruntsd.thequantificationofthiosulfateandpolythionatesingoldleachsolutionsandonanionexchangeresins[j].hydrometallurgy,2007,89(1–2):52-60)等方法，然而，这些方法仅适用于污水、废水等水溶液，不适合用于血液、尿液等复杂生物基质中硫代硫酸根离子的测定；并且其中的部分方法还存在最低检出限(lod)、最低定量限(loq)不够低，精密度和准确度不够好的缺陷。

质谱法(massspectrometry，ms)是一种用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子－分子相互作用产生的离子)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。质谱法特别是它与色谱仪及计算机联用的方法，已广泛应用在有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。用质谱仪器作多离子检测，可用于定性分析，例如，在药理生物学研究中能以药物及其代谢产物在气相色谱图上的保留时间和相应质量碎片图为基础，确定药物和代谢产物的存在；也可用于定量分析，用被检化合物的稳定性同位素异构物作为内标，以取得更准确的结果。因此，质谱技术是临床毒物学和法医毒物学领域的金标准，建立基于质谱分析的方法有利于提供可靠的法庭证据。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术中存在的缺陷，并提供一种高效检测血液或尿液中硫代硫酸根离子浓度的方法，从而间接测定硫化氢的中毒情况。

因此，本发明提供了一种检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理；

(2)gc-ms分析；

其中，步骤(1)所述的样品前处理将血液或尿液中的硫代硫酸根离子衍生化为五氟苄基双硫醚，具体操作包括：

取血液样品或尿液样品，置于已加入五氟苄基溴的丙酮溶液、l-抗坏血酸水溶液和nacl水溶液的玻璃试管中，然后在旋涡振荡器中涡旋0.5～2分钟，再向其中加入碘的乙酸乙酯溶液、作为内标的1,3,5-三溴苯(tbb)的乙酸乙酯溶液，接着在旋涡振荡器中涡旋20～40秒，静置1～2小时，以2000～4000r/min转速离心12～20分钟后，取上清液，进样至gc-ms系统。

在上述方法中，硫代硫酸根离子衍生化为五氟苄基双硫醚所经历的化学反应如下所示：

其中，经历了两步反应，第一步反应：在l-抗坏血酸和nacl存在下，硫代硫酸钠(硫代硫酸根离子的主要存在形式)与五氟苄基溴(pfbbr)反应生产中间体a；在第一步反应中，l-抗坏血酸作为稳定剂，nacl作为催化剂；第二步反应：中间体a与碘反应生成目标衍生物五氟苄基双硫醚。

优选地，在上述检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法中，所述水为现配的无氧水，通过将氮气通入去离子水中15分钟以上而制得。例如，检测人员可在实验当天将氮气通入去离子水中15分钟以上，从而制得所述无氧水，用作溶剂。

优选地，在上述检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法中，所述五氟苄基溴的丙酮溶液的浓度为20μmol/ml，所述l-抗坏血酸水溶液的浓度为200mmol/ml，所述nacl水溶液的浓度为5wt％，所述碘的乙酸乙酯溶液的浓度为25mmol/ml，所述1,3,5-三溴苯的乙酸乙酯溶液的浓度为0.1μmol/l。

进一步优选地，在上述检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法中，所述样品前处理的具体操作包括：

取0.2ml血液样品或尿液样品，置于已加入0.5ml所述五氟苄基溴的丙酮溶液、0.05ml所述l-抗坏血酸水溶液和0.05ml所述nacl水溶液的10ml玻璃试管中，然后在所述旋涡振荡器中涡旋0.9～1.2分钟，再向其中加入2ml所述碘的乙酸乙酯溶液、0.5ml所述1,3,5-三溴苯的乙酸乙酯溶液，接着在旋涡振荡器中涡旋24～36秒，静置1小时，以3000r/min转速离心12～16分钟后，取上清液1μl，进样至gc-ms系统。

优选地，在上述检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法中，步骤(2)所述的gc-ms分析中，气相色谱条件如下：

hp-5ms毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；

柱温升温程序：起始温度100℃，保持1.5min后以40℃/min升至280℃，保持1min；

载气为高纯氦气，恒流1.0ml/min；

汽化室温度220℃，进样量1μl，分流比10:1。

优选地，在上述检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法中，步骤(2)所述的gc-ms分析中，质谱条件如下：

电子轰击离子源(ei)，电子能量70ev；离子源温度为230℃，四级杆温度150℃，接口温度280℃；

五氟苄基双硫醚的特征碎片离子(m/z)为181、213、426，保留时间为6.0min；作为内标的1,3,5-三溴苯的特征碎片离子(m/z)为235、314，保留时间为4.8min；

定量时采用选择性离子检测模式(sim)，五氟苄基双硫醚和作为内标的1,3,5-三溴苯的定量碎片离子(m/z)分别为426和314。

进一步优选地，在上述检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法中，用于检测血液样品时，lod为0.05μmol/ml，loq为0.1μmol/ml。

与现有技术相比，本发明所提供的技术方案具有以下优点：采用本发明所提供的检测方法，考察源自活体的空白尿液，活体、人体死后、人体腐败后等不同来源的空白血液，均未出现硫代硫酸根的衍生物五氟苄基双硫醚的特征色谱峰，因而，本发明所述检测方法具有良好的专属性；并且，所述检测方法的线性相关性好，最低检出限(lod)、最低定量限(loq)足够低，精密度和准确度更好；因此，十分适合用于血液、尿液等复杂生物基质中硫代硫酸根离子的测定，从而能够有效地间接测定硫化氢的中毒情况。综上所述，所述检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法可得到广泛应用，具有可观的市场潜力。

附图说明

图1为本发明所述检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法的流程图；

图2a～2c为专属性试验中的空白血液处理后的gc-ms色谱图，其中：图2a为总离子图谱，图2b为tbb内标选择离子图谱，图2c为五氟苄基双硫醚选择离子图谱；其中，横轴坐标为保留时间，纵轴坐标为丰度；

图3a～3c为专属性试验中的含0.1μmol/ml硫代硫酸根离子的血液处理后的gc-ms色谱图，其中：图3a为总离子图谱，图3b为tbb内标选择离子图谱，图3c为五氟苄基双硫醚选择离子图谱；其中，横轴坐标为保留时间，纵轴坐标为丰度。

具体实施方式

本发明提供了一种检测血液或尿液中硫代硫酸根离子的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理；

(2)gc-ms分析；

其中，步骤(1)所述的样品前处理将血液或尿液中的硫代硫酸根离子衍生化为五氟苄基双硫醚，具体操作包括：

取血液样品或尿液样品，置于已加入五氟苄基溴的丙酮溶液、l-抗坏血酸水溶液和nacl水溶液的玻璃试管中，然后在旋涡振荡器中涡旋0.5～2分钟，再向其中加入碘的乙酸乙酯溶液、作为内标的1,3,5-三溴苯的乙酸乙酯溶液，接着在旋涡振荡器中涡旋20～40秒，静置1～2小时，以2000～4000r/min转速离心12～20分钟后，取上清液，进样至gc-ms系统。

在一个优选实施例中，所述水为现配的无氧水，通过将氮气通入去离子水中15分钟以上而制得。

在一个优选实施例中，所述五氟苄基溴的丙酮溶液的浓度为20μmol/ml，具体配制操作为：精密称取五氟苄基溴(pfbbr)208.8mg，用丙酮溶剂定容至40ml，摇匀即得；所述l-抗坏血酸水溶液的浓度为200mmol/ml，具体配制操作为：精密称取l-抗坏血酸352.2mg，用无氧水定容至10ml，摇匀即得；所述nacl水溶液的浓度为5wt％，具体配制操作为：精密称取无水nacl500mg，用无氧水定容至10ml，摇匀即得；所述碘的乙酸乙酯溶液的浓度为25mmol/ml，具体配制操作为：精密称取i2634.5mg，用乙酸乙酯溶剂定容至100ml，摇匀即得；所述1,3,5-三溴苯(tbb)的乙酸乙酯溶液的浓度为0.1μmol/l，具体配制操作为：精密称取1,3,5-三溴苯3.2mg，用乙酸乙酯溶剂定容至100ml，摇匀得10μmol/l的1,3,5-三溴苯的乙酸乙酯溶液；准确吸取10μmol/l的1,3,5-三溴苯的乙酸乙酯溶液1ml，用乙酸乙酯溶剂定容至100ml，摇匀即得。

在一个进一步优选的实施例中，所述样品前处理的具体操作包括：

取0.2ml血液样品或尿液样品，置于已加入0.5ml所述五氟苄基溴的丙酮溶液(20μmol/ml)、0.05ml所述l-抗坏血酸水溶液(200mmol/ml)和0.05ml所述nacl水溶液(5wt％)的10ml玻璃试管中，然后在所述旋涡振荡器中涡旋0.9～1.2分钟，再向其中加入2ml所述碘的乙酸乙酯溶液(25mmol/ml)、0.5ml所述1,3,5-三溴苯的乙酸乙酯溶液(0.1μmol/l)，接着在旋涡振荡器中涡旋24～36秒，静置1小时，以3000r/min转速离心12～16分钟后，取上清液1μl，进样至gc-ms系统。

在一个优选实施例中，步骤(2)所述的gc-ms分析中，气相色谱条件如下：

hp-5ms毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；

柱温升温程序：起始温度100℃，保持1.5min后以40℃/min升至280℃，保持1min；

载气为高纯氦气，恒流1.0ml/min；

汽化室温度220℃，进样量1μl，分流比10:1。

在一个优选实施例中，步骤(2)所述的gc-ms分析中，质谱条件如下：

电子轰击离子源(ei)，电子能量70ev；离子源温度为230℃，四级杆温度150℃，接口温度280℃；

五氟苄基双硫醚的特征碎片离子(m/z)为181、213、426，保留时间为6.0min；作为内标的1,3,5-三溴苯的特征碎片离子(m/z)为235、314，保留时间为4.8min；

定量时采用选择性离子检测模式(sim)，五氟苄基双硫醚和作为内标的1,3,5-三溴苯的定量碎片离子(m/z)分别为426和314。

在一个进一步优选的实施例中，所述方法用于检测血液样品时，lod为0.05μmol/ml，loq为0.1μmol/ml。

此外，发明人还实施了一系列试验以对本发明所述方法进行验证，主要包括验证本发明所述方法的专属性、线性相关性及其检测限、精密度和准确度，以及稳定性；具体如下：

专属性试验：

取10份不同来源的空白血液，其中5份按照步骤(1)进行血液样品前处理，然后按照步骤(2)实施gc-ms分析，如图2a～2c所示，未检出五氟苄基双硫醚；向剩余5份空白血液中添加硫代硫酸根离子，获得含0.1μmol/ml硫代硫酸根离子的血液，同样按照步骤(1)进行血液样品前处理，然后按照步骤(2)实施gc-ms分析，如图3a～3c所示，检出了五氟苄基双硫醚。由此可知，空白血液中的内源性物质不会干扰硫代硫酸根离子的测定。

线性相关性及其检测限试验：

硫代硫酸根离子储备液(20μmol/ml)的配制：精密称取5h2o·na2s2o3496.4mg，加入无氧水定容至100ml；临用时根据需要稀释成适当浓度的对照品溶液。

向空白血液中分别添加硫代硫酸根离子对照品溶液适量，制得浓度分别为0.1、0.125、0.2、0.25、0.5、1μmol/ml的系列血液样品，每个浓度点2份重复样品，按照步骤(1)进行样品前处理后，按照步骤(2)进行gc-ms分析。以目标物和内标峰面积之比为自变量x，以硫离子的摩尔浓度(μmol/ml)为因变量y，用最小二乘法进行回归运算。结果表明血液中的硫代硫酸根离子浓度在0.1～1μmol/ml范围内具有良好的线性关系。线性方程为y＝0.251x+0.1069，相关系数r²＝0.9965。

本发明以s/n≥3时的样品最低浓度为最低检出限(lod)，s/n≥10时的样品最低浓度为最低定量限(loq)，结果表明血液中硫代硫酸根离子的lod为0.05μmol/ml，loq为0.1μmol/ml。

精密度和准确度试验：

向空白血液中分别添加硫代硫酸根离子对照品溶液适量，制得高、中、低(0.5、0.2、0.1μmol/ml)3个浓度的质控样品，每个浓度点6个重复样品，按照步骤(1)进行样品前处理后，按照步骤(2)进行gc-ms分析，计算每个浓度样品的相对标准偏差(rsd)作为日内精密度；连续4天，计算每种浓度样品的rsd作为日间精密度。准确度为线性校正后的摩尔浓度平均值与添加摩尔浓度百分比(见表1)。本方法日内和日间精密度均小于15％，而且准确度在(100±10)％以内，均在法医毒物学领域可接受的范围内。

稳定性试验：

向空白血液中分别添加硫代硫酸根离子对照品溶液适量，制得高、中、低(0.5、0.2、0.1μmol/ml)3个浓度的质控样品，每个摩尔浓度点6个重复样品按照步骤(1)进行样品前处理后，每隔1h按照步骤(2)进行gc-ms分析一次，连续进样24h，计算每个浓度样品的相对标准偏差(rsd)作为稳定性指标(见表1)。本方法的稳定性变异系数均小于15％，均在体内毒物学领域可接受的范围内。

表1

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

2015年12月某日，竹浆加工厂排污井内发现两名工人吴xx和纪xx，已死亡。后经环境部门监测，井内空气中硫化氢浓度6ppm。经本发明所述方法测定，吴xx和纪xx的血液中硫代硫酸根离子浓度分别为0.17μmol/ml和0.19μmol/ml。

实施例2

2016年4月某日，河北省大名县一生物科技公司生产车间内，因硫化氢泄漏3人死亡。根据幸存的工人描述，陈xx、候xx发现董x倒地，上前查看，呼喊并拉董x，随后两人也倒在地上。经本发明所述方法测定，陈xx、候xx和董x的血液中硫代硫酸根离子浓度分别为0.24μmol/ml、0.24μmol/ml和0.31μmol/ml。

实施例3

2016年7月某日，温州市一排污管道窨井内发生1起中毒事故。一名正在作业的工人李x在作业过程中发生昏迷，到医院时已死亡。经本发明所述方法测定，李x的血液中硫代硫酸根离子浓度为0.23μmol/ml。

根据目前硫化氢中毒死亡案例报道，血液中硫代硫酸根离子在未检出至0.648μmol/ml范围内，尿液中在未检出至2.669μmol/ml范围内；与此不同，采用本发明所述检测方法检测的实际案例中，上述5名中毒者血液中硫代硫酸根离子浓度在0.17～0.31μmol/ml，证明本发明所述检测方法足以满足鉴定实际生物样品测定需要。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。