本发明属于检测分析技术领域，涉及一种检测头孢菌素残留量的方法，尤其涉及一种检测成本低，方法准确、灵敏和快速的多壁碳纳米管净化-超高效液相色谱-质谱法测定水产品中头孢菌素残留量的方法。
背景技术：
头孢菌素又称先锋霉素，是分子中含有头孢烯和头霉烯两类β-内酰胺类的半合成抗生素，具有广谱抗菌作用，医学临床中主要用于治疗革兰氏菌如葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等引起的各种感染，在动物养殖业中也广泛用于治疗畜禽动物尿道、胃肠道和呼吸道感染。动物产品中过量使用头孢菌素造成的残留会通过食物链传递给人体健康造成影响，引起过敏反应、三致效应和细菌耐药性增强等危害。因此世界各国对部分畜禽类动物源产品均提出头孢菌素残留限量要求。
近年来，随着水产养殖业中新病疫情的出现和渔民盲目使用抗生素的问题，一些临床效果较好的人用或兽用药也开始被用于水产养殖中，市场上也出现了供水产养殖用的含头孢菌素投入品。
目前还没有水产品中头孢菌素残留限量要求，也缺少相应的检测方法。食品中头孢菌素残留检测的方法主要有微生物法、免疫法、液相色谱法、液质联用法和毛细管电泳法。相关的一些国家标准也主要适用于畜禽动物肌肉、肝脏、肾脏、鸡蛋、牛奶和蜂蜜等基质，gb/t22960-2008仅规定适用于河豚鱼和鳗鱼中5种头孢菌素测定。而实际工作中发现gb/t22960-2008用于水产品测定时，一方面由于水产品含水率高，正己烷脱脂净化后的乙腈提取液旋蒸过程中易产生爆沸现象，且样品难以减压蒸发至净干，给后续定容体积带来误差，另一方面因水产品种类较多，基质成分复杂，蛋白质、脂肪等共存干扰物多，仅靠正己烷液萃取除杂效果不佳，质谱测定时基质干扰严重，特别是低浓度样品测定效果较差，回收率偏低。因此有必要建立一种快速、准确且适合多种水产品基质的头孢菌素类多残留检测方法。固相萃取spe是兽药残留分析中常用的一种样品前处理净化技术。商品化的spe小柱价格昂贵，检测成本较高。
多壁碳纳米管(mwcnts)为一种功能性材料，可通过非共价作用力与目标物分子结合，吸附能力强，且具有比表面积高、化学性能好、机械及热稳定性高和材料成本低等优点，在重金属吸附和有机物检测分析工作中得到了较好的应用。目前尚未见将mwcnts用于头孢菌素残留检测分析前处理的研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于为了解决现有水产品中头孢菌素残留检测的国家标准方法存在的适用品种窄、待测物种类偏少和方法回收率偏低的缺陷而提供一种检测成本低，方法准确、灵敏和快速的多壁碳纳米管净化-超高效液相色谱-质谱法测定水产品中头孢菌素残留量的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效检测水产品中头孢菌素残留量的方法，所述方法包括：样品经提取溶剂提取、多壁碳纳米管固相萃取净化后，采用超高效液相色谱c18柱分离，三重四级杆质谱仪在多反应监测模式下测定，采用基质匹配法制作标准曲线进行外标法定量。
作为优选，多壁碳纳米管固相萃取柱的制备方法为：称取2g多壁碳纳米管粉末于500ml单口烧瓶中，加入50ml浓硫酸和100ml浓硝酸，超声振荡1h，静置后除去上层液，固体物反复用纯水洗至中性，80℃干燥后研磨成细粉末；装柱前，分别用纯水、甲醇清洗6ml的聚丙烯spe柱空管和20μm聚乙烯柱筛板，待小柱和筛板干燥后，先用筛板封住spe柱底部，再称取45-80mg多壁碳纳米管于小柱中，垫上柱筛板压实，通过调节上筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.6cm；填装好的多壁碳纳米管spe柱装于密封袋中，使用前使用前用5ml甲醇、5ml水和5ml磷酸盐缓冲液活化。
作为优选，所述提取溶剂为乙腈、乙腈-水溶液或甲醇-偏磷酸水溶液。
作为优选，所述头孢菌素为头孢哌酮、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢唑啉、头孢匹林、头孢噻呋、头孢匹罗与头孢氨苄。头孢哌酮(cefoperazone,cefop)；头孢喹肟(cefquinome,cefqu)；头孢洛宁(cefalonium,cefal)；头孢唑啉(cefazolin,cefaz)；头孢匹林(cefapirin,cefap)；头孢噻呋(ceftiofur,cefti)；头孢匹罗(cefpirome,cefpi)；头孢氨苄(cefalexin,cefale)。
作为优选，所述提取溶剂为乙腈-水溶液。
作为优选，样品的处理方法为：称取5.0g样品于50ml离心管中，加入20ml体积比为4:1的乙腈-水溶液，涡旋振荡提取2min，5000r/min离心6min，上清液转移至100ml鸡心瓶中，残渣中再加入15ml乙腈-水溶液重复提取操作一次，合并两次提取液，加入4ml饱和氯化钠溶液后于40℃旋转蒸发除去乙腈，向鸡心瓶中加入10ml的0.10mol/l磷酸盐缓冲溶液，涡旋混匀1min使分析物充分溶解，全部上样过mwcnts小柱，再分别用6ml磷酸盐缓冲溶液、6ml水淋洗，最后用6ml乙腈洗脱并接收洗脱液于45℃氮气吹干，用2ml纯水充分溶解，过0.22μm水相滤膜后供uplc-ms/ms仪测定。
作为优选，色谱及质谱条件
色谱柱：acquityxselectcshc18柱2.1×50mm，1.7μm；柱温40℃；进样量10μl；流速：0.3ml/min；流动相a为0.05-0.2％甲酸水溶液，b为乙腈，梯度洗脱：0-3.0min，90％-60％a；3.0-4.0min，60％-40％a；4.0-5.0min，40％-90％a；5.0-6.5min，90％a；
质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压3.50kv；离子源温度120℃；脱溶剂气温度380℃；脱溶剂气流量600l/h；锥孔气流量50l/h；多反应监测扫描模式。
作为优选，多壁纳米碳管在放入单口烧瓶前，将多壁碳纳米管与浓度为65-75wt％的乳酸溶液混合均匀后加热搅拌，其中所述多壁碳纳米管与乳酸溶液的质量比为100:4-6，加热温度为80-95℃，加热时间40-60min；在加热搅拌过程中向反应液逐渐加入质量为所述多壁碳纳米管20-25％的浓度为30wt％的双氧水溶液；在加热搅拌结束后调节ph至中性，最后真空干燥。
头孢菌素属于β-内酰胺类抗生素，结构式中既有游离羧基，又带有氨基，为两性物质，极性较小，色谱分离中最常使用的是反相柱填料。研究对比了watersacquityuplcbehc18(2.1×50mm，1.7μm)和watersacquityxselectcshc18(2.1×50mm，1.7μm)两种色谱柱分离效果。结果表明2种色谱柱都对8种头孢菌素有较好的保留，采用表面带电杂化颗粒技术的watersacquityxselectcshc18色谱柱对头孢哌酮和头孢唑啉两种分析物的峰形有明显的改善，因此本发明选择watersacquityxselectcshc18作为分析柱。
用于头孢菌素的提取溶剂有乙腈、乙腈-水溶液和甲醇-偏磷酸水溶液等。本发明比较了乙腈、乙腈-水、甲醇、甲醇-0.2％偏磷酸作为提取剂的提取效果。水产品中蛋白质、脂类等大分子物质较多，用甲醇及甲醇水溶液提取时，提取液较混浊，造成样品净化困难，且头孢唑啉和头孢匹林的回收率偏低。乙腈作为有机溶剂能引起蛋白质变性沉淀，溶出杂质少，提取液较澄清。由于商品化头孢菌素多为含盐制剂，水溶性较强。采用乙腈-水溶液提取可以提高药物溶解度。
本发明的有益效果是本发明检测成本低，方法准确、灵敏和快速，可为水产品中头孢菌素类的残留监控提供技术支持。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
仪器与试剂
acquitytm超高效液相色谱-quattropremierxe三重四极杆质质谱仪(配esi离子源，美国waters公司)；ikat18基本型组织捣碎机(德国ika公司)；ms2漩涡混合器(德国ika公司)；centrifuge5810高速离心机(德国eppendorf公司)；r-201型旋转蒸发仪(上海科兴仪器有限公司)；12通道固相萃取装置(美国supelco公司)。
硫酸头孢喹肟(纯度≥95.0％)、硫酸头孢匹罗水合物(纯度≥98.5％)、头孢氨苄一水合物(纯度≥99.0％)和盐酸头孢噻呋(纯度≥78.0％)为德国dr.ehrenstorfer公司生产，头孢唑啉钠(纯度≥89.1％)、头孢洛宁水合物(纯度≥99.6％)、头孢匹林钠(纯度≥98.0％)和头孢哌酮二水合物(纯度≥99.9％)为美国sigma公司生产；乙腈、甲醇(色谱纯，德国merk公司)；乙酸铵、甲酸(美国sigma公司)；mwcnts(纯度大于97％，直径40-60nm，长度5-15μm，深圳市纳米港有限公司)；水为milli-q制备的超纯水(美国millipore公司)。
头孢菌素标准储备液：称取适量的8种头孢菌素标准物质，用甲醇-水(v/v,4：1)进行溶解和稀释，配成浓度为100μg/ml的标准储备液，在-18℃下贮存。
头孢菌素混合标准使用液：分别移取适量的8种头孢菌素标准储备液，用纯水进行稀释，配成浓度为10.0μg/ml和0.10μg/ml的两种混合标准使用液，在-18℃下贮存。
0.10mol/l磷酸盐缓冲溶液：称取17.4g磷酸氢二钾用纯水溶解并稀释至1000ml，调节ph8.5。
实施例1
一种高效检测水产品中头孢菌素残留量的方法，所述方法包括：样品经提取溶剂提取、多壁碳纳米管固相萃取净化后，采用超高效液相色谱c18柱分离，三重四级杆质谱仪在多反应监测模式下测定，采用基质匹配法制作标准曲线进行外标法定量。
多壁碳纳米管固相萃取柱的制备方法为：称取2g多壁碳纳米管粉末于500ml单口烧瓶中，加入50ml浓硫酸和100ml浓硝酸，超声振荡1h，静置后除去上层液，固体物反复用纯水洗至中性，80℃干燥后研磨成细粉末；装柱前，分别用纯水、甲醇清洗6ml的聚丙烯spe柱空管和20μm聚乙烯柱筛板，待小柱和筛板干燥后，先用筛板封住spe柱底部，再称取45mg多壁碳纳米管于小柱中，垫上柱筛板压实，通过调节上筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.6cm；填装好的多壁碳纳米管spe柱装于密封袋中，使用前使用前用5ml甲醇、5ml水和5ml磷酸盐缓冲液活化。
多壁纳米碳管在放入单口烧瓶前，将多壁碳纳米管与浓度为65wt％的乳酸溶液混合均匀后加热搅拌，其中所述多壁碳纳米管与乳酸溶液的质量比为100:4，加热温度为80℃，加热时间40min；在加热搅拌过程中向反应液逐渐加入质量为所述多壁碳纳米管20％的浓度为30wt％的双氧水溶液；在加热搅拌结束后调节ph至中性，最后真空干燥。
样品的处理方法为：称取5.0g样品于50ml离心管中，加入20ml体积比为4:1的乙腈-水溶液，涡旋振荡提取2min，5000r/min离心6min，上清液转移至100ml鸡心瓶中，残渣中再加入15ml乙腈-水溶液重复提取操作一次，合并两次提取液，加入4ml饱和氯化钠溶液后于40℃旋转蒸发除去乙腈，向鸡心瓶中加入10ml的0.10mol/l磷酸盐缓冲溶液，涡旋混匀1min使分析物充分溶解，全部上样过mwcnts小柱，再分别用6ml磷酸盐缓冲溶液、6ml水淋洗，最后用6ml乙腈洗脱并接收洗脱液于45℃氮气吹干，用2ml纯水充分溶解，过0.22μm水相滤膜后供uplc-ms/ms仪测定。
色谱及质谱条件
色谱柱：acquityxselectcshc18柱2.1×50mm，1.7μm；柱温40℃；进样量10μl；流速：0.3ml/min；流动相a为0.05％甲酸水溶液，b为乙腈，梯度洗脱：0-3.0min，90％-60％a；3.0-4.0min，60％-40％a；4.0-5.0min，40％-90％a；5.0-6.5min，90％a；
质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压3.50kv；离子源温度120℃；脱溶剂气温度380℃；脱溶剂气流量600l/h；锥孔气流量50l/h；多反应监测扫描模式。母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量等多反应监测条件见表1。
实施例2
一种高效检测水产品中头孢菌素残留量的方法，所述方法包括：样品经提取溶剂提取、多壁碳纳米管固相萃取净化后，采用超高效液相色谱c18柱分离，三重四级杆质谱仪在多反应监测模式下测定，采用基质匹配法制作标准曲线进行外标法定量。
多壁碳纳米管固相萃取柱的制备方法为：称取2g多壁碳纳米管粉末于500ml单口烧瓶中，加入50ml浓硫酸和100ml浓硝酸，超声振荡1h，静置后除去上层液，固体物反复用纯水洗至中性，80℃干燥后研磨成细粉末；装柱前，分别用纯水、甲醇清洗6ml的聚丙烯spe柱空管和20μm聚乙烯柱筛板，待小柱和筛板干燥后，先用筛板封住spe柱底部，再称取80mg多壁碳纳米管于小柱中，垫上柱筛板压实，通过调节上筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.6cm；填装好的多壁碳纳米管spe柱装于密封袋中，使用前使用前用5ml甲醇、5ml水和5ml磷酸盐缓冲液活化。
多壁纳米碳管在放入单口烧瓶前，将多壁碳纳米管与浓度为70wt％的乳酸溶液混合均匀后加热搅拌，其中所述多壁碳纳米管与乳酸溶液的质量比为100:5，加热温度为85℃，加热时间45min；在加热搅拌过程中向反应液逐渐加入质量为所述多壁碳纳米管22％的浓度为30wt％的双氧水溶液；在加热搅拌结束后调节ph至中性，最后真空干燥。
样品的处理方法为：称取5.0g样品于50ml离心管中，加入20ml体积比为4:1的乙腈-水溶液，涡旋振荡提取2min，5000r/min离心6min，上清液转移至100ml鸡心瓶中，残渣中再加入15ml乙腈-水溶液重复提取操作一次，合并两次提取液，加入4ml饱和氯化钠溶液后于40℃旋转蒸发除去乙腈，向鸡心瓶中加入10ml的0.10mol/l磷酸盐缓冲溶液，涡旋混匀1min使分析物充分溶解，全部上样过mwcnts小柱，再分别用6ml磷酸盐缓冲溶液、6ml水淋洗，最后用6ml乙腈洗脱并接收洗脱液于45℃氮气吹干，用2ml纯水充分溶解，过0.22μm水相滤膜后供uplc-ms/ms仪测定。
色谱及质谱条件
色谱柱：acquityxselectcshc18柱2.1×50mm，1.7μm；柱温40℃；进样量10μl；流速：0.3ml/min；流动相a为0.2％甲酸水溶液，b为乙腈，梯度洗脱：0-3.0min，90％-60％a；3.0-4.0min，60％-40％a；4.0-5.0min，40％-90％a；5.0-6.5min，90％a；
质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压3.50kv；离子源温度120℃；脱溶剂气温度380℃；脱溶剂气流量600l/h；锥孔气流量50l/h；多反应监测扫描模式。母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量等多反应监测条件见表1。
实施例3
一种高效检测水产品中头孢菌素残留量的方法，所述方法包括：样品经提取溶剂提取、多壁碳纳米管固相萃取净化后，采用超高效液相色谱c18柱分离，三重四级杆质谱仪在多反应监测模式下测定，采用基质匹配法制作标准曲线进行外标法定量。
多壁碳纳米管固相萃取柱的制备方法为：称取2g多壁碳纳米管粉末于500ml单口烧瓶中，加入50ml浓硫酸和100ml浓硝酸，超声振荡1h，静置后除去上层液，固体物反复用纯水洗至中性，80℃干燥后研磨成细粉末；装柱前，分别用纯水、甲醇清洗6ml的聚丙烯spe柱空管和20μm聚乙烯柱筛板，待小柱和筛板干燥后，先用筛板封住spe柱底部，再称取50mg多壁碳纳米管于小柱中，垫上柱筛板压实，通过调节上筛板向下压紧程度来控制多壁碳纳米管填料厚度在0.6cm；填装好的多壁碳纳米管spe柱装于密封袋中，使用前使用前用5ml甲醇、5ml水和5ml磷酸盐缓冲液活化。
样品的处理方法为：称取5.0g样品于50ml离心管中，加入20ml体积比为4:1的乙腈-水溶液，涡旋振荡提取2min，5000r/min离心6min，上清液转移至100ml鸡心瓶中，残渣中再加入15ml乙腈-水溶液重复提取操作一次，合并两次提取液，加入4ml饱和氯化钠溶液后于40℃旋转蒸发除去乙腈，向鸡心瓶中加入10ml的0.10mol/l磷酸盐缓冲溶液，涡旋混匀1min使分析物充分溶解，全部上样过mwcnts小柱，再分别用6ml磷酸盐缓冲溶液、6ml水淋洗，最后用6ml乙腈洗脱并接收洗脱液于45℃氮气吹干，用2ml纯水充分溶解，过0.22μm水相滤膜后供uplc-ms/ms仪测定。
色谱及质谱条件
色谱柱：acquityxselectcshc18柱2.1×50mm，1.7μm；柱温40℃；进样量10μl；流速：0.3ml/min；流动相a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈，梯度洗脱：0-3.0min，90％-60％a；3.0-4.0min，60％-40％a；4.0-5.0min，40％-90％a；5.0-6.5min，90％a；
质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压3.50kv；离子源温度120℃；脱溶剂气温度380℃；脱溶剂气流量600l/h；锥孔气流量50l/h；多反应监测扫描模式。
母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量等多反应监测条件见表1。
表1头孢菌素的质谱多反应监测条件
线性范围和定量限
采用空白基质匹配法制作标准曲线，取信噪比s/n＝10的样品浓度为方法定量限。8种头孢菌素线性范围、曲线方程、相关系数及定量限见表2所示。各组分浓度与其质谱响应呈良好的线性关系，相关系数r≥0.995，定量限范围在2～10μg/kg之间。
表28种头孢菌素的定量曲线及定量限
方法的回收率和精密度
采用空白大黄鱼和南美白对虾样品进行添加回收试验，计算平均回收率和rsd，考察方法的准确度和精密度(表3)。8种头孢菌素平均回收率为67.9％～93.5％，rsd为3.29％～12.5％，方法的精密度和准确度可满足药物残留检测要求。
表3空白试样添加回收率和精密度测定结果(n＝4)
实际样品测定
采用本方法对浙江36份海产品进行头孢菌素风险监测分析，其中1份海水鱼样品有头孢氨苄检出，浓度为5.73μg/kg。经调查得知该养殖场1个月前曾用过头孢片来治疗鱼病。