免疫亲和柱净化‑超高效液相色谱‑串联质谱检测鱼虾中3‑甲基‑喹噁啉‑2‑羧酸的方法与流程

本发明涉及一种3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的检测方法，特别涉及免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱检测鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法。

背景技术：

3-甲基喹噁啉-2-羧酸(mqca)是喹噁林类药物喹乙醇的残留标示物，同时也是喹烯酮、乙酰甲喹的代谢产物。研究表明喹乙醇对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在致畸形，致突变，致癌作用。因此在世界范围内都被禁止或限制用作饲料添加剂。喹乙醇在体内代谢迅速，而mqca在体内滞留时间长，含量与总残留关系稳定，是国际食品法典委员会认定的标示残留物之一，可作为残留分析监控的目标物质。

目前水产品中mqca的检测主要采用高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法。液相色谱-串联质谱以其定性准确、灵敏度高等特点被广泛采用。为降低基质效应的影响，在前处理过程中，提取后的mqca一般要再经过净化浓缩步骤，固相萃取是mqca最常用的净化方式。根据mqca的化学结构和性质，常采用hlb柱和阴离子交换柱净化样品。免疫亲和柱(iac)以抗原和抗体反应为基础，具有特异性强、富集率高和净化效能好的优势，已成功应用于黄曲霉毒素、河豚毒素等物质的净化和富集中，而目前未见采用免疫亲和柱净化水产品中的mqca的文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱检测鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法，方法基质干扰低，特异性强，重现性、回收率均较好，操作简便，适合于实际样品的检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱检测鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：称取匀质好的样品5g置于50ml具塞离心管中，加入10ml2mol/lhcl溶液，涡旋振荡1～2min后置于气浴恒温振荡器中60℃恒温酸解30min，冷却至室温后，8000r/min离心5min，移取上清液至50ml离心管中，残渣中加入10ml2mol/lhcl溶液重复提取一次，合并提取液并用水定容至25ml，混匀后用定量滤纸过滤，准确移取过滤后的提取液5ml用4.0mol/lnaoh溶液调ph至7～8，得样品液；

(2)免疫亲和柱净化：取出免疫亲和柱，待回至室温后去掉免疫亲和柱堵头，放出柱内保存液，上样品液，以1滴/2s的速度过免疫亲和柱，上样结束后,先后用4mlpbs溶液和4ml水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，弃去以上全部流出液，用4ml2％的乙酸-甲醇溶液洗脱目标物，洗脱液于50℃水浴氮气吹干，加入1ml初始流动相溶解残渣得净化液；

(3)液相色谱-质谱分析：净化液经0.22μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定获得3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的含量。

作为优选，步骤(2)中初始流动相为0.1％甲酸-甲醇溶液，0.1％甲酸溶液：甲醇溶液的体积比＝9:1。

作为优选，步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：watersacquityuplcbehc18柱，规格：50mm×2.1mm，1.7μm；进样量10μl；样品室温度10℃，柱温40℃；流动相：a为0.1％甲酸溶液，b为甲醇，梯度洗脱程序如下：0～3min,90％～10％a；3～4min,10％～90％a；4～5min，a保持90％不变；流速：0.3ml/min。

作为优选，步骤(3)中质谱条件为：电喷雾离子源；正离子扫描(esi+)模式；多反应监测(mrm)检测方式；毛细管电压：3.5kv；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：380℃；锥孔气为高纯氮气(99.999％)，流量：50l/h；脱溶剂气为高纯氮气，流量：600l/h，母离子为188.9，子离子为142.9、144.9。

作为优选，步骤(3)中标准曲线的制作方法为：配制浓度为1.0μg/l、2.0μg/l、5.0μg/l、10.0μg/l和50.0μg/l的标准工作溶液，以3-甲基-喹噁啉-2-羧酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

本发明的有益效果是：本发明首次将特异性强的免疫亲和柱应用到3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(mqca)的净化中，建立了鱼虾中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱(iac-uplc-ms/ms)的快速分析方法，本方法重现性好，灵敏度高，适合水产品中mqca的实际测定。

附图说明

图1是不同洗脱液和洗脱体积对mqca的洗脱影响。

图2是5.0μg/kg阴性大黄鱼加标样品经hlb柱和iac柱净化后的mrm图(a,hlb；b,iac)。

图3是阴性大黄鱼样品定量限加标mrm图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

1.1材料与试剂

mqca标准品(纯度≥98.0％,德国dr.ehrenstorfer公司)；watersoasishlb固相萃取柱(60mg/3ml)；watersoasismax混合型阴离子交换柱(60mg/3ml)；mqca免疫亲和柱(柱容量1ml，北京华安麦科生物技术有限公司)甲醇、乙腈(色谱纯,德国merck公司)、甲酸(分析纯，美国sigma公司)、乙酸、hcl、na2hpo4·12h2o、nah2po4·2h2o、nacl、naoh(分析纯，上海国药集团)。实验用水为milli-q制备超纯水(电阻率≥18.2mω.cm)。

mqca标准溶液:准确称取5.00mgmqca标准品,用甲醇溶解并定容至50ml,溶液浓度为100μg/ml，-20℃避光保存。中间液和使用液用0.1％甲酸-乙腈溶液(9:1,v/v)逐级稀释至所需浓度。

磷酸盐缓冲液(pbs):分别称取na2hpo4·12h2o6.45g,nah2po4·2h2o1.09g,nacl4.25g，用水溶解并定容至500ml。

1.2仪器与设备

acquitytm超高效液相色谱仪(uplc)、quattropremierxe串联四极杆质谱仪(美国waters公司)；ms2漩涡混合器(德国ik公司)；centrifuge5810高速离心机(德国eppendorf公司)；n-evap112氮吹仪(美国organomation公司)；12通道固相萃取装置(美国supelco公司)；fg2型ph计(梅特勒-托利多上海公司)。

1.3方法

1.3.1样品提取

从市场上采集的样品按照sc/t3016-2004《水产品抽样方法》的规定处理后于－18℃密封保存。鱼肉、皮，虾去壳，切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混匀，充分匀浆，使用前先解冻。

称取匀质好的样品5g置于50ml具塞离心管中,加入10ml2mol/lhcl溶液,涡旋振荡1～2min后置于气浴恒温振荡器中60℃恒温酸解30min,冷却至室温后，8000r/min离心5min，移取上清液至50ml离心管中,残渣中加入10ml2mol/lhcl溶液重复提取一次，合并提取液并用水定容至25ml，混匀后用定量滤纸过滤。准确移取过滤后的提取液5ml用4.0mol/lnaoh溶液调ph至7～8,待净化。

1.3.2免疫亲和柱净化

取出免疫亲和柱，待回至室温后去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液，上样品液。以1滴/2s的速度过免疫亲和柱。上样结束后,先后用4mlpbs溶液和4ml水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，弃去以上全部流出液，用4ml2％乙酸-甲醇溶液洗脱目标物。洗脱液于50℃水浴氮气吹干，加入1ml初始流动相溶解残渣，经0.22μm滤膜过滤后进仪器检测。

1.3.3色谱条件

watersacquityuplcbehc18柱(50mm×2.1mm,1.7μm)；进样量10μl；样品室温度10℃，柱温40℃；流动相：a为0.1％甲酸溶液，b为甲醇，梯度洗脱程序如下：0～3min,90％～10％a；3～4min,10％～90％a；4～5min，a保持90％不变；流速：0.3ml·min^-1。

1.3.4质谱条件

电喷雾离子源；正离子扫描(esi+)模式；多反应监测(mrm)检测方式；毛细管电压：3.5kv；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：380℃；锥孔气为高纯氮气，流量：50l/h；脱溶剂气为高纯氮气，流量：600l/h。mqca的质谱多反应监测实验条件如表1所示。

表1mqca的多反应监测实验条件

*定量离子(quantitativeion)

2.结果与分析

2.1色谱条件优化

采用普通c18柱分析mqca易形成拖尾现象，本发明选用粒径只有1.7μm的acquityuplcbehc18柱分析目标物，同时在正离子模式下加入一定的有机酸，可提高分离度和离子化效率，在优化的色谱条件下mqca峰型尖锐，能够在6min内完成目标物分离和色谱柱平衡。采用5.0μg/l的mqca标准溶液，比较了甲醇、乙腈作为有机相与0.1％甲酸水溶液组合成流动相的效果。乙腈作为流动相时，mqca的灵敏度略高于用甲醇作流动相，但mqca出峰时间较早，在实际样品分析时可能会受杂质的干扰。甲醇作为流动相时目标物的出峰时间比乙腈延后0.5min左右，峰强度增强，峰形尖锐，综合比较选择甲醇-0.1％甲酸水溶液作为流动相。

2.2质谱条件优化

根据mqca的化学结构，在正离子扫描模式下用蠕动泵以5.0μg/ml的mqca标准溶液进行流动注射分析，对质谱参数进行优化。通过一级质谱全扫描分析，确定mqca的分子离子，调试选择最佳锥孔电压和毛细管电压，其中[m+h]⁺(m/z188.9)丰度最高，因此选择离子m/z188.9作为母离子。继续对分析物离子进行二级质谱分析，获取碎片离子信息，并对碰撞能量等质谱参数进行优化，选择最强和次强的两个离子分别作为定量离子和定性离子。最终确定的质谱参数见表1。

2.3提取溶剂选择

mqca分子结构中含有羧基，为弱酸性物质，极性相对较高，与蛋白结合紧密，因此提取前需要将蛋白水解以释放mqca。mqca常用的水解方式有酶解、酸解、碱水解。酶解虽然条件温和，但所需时间长，且酶解后还需要加入一定量的酸灭活蛋白酶，并用乙酸乙酯萃取目标物，考虑到本发明后续净化步骤中免疫亲和柱对上柱液的要求和实验的简便性，采用2mol/lhcl溶液水解样品同时两次提取mqca，可保证mqca的提取效率，同时避免使用有机试剂，缩短操作时间，简化实验步骤。

2.4免疫亲和柱条件优化

2.4.1洗脱液类型和洗脱体积的选择

实验中先用4mlpbs溶液淋洗除去内源性杂质，因pbs缓冲液为非挥发性盐，会损害质谱，因此再用4ml水淋洗除去pbs缓冲液。比较了0.1％氨水甲醇、0.1％乙酸甲醇和0.2％乙酸甲醇三个不同ph值的洗脱液的洗脱效果。分别向三个装有等量pbs溶液的离心管中添加20ng的mqca标准品，经过免疫亲和柱上样、淋洗步骤后，分别持续加入5.0ml三种洗脱液进行洗脱，用离心管每1ml收集1管流出液。收集完毕后氮吹、流动相定容并上机检测mqca的含量。三种洗脱液对mqca的洗脱曲线见图1。结果表明0.2％乙酸甲醇对mqca的洗脱回收率略高于0.1％乙酸甲醇，洗脱速率也高于0.1％乙酸甲醇。第4ml的0.2％乙酸甲醇洗脱液中检测不到mqca，0.1％乙酸甲醇洗脱液需要5ml才能将mqca完全洗脱。0.1％氨水甲醇的洗脱回收率和洗脱速率和0.2％的乙酸甲醇相差无几。但考虑到上机流动相也为酸性，为保持mqca溶解环境的一致性，选择用4ml的0.2％乙酸甲醇洗脱目标物。

2.4.2不同固相萃取柱净化效果比较

水产品中mqca提取液净化常用到的固相萃取柱为hlb柱和max柱。实验比较了免疫亲和柱与其他两种固相萃取柱对大黄鱼样品的净化和mqca的回收效果。将阴性加标样品经盐酸溶液提取和酸解后分别根据三种柱子的不同性质进行下一步的净化实验，最后上机检测。比较了经三种柱子净化后mqca的净化效果和回收率。结果表明iac和hlb柱的回收率明显高于max柱。hlb柱的净化效果不如iac柱，目标峰出峰前有信号比较强的杂质峰。谱图上显示免疫亲和柱的净化效果最好，目标峰附近无明显杂质峰,表明免疫亲和柱具有高特异性的特点(图2)。

2.4.3基质效应评估

参照matuszewski等建立的方法考察基质效应的影响，选择脂肪含量低的草鱼、脂肪含量高的大黄鱼和色素含量高的南美白对虾作为代表性的水产品，每种水产品做3个平行样，分别测定了mqca标准品溶液的色谱峰面积(s1)和空白样品基质提取液添加标准溶液后的色谱峰面积(s2)，以比值s2/s1(％)来评价绝对基质效应。实验结果显示草鱼中mqca的基质效应为95％-105％；大黄鱼中mqca的基质效应为98％-112％；南美白对虾中基质效应为96％-107％。总体的基质效应为95％-112％，波动范围在±15％以内，在可以接受的范围内。表明免疫亲和柱的净化效果好，基质效应小。本实验标准曲线采用溶剂外标法定量，未采用基质匹配。

2.5线性范围和检出限

经实验测试，mqca免疫亲和柱的柱容量为150ng。用mqca标准使用溶液配制浓度为1.0,2.0,5.0,10.0,50.0ng/ml标准溶液。以定量离子的峰面积对质量浓度进行线性回归。在1.0～50ng/ml的浓度范围内回归方程为y＝200.074x-14.3523，线性范围良好，相关系数均大于0.995。以3倍信噪比确定本方法的检出限(lod)为0.4μg/kg,以10倍信噪比确定本方法的定量限(loq)为1.0μg/kg(图3)。

2.6方法回收率和精密度

分别准确称取不含mqca的草鱼、大黄鱼、对虾肉(5±0.02)g，分别添加三个不同浓度的mqca标准溶液，使得添加后的三种样品中mqca含量分别为1.0、5.0、20.0μg/kg，每个浓度重复测定6次，按照本方法进行加标回收率实验，计算回收率和相对标准偏差。结果见表2。mqca在1.0、5.0、20.0μg/kg三个添加水平下和三种样品基质中的平均回收率在74.2％～86.5％之间，相对标准偏差为3.14％～6.54％之间。

表2mqca的加标回收率和精密度实验

2.7实际样品分析

根据以往对水产品中mqca的监测结果，淡水鱼中mqca的检出率较高。采用本方法对农业部风险监测的200个淡水鱼样品中mqca残留量进行检测。200个样品中未检出mqca。

3结论

本发明采用免疫亲和柱净化，超高液相色谱串联质谱检测水产品中mqca。通过对免疫亲和柱条件净化富集效果和基质效应的评估，证明了样品前处理方法的有效性。本方法灵敏度高、特异性强，具有高的回收率和精密度，能满足残留分析的检测要求。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。