一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置与流程

本发明涉及一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置，涉及水生植物光合作用特性及其与水环境关系研究，属G01类。

(二)

背景技术：
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目前九寨沟一些湖泊泥沙淤积明显，湖泊沼泽化问题严重。伴随着湖泊泥沙淤积还有大量营养盐物质的输入，水生植物大量生长。有学者研究了东太湖水生植物的促淤效应，结果表明，生物有机质引起淤积物的沉积效应较为显著，约占到淤积物平均深度的20.8％-64％，水生植物促进沉积效应是非常显著的。这样浅滩范围逐步扩大，湖泊面积变小，水生植物大量生长，会加快沼泽化的进程，并对湖泊和景区产生不利的影响，也将直接影响到景区景观资源的保护和可持续利用。因此，有必要了解九寨沟水生植物的生长状况，为九寨沟湖泊泥沙治理和生态与环境保护提供科学依据和基础资料。但是，目前九寨沟的研究对象主要集中在地质地貌、山地灾害、水文、土壤、景观成因、旅游、植物等方面，对于九寨沟自然保护区内丰富的水生植物的研究还很少。

植物叶片对环境的光合响应提供了植物在不同光条件下生存和生长的能力以及对不断变化的环境条件适应能力的信息。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。因此，叶绿素荧光动力学技术能快速灵敏地反映植物生理状态及其与环境的关系，是一种理想的光系统探针，可直接或间接地了解光合作用过程。光合日变化是维持植物光合机构内不同组分响应和适应环境条件一种平衡能力的反映，叶绿素荧光参数则反映光合机构一系列重要的适应调节过程。目前，结合叶绿素荧光参数反应九寨沟水生植物光合作用日变化特征尚无报道。因此，本发明采用在线监测与室内分析相结合的方法，以九寨沟优势水生植物杉叶藻和水苦荬为实验材料，探讨水下光强和水温等重要环境因子对沉水植物生长发育的影响，不同生活型植物对湖泊水环境生态适应的差异性以及不同种沉水植物对湖泊水环境生态适应的差异性。

(三)

技术实现要素：
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1.一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置，其装置由可远程操控脉冲调制叶绿素荧光仪和带水下机器人的电动遥控双体船构成；其方法包括叶绿素荧光特性测定、光合有效辐射强度和水温测定、叶绿素含量测定和数据分析四个部分。

2.发明内容1所述一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置设电动遥控双体船、水下机器人、脉冲调制叶绿素荧光仪、水下机器人臂、叶夹片、摄像头，其特征是：

A.发明内容2所述电动遥控双体船设锂电池、双体船操控器，水下机器人设水下机器人遥控器，脉冲调制叶绿素荧光仪通过远端手持电脑远程操控；

B.发明内容2所述脉冲调制叶绿素荧光仪设有电脑控制芯片、数据线、光纤线；发明内容2所述脉冲调制叶绿素荧光仪长0.3米，宽0.15米，高0.15米，重2kg；其特征是电脑控制芯片，既仪器可本地储存测量的数据，又可与远端电脑进行实时数据传输并接收指令控制，方便远端实时观测遥控；同时，其数据线和光纤线均做防水设计，数据线、光纤线均通过水下机器人臂的中空管道连接脉冲调制叶绿素荧光仪，避免被水底植物沙石缠绕破坏，仪器上部是Led触摸屏幕，左右两边6个防水按键依次是取消键ESC，启动键，待机键，菜单键，光源转换键，确定键；仪器正面是电源开关键，USB接口，充电器口，电源指示灯，充电指示灯，无线wifi指示灯；

C.发明内容2所述电动遥控双体船1米长，0.6米宽，双体设计，不易倾覆，左右两边装锂电池，重10kg左右，中间部分安装脉冲调制叶绿素荧光仪，船的重心位置连接水下机器人，电动遥控双体船后端安装发动机；

D.发明内容2所述水下机器人设水下机器人臂、摄像头、云台、天线和控制器；通过水下机器人臂可以把叶夹片带入水底进行测量，同时摄像头可360度旋转查看，并能倾斜俯视水面，方便遥控查看电动遥控双体船的前进后退和水下机器人臂的移动；水下机器人设有云台，可保持平衡，同时云台上设有接收信号的天线和控制器，可远程操控；水下机器人臂采用6轴设计，方便灵活控制；水下机器人臂末端设摄像头，方便查看测量并控制叶夹片进行叶子夹取，叶夹片上端是光纤探头，连接脉冲调制叶绿素荧光仪的光纤线。

3.发明内容1所述叶绿素荧光特性测定由脉冲调制叶绿素荧光仪连接到手持电脑上进行，由WinControl-3软件控制，叶绿素荧光参数采用原位测定法；脉冲调制叶绿素荧光仪提供测量光、光化光和饱和脉冲光。其中测量光强度为0.1μmol·m^-2·s^-1，最大光化光为1500μmol·m^-2·s^-1，饱和脉冲强度大于10000μmol·m^-2·s^-1；选择无病害成熟的叶片(植株的中上部)作为实验材料，测量的位置为叶片中间部位；从7:00h-17:00h，每隔2h，随机采集沉水杉叶藻、沉水水苦荬和挺水杉叶藻的成熟叶片作为实验材料。

4.发明内容3所述叶绿素荧光特性测定包含最大光化学效率(Maximal quantum yield)、快速光响应曲线(Rapidlight curves)、快速光响应曲线拟合三个内容，其特征是：

A.发明内容3所述的最大光化学效率(F_v/F_m)用脉冲调制叶绿素荧光仪测定，从7:00h-17:00h，每隔2h测定一次，随机选择生长一致且叶片受光方向相同的代表性5株植株的10个样品进行重复性测定；将叶片暗适应20min之后，首先开启检测光(0.1μmol·m^-2·s^-1)得到初始荧光(F_o)，而后照射饱和脉冲光(10000μmol·m^-2·s^-1)测得最大荧光(F_m)；

B.发明内容3所述的快速光响应曲线(RLCs)日变化测定从7:00h-17:00h，每隔2h测定一次，随机选择5株植株的5片成熟叶片，5次重复；荧光测量由电脑控制，步骤为：打开测量光并打开光化光，适应10s后打开饱和脉冲，升高光化光强度，适应10s后再打开饱和脉冲，如此重复8次；由于沉水和挺水型水生植物接受外界环境的光强有所不同，测定沉水植物时，依次设定光合有效辐射强度(Photosynthetically active radiation，PAR)为66，90，125，190，285，420，625，820μmol·m^-2·s^-1；而测定挺水植物时，依次设定PAR为125，190，285，420，625，820，1150，1500μmol·m^-2·s^-1；逐渐开启上述已设定的PAR，在每个强度的光化光照射10s后，打开饱和脉冲前的基础荧光F_s，打开饱和脉冲得到最大荧光F_m′，由此可以得出光适应状态下PS II的有效量子产量；根据有效量子产量和PAR可以计算出相对电子传递速率(Relative electron transport rate，ETR)；

C.发明内容3所述的快速光响应曲线拟合采用OriginPro7.5软件进行；曲线拟合采用最小二乘法，快速光曲线的拟合采用Platt(1980)的公式，可以得到无光抑制时的最大潜在相对电子传递速率(Maximum relative electron transport rate，ETR_max)，光能的利用效率(Photosynthetic efficiency，α)，以及半饱和光强(Saturating photon flux，E_k)。

5.发明内容1所述光合有效辐射强度和水温测定，其特征是从7:00h-17:00h，每隔2h测定一次光合有效辐射强(Photosynthetic Active Radiation，PAR)和水温，与叶绿素荧光参数测定同步；采用AccuPAR Lp-80Ceptometer测定水上(挺水植物顶端)和水下(沉水植物顶端)光合有效辐射强度。同时用温度计测定水温。

6.发明内容1所述叶绿素含量测定，其特征是：

A.选择当年生同一高度生长完整植株，分别摘取足够数量的叶片，装入密封塑料袋里，然后立即放人简易冰柜里、遮光贮存，于当日带回实验室进行测定；

B.取新鲜植株顶部的新鲜叶片，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀；称取剪碎的新鲜样品1.6g，分别放人研钵中并且在冰水中研磨，加少量石英砂及16ml丙酮研成匀浆(按鲜重∶丙酮＝1∶4(w/v))，在50ml离心管中混匀，于3000rpm，10min离心。收集上清液于试管中，然后再向离心管中加入丙酮，收集上清液与第一次的合并，将所得上清定容；取样50μL溶于80％丙酮，定容至5mL。然后采用分光光度计(UV-1240-PC，Shimadzu)测定663nm和645nm处光吸收值，按以下公式计算，得到数值为样品稀释100倍前的叶绿素浓度；每种植物重复测定6次；

7.发明内容1所述数据分析采用Spss17.0for Windows软件包进行统计分析，不同实验点的比较用单因素方差分析(ANOVA)；组间处理有显著差异时，Post Hoc进行验后多重比较组内差异；验后多重比较用Tukey HSD；所有统计图用OriginPro 7.5绘制。

本发明有益效果：

1)实现远程实时取样、监测、实验，大大改善了科研工作人员的工作环境，提高工作效率；

2)装置机动、数据翔实、方法合理、分析透彻、图形美观。

(四)附图说明：

1.图1，一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置整体示意图：电动遥控双体船1.1、水下机器人1.2、脉冲调制叶绿素荧光仪1.3、水下机器人臂1.4、叶夹片1.5、摄像头1.6、锂电池1.7、双体船操控器1.8、水下机器人遥控器1.9；

2.图2，脉冲调制叶绿素荧光仪的整体示意图：电脑控制芯片2.1、数据线2.2、光纤线2.3、Led触摸屏幕2.4、取消键ESC 2.5、启动键2.6、待机键2.7、菜单键2.8、光源转换键2.9、确定键2.10、电源开关键2.11、USB接口2.12、充电器口2.13、电源指示灯2.14、充电指示灯2.15、无线wifi指示灯2.16；

3.图3，电动遥控双体船配置示意图：锂电池3.1、脉冲调制叶绿素荧光仪3.2、水下机器人3.3、光纤线3.4、数据线3.5、机器手臂的控制线3.6、发动机3.7；

4.图4，水下机器人配置示意图：水下机器人臂4.1、摄像头4.2、云台4.3、天线4.4、控制器4.5；

5.图5，叶夹片配置示意图：叶夹片5.1、摄像头5.2、光纤探头5.3；

6.图6，三个湖泊水上(a)和水下(b)光合有效辐射强度的日变化图：光合有效辐射强度6.1、时间6.2、芳草海6.3、箭竹海6.4、五花海6.5；

7.图7，三个湖泊水温的日变化图：水温7.1、时间7.2、芳草海7.3、箭竹海7.4、五花海7.5；

8.图8，其中，a，c，d分别为芳草海、箭竹海、五花海沉水杉叶藻的快速光响应曲线日变化图，b为芳草海水苦荬快速光响应曲线日变化图：相对电子传递速率8.1、光合有效辐射强度8.2、7:00 8.3、9:00 8.4、11:00 8.5、13:00 8.6、15:00 8.7、17:00 8.8；

9.图9，三个湖泊沉水杉叶藻的最大潜在相对电子传递速率(a)、光能利用效率(b)和半饱和光强(c)的日变化图：最大潜在相对电子传递速率9.1、光能利用效率9.2、半饱和光强9.3、时间9.4、芳草海9.5、箭竹海9.6、五花海9.7；

10.图10，三个湖泊沉水杉叶藻的最大潜在相对电子传递速率分别与光合有效辐射强度(a)和水温(b)的相关性图：最大潜在相对电子传递速率10.1、光合有效辐射强度10.2、水温10.3；

11.图11，芳草海的两种沉水植物的最大潜在相对电子传递速率(a)、光能利用效率(b)和半饱和光强(c)的日变化图：最大潜在相对电子传递速率11.1、光能利用效率11.2、半饱和光强11.3、时间11.4、杉叶藻11.5、水苦荬11.6；

12.图12，其中a为三个湖泊沉水杉叶藻的最大光化学效率日变化图，b为芳草海沉水杉叶藻和水苦荬最大光化学效率日变化图：最大光化学效率12.1、时间12.2、芳草海12.3、箭竹海12.4、五花海12.5、杉叶藻12.6、水苦荬12.7；

13.图13，箭竹海(a)和五花海(b)挺水杉叶藻的快速光响应曲线日变化图：相对电子传递速率13.1、光合有效辐射强度13.2、7:00 13.3、9:00 13.4、11:00 13.5、13:00 13.6、15:00 13.7、17:00 13.8；

14.图14，箭竹海和五花海挺水杉叶藻的最大潜在相对电子传递速率(a)、光能利用效率(b)和半饱和光强(c)的日变化图：最大潜在相对电子传递速率14.1、光能利用效率14.2、半饱和光强14.3、时间14.4、箭竹海14.5、五花海14.6；

15.图15，箭竹海和五花海挺水杉叶藻的最大光化学效率的日变化图：最大光化学效率15.1、时间15.2、箭竹海15.3、五花海15.4。

(五)具体实施方式：

本发明提出的一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置，其具体实施方式如下：

1.本发明提出的一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置，在经过多次野外实地考察的基础上，根据九寨沟水系分布，选取芳草海、箭竹海、五花海作为研究样地。

2.所述芳草海为顺沟向展布的长条型海子，海拔2934m。海子长540m，宽92.2m，一般深2-4m，面积多年平均5.21ha。在芳草海尾部见有泥沙沉积现象，其主要来源在芳草海邻近发育呈北西-南东向相对发育的支沟(南东侧为原始森林支沟、北西侧为悬泉支沟)，因芳草海沟段处扎玛且莫普德向斜南西冀和扬起端叠山组(Pds)灰色薄层泥灰岩夹灰黑-黑色变质粉砂岩、板岩；悬泉沟断层还沿上述支沟通过，使其流水侵蚀有较丰富的泥沙物源。

3.所述箭竹海平面上呈顺沟向长条型海子，总长约1184m，根据其水深等特点，分为北段、中段和南段三部分。北段长477m，宽174-268m，均深8m；中段长261m、宽216m，均深1.5m左右；南段长446m，一般宽144-150m，水深＜2.0m，主要为沼泽分布。箭竹海西侧有近东西方向支沟发育。目前主要有三条泥石流沟对箭竹海有直接的影响：煤炭沟泥石流、日则保护站附近日则一号沟泥石流以及箭竹海小沟。日则保护站一带后期流水侵蚀强烈，在上游出现大量的河流冲积物。同时箭竹海尾部受沟道纵坡向的影响和接受上游沟道水流和支沟携带泥沙、钙华碎粒的淤积、使得箭竹海尾部沼泽化较严重且分布面积有扩大趋势。

4.所述五花海平面上似孔雀开屏，属顺沟向展布海子类型。海拔为2934m，长约450m，一般宽227-313m、深3.8-8.5m，最深可达12m，均深6.0m，面积约9.6ha。五花海两侧因发育有北西-南东向支沟，海子两侧沟谷显得宽阔外，两支沟的冰水泥石流扇堆积使海子岸边变浅外，北西侧支沟冰水泥石流扇位于海子出口位置，堰塞使湖口迅速变窄。

5.本发明提出的一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置，选择九寨沟分布广泛的杉叶藻(Hippuris vulgaris Linn)和水苦荬(Veronica undulata Wall)作为研究材料，其特征是：

6.所述杉叶藻是杉叶藻科植物，在青藏高原广泛分布，生长在沼泽、牛轭湖、积水洼地、湖滨沼泽化水坑、水塘和溪流积水滩中，海拔2700-5200m。杉叶藻群落为典型的北极高山分布型，是喜寒冷环境分布的群落类型，是高原高寒环境的一种指示群落。杉叶藻是多年生水生草本，全株光滑无毛。茎直立，多节，常带紫红色，高8-150cm，上部分不分枝，下部合轴分枝，有匍匐白色或棕色肉质根茎，节上生多数纤细棕色须根，生于泥中。叶条形，轮生，两型，无柄，(4-)8-10(-12)片轮生。沉水中的根茎粗大，圆柱形，径3-5mm，茎中具多孔隙贮气组织，白色或棕色，节上生多数须根；叶线状披针形，长1.5-2.5cm，宽约1-1.5mm，全缘，较弯曲细长，柔软脆弱，茎中部的叶最长，向上或向下渐短；露出水面的根茎较沉水叶根茎细小，节间亦短，节间长5-15mm，径3-5mm，表面平滑，茎中空隙少而小；叶条形或狭长圆形，长1.5-2.5(-6)cm，宽1-1.5cm，无柄、全缘，与深水叶相比稍短而挺直，羽状脉不明显，先端有一半透明，易断离成二叉状扩大的短锐尖。杉叶藻的根、茎、叶中均具有发达的通气组织，这是适应水中生存环境而形成的，水中缺少氧气，而发达的通气组织可贮存光合作用放出的氧和呼吸作用放出的二氧化碳，成了氧和二氧化碳的“贮库”。用以弥补大气中氧和二氧化碳的不足，以避免水中缺氧对植物的伤害及光合作用中二氧化碳的匮乏。挺水杉叶藻，部分叶片沉于水中，部分叶片暴露在空气中，因而它的叶片结构兼具有中生和水生的双重特性；叶片表皮细胞为单层，叶肉组织介于异面叶和等面叶之间，从生态型来分，这是水中生植物的特征；叶上分布有排水器，当外界气压过低或蒸腾作用减弱时，植物就依赖排水器的作用，一方面把体内过多的水分排出，另一方面又使水分和无机盐得以继续进人根内，以保持生理平衡。叶内维管束的存在特别是具维管束鞘，这与水中生植物相似，而维管束内木质部不发达又具水生植物的典型特征。水分和无机盐靠木质部运输，水生植物水分供应充足，又由于排水器的作用，使水分和无机盐易于进人植物体内，这就使得木质部功能退化。

7.所述水苦荬是玄参科植物，别名水莴苣、水菠菜。该植物分布于流动潜水中，山区溪流及河流潜水段可见。水苦荬是多年生草本，通常在茎、花序轴、花梗、花萼和蒴果上多少有大头针状腺毛。根状茎斜走，节上生须根。茎直立或基部倾斜，高10-30cm，单一。叶对生，无柄，狭椭圆形或条状披针形，长2-4cm，宽3-7mm，先端钝尖或渐尖，基部半抱茎，边缘具疏而小的锯齿，两面无毛。水苦荬茎的横切面构造中，有较多的空隙，与水生或生长环境阴湿有明显的关系，次生构造不发达，气孔多为不等式或不定式，含有2种类型的腺毛及少量的非腺毛，叶的组织中可见草酸钙簇晶，导管多为网纹及螺纹。

8.一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置，其装置由可远程操控脉冲调制叶绿素荧光仪和带水下机器人的电动遥控双体船构成；其方法包括叶绿素荧光特性测定、光合有效辐射强度和水温测定、叶绿素含量测定和数据分析四个部分。

9.发明内容1所述一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置设电动遥控双体船、水下机器人、脉冲调制叶绿素荧光仪、水下机器人臂、叶夹片、摄像头，其特征是：

A.发明内容2所述电动遥控双体船设锂电池、双体船操控器，水下机器人设水下机器人遥控器，脉冲调制叶绿素荧光仪通过远端手持电脑远程操控；

B.发明内容2所述脉冲调制叶绿素荧光仪设有电脑控制芯片、数据线、光纤线；发明内容2所述脉冲调制叶绿素荧光仪长0.3米，宽0.15米，高0.15米，重2kg；其特征是电脑控制芯片，既仪器可本地储存测量的数据，又可与远端电脑进行实时数据传输并接收指令控制，方便远端实时观测遥控；同时，其数据线和光纤线均做防水设计，数据线、光纤线均通过水下机器人臂的中空管道连接脉冲调制叶绿素荧光仪，避免被水底植物沙石缠绕破坏，仪器上部是Led触摸屏幕，左右两边6个防水按键依次是取消键ESC，启动键，待机键，菜单键，光源转换键，确定键；仪器正面是电源开关键，USB接口，充电器口，电源指示灯，充电指示灯，无线wifi指示灯；

C.发明内容2所述电动遥控双体船1米长，0.6米宽，双体设计，不易倾覆，左右两边装锂电池，重10kg左右，中间部分安装脉冲调制叶绿素荧光仪，船的重心位置连接水下机器人，电动遥控双体船后端安装发动机；

D.发明内容2所述水下机器人设水下机器人臂、摄像头、云台、天线和控制器；通过水下机器人臂可以把叶夹片带入水底进行测量，同时摄像头可360度旋转查看，并能倾斜俯视水面，方便遥控查看电动遥控双体船的前进后退和水下机器人臂的移动；水下机器人设有云台，可保持平衡，同时云台上设有接收信号的天线和控制器，可远程操控；水下机器人臂采用6轴设计，方便灵活控制；水下机器人臂末端设摄像头，方便查看测量并控制叶夹片进行叶子夹取，叶夹片上端是光纤探头，连接脉冲调制叶绿素荧光仪的光纤线。

10.发明内容1所述叶绿素荧光特性测定由脉冲调制叶绿素荧光仪连接到手持电脑上进行，由WinControl-3软件控制，叶绿素荧光参数采用原位测定法；脉冲调制叶绿素荧光仪提供测量光、光化光和饱和脉冲光。其中测量光强度为0.1μmol·m^-2·s^-1，最大光化光为1500μmol·m^-2·s^-1，饱和脉冲强度大于10000μmol·m^-2·s^-1；选择无病害成熟的叶片(植株的中上部)作为实验材料，测量的位置为叶片中间部位；从7:00h-17:00h，每隔2h，随机采集沉水杉叶藻、沉水水苦荬和挺水杉叶藻的成熟叶片作为实验材料。

11.发明内容3所述叶绿素荧光特性测定包含最大光化学效率(Maximal quantum yield)、快速光响应曲线(Rapid light curves)、快速光响应曲线拟合三个内容，其特征是：

A.发明内容3所述的最大光化学效率(F_v/F_m)用脉冲调制叶绿素荧光仪测定，从7:00h-17:00h，每隔2h测定一次，随机选择生长一致且叶片受光方向相同的代表性5株植株的10个样品进行重复性测定；将叶片暗适应20min之后，首先开启检测光(0.1μmol·m^-2·s^-1)得到初始荧光(F_o)，而后照射饱和脉冲光(10000μmol·m^-2·s^-1)测得最大荧光(F_m)；

B.发明内容3所述的快速光响应曲线(RLCs)日变化测定从7:00h-17:00h，每隔2h测定一次，随机选择5株植株的5片成熟叶片，5次重复；荧光测量由电脑控制，步骤为：打开测量光并打开光化光，适应10s后打开饱和脉冲，升高光化光强度，适应10s后再打开饱和脉冲，如此重复8次；由于沉水和挺水型水生植物接受外界环境的光强有所不同，测定沉水植物时，依次设定光合有效辐射强度(Photosynthetically active radiation，PAR)为66，90，125，190，285，420，625，820μmol·m^-2·s^-1；而测定挺水植物时，依次设定PAR为125，190，285，420，625，820，1150，1500μmol·m^-2·s^-1；逐渐开启上述已设定的PAR，在每个强度的光化光照射10s后，打开饱和脉冲前的基础荧光F_s，打开饱和脉冲得到最大荧光F_m′，由此可以得出光适应状态下PS II的有效量子产量；根据有效量子产量和PAR可以计算出相对电子传递速率(Relative electron transport rate，ETR)；

C.发明内容3所述的快速光响应曲线拟合采用OriginPro7.5软件进行；曲线拟合采用最小二乘法，快速光曲线的拟合采用Platt(1980)的公式，可以得到无光抑制时的最大潜在相对电子传递速率(Maximum relative electron transport rate，ETR_max)，光能的利用效率(Photosynthetic efficiency，α)，以及半饱和光强(Saturating photon flux，E_k)。

12.发明内容1所述光合有效辐射强度和水温测定，其特征是从7:00h-17:00h，每隔2h测定一次光合有效辐射强(Photosynthetic Active Radiation，PAR)和水温，与叶绿素荧光参数测定同步；采用AccuPAR Lp-80Ceptometer测定水上(挺水植物顶端)和水下(沉水植物顶端)光合有效辐射强度。同时用温度计测定水温。

13.发明内容1所述叶绿素含量测定，其特征是：

A.选择当年生同一高度生长完整植株，分别摘取足够数量的叶片，装入密封塑料袋里，然后立即放人简易冰柜里、遮光贮存，于当日带回实验室进行测定；

B.取新鲜植株顶部的新鲜叶片，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀；称取剪碎的新鲜样品1.6g，分别放人研钵中并且在冰水中研磨，加少量石英砂及16ml丙酮研成匀浆(按鲜重∶丙酮＝1∶4(w/v))，在50ml离心管中混匀，于3000rpm，10min离心。收集上清液于试管中，然后再向离心管中加入丙酮，收集上清液与第一次的合并，将所得上清定容；取样50μL溶于80％丙酮，定容至5mL。然后采用分光光度计(UV-1240-PC，Shimadzu)测定663nm和645nm处光吸收值，按以下公式计算，得到数值为样品稀释100倍前的叶绿素浓度；每种植物重复测定6次；

14.发明内容1所述数据分析采用Spss17.0for Windows软件包进行统计分析，不同实验点的比较用单因素方差分析(ANOVA)；组间处理有显著差异时，Post Hoc进行验后多重比较组内差异；验后多重比较用Tukey HSD；所有统计图用OriginPro 7.5绘制。

15.一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法具体操作步骤如下：

第一步：见图1、图2、图3、图4、图5，实验人员组装一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置，测试各部件无线遥控信号正常；

第二步：通过遥控器进行遥控，将一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置移动到合适位置，并通过摄像头传回的图像，将水下机器人臂深入水底水生植物要测量的叶片位置，远端控制叶夹片的开启和闭合，夹住叶片；

第三步：开启脉冲调制叶绿素荧光仪发射荧光，测量水生植物在各种荧光照射条件下的变化，叶夹片传感器传回的数据直接储存入脉冲调制叶绿素荧光仪中，同时通过无线方式传到岸边的实验员手持电脑上，实时观察数据的变化。(测量数据还可以在远程进行，比如部署好整个设备后，实验员无需一直等待，可以回到实验基地(几公里外的实验室甚至宾馆)，通过无线网络远程监控整个实验，并远程遥控所有设备的工作。)

第四步：测量完毕，实验员收回一种九寨沟水生植物的叶绿素荧光特性研究方法与装置，数据分析。

16.上述数据分析结果如下：

A.光合有效辐射强度和水温的日变化数据分析

1)见图6，光合有效辐射强度与水温是影响水生植物光合作用最重要的环境因子。水体表面和水下光合有效辐射强度的日变化都呈明显的单峰型曲线，7:00h最低，随后迅速升高，在13:00h达到一天中的峰值。三个湖泊的水下光合有效辐射强度在7:00h都小于65μmol·m^-2·s^-1，而在正午时段(12:00h-14:00h)光合有效辐射较强度的都大于1800μmol·m^-2·s^-1。三个湖泊水上和水下光合有效辐射之间没有显著性差异。

2)见图7，水温日变化也呈明显的单峰型曲线，三个湖泊的最高水温都出现在13:00h。五花海一天中各时刻的水温显著高于芳草海和箭竹海，而芳草海和箭竹海各时刻水温之间没有显著性差异。

B.叶绿素含量数据分析

1)叶绿素是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，叶片中的光合色素是植物光合作用的基础，植株功能叶中叶绿素含量的高低在很大程度上反映了植株光合能力和生长状况。本试验结果显示在箭竹海和五花海之间，挺水杉叶藻的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)含量和叶绿素a/b没有显著性差异。三个湖泊的沉水杉叶藻的叶绿素a(F_2，17＝82.56，P＜0.01)和叶绿素(a+b)含量(F_2，17＝6.159，P＜0.05)有显著性差异。芳草海和箭竹海的沉水杉叶藻叶绿素a含量显著大于五花海，芳草海的沉水杉叶藻叶绿素(a+b)含量也显著大于五花海。而三个湖泊沉水杉叶藻叶绿素b含量和叶绿素a/b没有显著差异。

2)在箭竹海和五花海中，挺水杉叶藻的叶绿素a(箭竹海，F_1，11＝32.946，P＜0.01；五花海，F_1，11＝192.134，P＜0.01)、叶绿素a/b(箭，F_1，11＝12.060，P＜0.05；五，F_1，11＝9.745，P＜0.05)和叶绿素(a+b)含量(箭，F_1，11＝20.822，P＜0.01；五，F_1，11＝249.012，P＜0.01)都显著大于沉水杉叶藻，而沉水杉叶藻和挺水杉叶藻的叶绿素b没有显著性差异。

3)芳草海的沉水杉叶藻的叶绿素a(F_1，11＝38.376，P＜0.01)、叶绿素b(F_1，11＝11.613，P＜0.05)、叶绿素(a+b)含量(F_1，11＝35.048，P＜0.01)都显著大于沉水水苦荬。但是两种沉水植物的叶绿素a/b没有显著性差异。

C.沉水植物叶绿素荧光特性研究数据分析

1)快速光响应曲线数日变化据分析

ETR是反映实际光强下的相对电子传递速率，用于度量光化学反应导致碳固定的电子传递情况，其值由光强、叶片吸收光系数和有效荧光产量计算得到。见图8，由图8a，c，d可知，9:00h五花海沉水杉叶藻的ETR达到一天中的最高值，而另外两个湖泊是13:00h。7:00h、9:00h和17:00h，在一定光强范围内，芳草海和箭竹海的沉水杉叶藻的ETR不断上升，但是当光强过大，超过饱和光强后(285μmol·m^-2·s^-1)，ETR值开始下降；11:00h和13:00h的ETR随着PAR一直逐渐升高；而15:00h在PAR为625-820μmol·m^-2·s^-1缓慢下降。7:00h和17:00h，五花海沉水杉叶藻的ETR在PAR为420μmol·m^-2·s^-1时降低；9:00h和11:00h的ETR随着PAR逐渐升高。

见图8，由图8b可知，同一湖泊的沉水杉叶藻和水苦荬ETR的日变化，都是在13:00h达到一天中最大。并且13:00h水苦荬ETR随着PAR迅速升高，呈近线性关系；而沉水杉叶藻13:00h的ETR在PAR为420μmol·m^-2·s^-1后，一直缓慢增加。

2)最大潜在电子传递速率(ETR_max)、光能利用效率(α)、半饱和光强(E_k)日变化数据分析

见图9，图9a表明，7:00h-17:00h期间，芳草海的沉水杉叶藻ETR_max日变化呈典型的单峰型曲线，7:00h左右最低为13.14±4.05μmol·m^-2·s^-1，而后迅速上升13:00h左右达到其高峰值(54.47±4.05μmol·m^-2·s^-1)，此时光合有效辐射亦达到一天中的最高值，之后逐渐下降，到17:00h降为30.12±1.83μmol·m^-2·s^-1。而箭竹海的沉水杉叶藻ETR_max日变化呈双峰型曲线，9:00h出现第一个峰值，而后下降，13:00h达到一天中的最大值53.13±1.46μmol·m^-2·s^-1。五花海沉水杉叶藻ETR_max一天中的最高值(89.55±2.86μmol·m^-2·s^-1)出现在上午9:00h，并且显著高于其余两个湖泊ETR_max的最高值。光合参数(α)可以反映植物叶片对光能的利用效率，表现了植物叶片捕光能力的大小。图9b表明，三个湖泊沉水杉叶藻α日变化都表现为，7:00h和17:00h较高，正午位于谷底，并且三个湖泊沉水杉叶藻α日变化无显著差异。每个湖泊沉水杉叶藻E_k日变化趋势与其各自的ETR_max基本一致，五花海沉水杉叶藻E_k显著高于另外两个湖泊。

为进一步说明光合有效辐射强度和水温对三个湖泊沉水杉叶藻ETR_max的影响。将三个湖泊沉水杉叶藻ETR_max与光强、水温进行了相关性分析(进行相关性分析之前，将ETR_max和PAR以log₁₀^(x)转换)。结果表明，三个湖泊沉水杉叶藻ETR_max与光强呈显著正相关(P＜0.05)，与水温呈极显著正相关(P＜0.01)(见图10)。同时，ETR_max与水温的相关系数(R²＝0.6849)要明显大于ETR_max与光强的相关系数(R²＝0.334)，表明水温是影响三个湖泊沉水杉叶藻ETR_max主导因素。

见图11，从图11a可以看出，芳草海的杉叶藻和水苦荬ETR_max的日变化趋势比较一致的，两者的ETR_max的日变化都呈单峰型曲线，且ETR_max在上午13:00h左右均达到最大值。但从15:00h的ETR_max大小来看，杉叶藻和水苦荬ETR_max的日变化还是有极显著差异，杉叶藻和水苦荬ETR_max分别为40.51和60.68μmol·m^-2·s^-1，可见这两种沉水植物的ETR_max下午的差异比上午的要明显得多，这些都是由其各自的生理特性所决定的。由于不同沉水植物在生长过程中对周围环境的适应能力不同，从而导致它们在整个生长过程中对周围环境表现出不同的响应。由图11b中看出，杉叶藻和水苦荬α的日变化趋势同样是比较一致的，7:00h-9:00h，α迅速升高，高峰出现在9:00h；而后，由于光照强度继续增强，水温上升，α开始下降，在13:00h达到谷值；15:00-17:00h才有所回升，17:00h再次出现高峰。但是从两种沉水植物α大小来看，在9:00h、15:00h、17:00h出现显著差异。杉叶藻和水苦荬E_k日变化趋势与其各自的ETR_max基本一致，同样在15:00h，水苦荬E_k极显著大于杉叶藻。

3)最大光化学效率(F_v/F_m)日变化数据分析

叶绿素荧光参数的分析有助于分析光合机构受影响的部位，光系统II(PS II)的光化学效率是表明光化学反应状况的一个重要参数。叶绿素荧光参数F_v/F_m反映了当所有的PS II反应中心均处于开放态时的量子产量，可以直接作为原初光化学效率的指标，其值降低是光抑制最明显的特征之一。见图12，由图12a看出，三个湖泊沉水杉叶藻F_v/F_m日变化都呈“V”字形。清晨7:00h是一天中的最高值，之后随着光合有效辐射强度和水温的增加，F_v/F_m呈逐渐降低的趋势，芳草海和箭竹海的沉水杉叶藻的F_v/F_m在11:00h降至最低值，分别比7:00h降低了11.1％和9.1％；而五花海F_v/F_m至13:00h达到最低值，比7:00h降低了11.3％，表明三个湖泊沉水植物都受到光抑制。之后随着光照强度的降低，F_v/F_m开始恢复，17:00h芳草海和箭竹海F_v/F_m分别恢复了92.42％和95.71％，可见傍晚未恢复到清晨水平，而五花海F_v/F_m恢复到清晨的近似值。

从图12b中可以看出，芳草海的沉水杉叶藻和水苦荬F_v/F_m的日变化趋势相似，在7:00h最高，之后逐渐降低，分别在11:00h和13:00h降至最低值，午后逐渐恢复，17:00h两种沉水植物F_v/F_m都未恢复到清晨水平。

D.挺水植物叶绿素荧光特性研究数据分析

1)快速光响应曲线日变化数据分析

入射到叶片的光能仅有84％可被叶片吸收，而这些吸收的光能又仅有50％被分配到PS II。当吸收的光能达到过饱和时，ETR与入射的PAR呈非线性关系，最后ETR达到饱和状态，这代表了光合电子传递的能力，这种能力取决于植物自身的生理状况和环境因素。见图13，由图13a可知，箭竹海挺水杉叶藻ETR在13:00h达到一天中最高值，而五花海却在11:00h。7:00h、9:00h和17:00h，箭竹海挺水杉叶藻在PAR大于1150μmol·m^-2·s^-1时ETR开始下降；15:00h在达到一定PAR(1150μmol·m^-2·s^-1)后增加缓慢；11:00h和13:00h的ETR随着PAR一直逐渐升高。7:00h，五花海同样在PAR大于1150μmol·m^-2·s^-1时ETR开始下降；17:00h，PAR大于820μmol·m^-2·s^-1时ETR开始下降；9:00h、11:00h、13:00h和15:00h的ETR随着PAR一直逐渐升高。

2)最大潜在电子传递速率(ETR_max)、光能利用效率(α)、半饱和光强(E_k)日变化数据分析

由图14可知，箭竹海挺水杉叶藻ETR_max和E_k日变化均呈单峰型曲线，从7:00h-13:00h，随着环境因子的变化而不断上升，在13:00h左右达到一天中最大值，分别为156.63μmol·m^-2·s^-1和621.16μmol·m^-2·s^-1，之后不断下降。而五花海挺水杉叶藻ETR_max和E_k日变化均呈双峰型曲线，从7:00h开始增加，至11:00h达到一天中的最高值，分别为221.68μmol·m^-2·s^-1和737.53μmol·m^-2·s^-1；之后不断下降，在15:00h左右出现次高峰，分别为189.54μmol·m^-2·s^-1和630.73μmol·m^-2·s^-1。总体来看，五花海挺水杉叶藻ETR_max和E_k都极显著高于箭竹海。箭竹海挺水杉叶藻α日变化表现为，清晨α随PAR升高而迅速上升，在9:00h达到峰值；此后α随PAR升高而下降，并在13:00h达谷底；随后PAR逐渐下降，α却逐渐升高，在17:00h达到的峰值(与9:00h接近)。但是五花海挺水杉叶藻α日变化从7:00h-17:00h几乎没有波动。

3)最大光化学效率(F_v/F_m)日变化数据分析

见图15，光抑制指标F_v/F_m代表PS II原初光能转化效率(原初光化学效率)，在非逆境条件下，该参数的变化极小，多数植物一般介于0.80-0.85之间，但在胁迫条件下，该参数明显降低。由图15看出，箭竹海和五花海挺水杉叶藻7:00h的F_v/F_m分别为0.81和0.82，之后都随着光合有效辐射强度和水温增加呈显著降低趋势，至13:00h降至最低，分别比7:00h降低了7.3％和11.3％；随后F_v/F_m逐渐恢复，17:00h两个湖泊挺水杉叶藻F_v/F_m能恢复到7:00h近似值。