本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及八种蛋白质用作鉴定浆膜层浸润深度胃癌的分子标记的应用。
背景技术：
：：1.胃癌现状概述胃癌(Gastriccancer,GC)是目前世界上发病率第五高和致死率第三高的癌症[1,2]，已严重威胁到人类的生活和健康。2012年有951600新生患者，死亡人数达723100人[1]。胃癌在东南亚地区发病率最高，尤其在中国、韩国和日本等国家，在亚洲国家发病率高达50/100000[3]；另外，全球范围内，男性的发病率是女性的两倍2。另外，胃癌的5年总体存活率低于25％，尤其是在中国、美国和欧洲等地区[4,5]。中国是胃癌高发地区之一，2014年中国因胃癌导致死亡的人数排世界第三，且占中国总死亡人数的3.56％，达32万多人，死亡人数仅仅也只比肝癌和肺癌死亡人数少。根据全国肿瘤登记中心TheNationalCentralCancerRegistryofChina(NCCR)数据显示，2015年中国的胃癌男性的发病率和致死率都高于女性两倍多；同时，其中华东地区和南方地区的胃癌发病率最高[6]。2.胃癌的TNM分期肿瘤的分期(staging)是根据原发肿瘤的大小、浸润的深度、范围以及是否累及邻近器官、有无局部和远处淋巴结的转移、有无血源性或其他远处转移等参数来确定的，其的实质是反映肿瘤的侵袭转移程度，是评价恶性肿瘤侵袭转移范围、病程进展程度和预后的重要指标。TNM分期系统由PierreDenoix在1943-1952年间提出的[7]，1974年首次提出了针对胃癌的TNM分期系统[8]，TNM三个字母分别表示肿瘤(tumor)、淋巴结(node)和转移(metastasis)。TNM分期系统已成为最常用的分期系统，并且是针对实体瘤分期的公认标准，它能够反映恶性肿瘤进展、判断预后的最可靠的独立指标[9]。TNM定义癌症发展过程中的了3个层次的关键信息：1)原发肿瘤(T)：该分期描述原发肿瘤的大小和性质，以及它侵染胃壁层和临近器官的速度；其中，T1表示肿瘤侵犯粘膜层，T4表示侵犯浆膜层。2)区域淋巴结(N)：分期描述肿瘤侵染临近或者区域性淋巴结的程度和速度；其中，N0表示区域淋巴结无转移，N+表示区域淋巴结有转移。3)远处转移(M)：该分期描述了肿瘤远端转移的程度；其中，M0表示无远处转移，M1表示有远处转移。精确的肿瘤分期不仅是准确预测恶性肿瘤生物学行为及预后的可靠指标，也能为临床医师提供准确的患者分层管理依据，还是选择辅助治疗方案、提高治疗效果的基本前提。3.生物标志物生物标志物的筛选已经成为目前生物医学领域研究的热点。一个具有临床应用价值的生物标志物不仅要具有足够的组织特异性用于疾病预测，而且还需要较高的灵敏度。4.血清蛋白质检测的重要意义人体近5L的血液通过血液循环系统流经超过6万英里的动脉、静脉和毛细血管，血液为细胞运送氧气、营养物质，其运出二氧化碳和代谢废物。一方面，血清作为血液主要成分，包含了特定生理病理状态下整个机体的充分信息，能充分反映机体的代谢状况；另一方面，血液蛋白质组具有包含其他任何特定细胞中的蛋白质的潜力[10-12]。所以测定血清中蛋白质的浓度变化对于疾病的诊断、发展、分子病理病因的研究以及药物疗效检测具有十分重要的意义。5.八种相关蛋白质C9，Complementcomponent9,isoformCRA，是补体系统中膜攻击复合物最后的重要组成，有众多报道C9蛋白在食管道癌、急性白血病、直肠癌等疾病中都上调表达。2010年Poh-KuanChong等人发现在胃癌病人中血浆C9蛋白显著上调[13]。另外，2011年ArulNarayanasamy等人发现，在鳞状细胞肺癌中C9也高表达[14]。LRG1，Leucine-richalpha-2-glycoprotein，包含8个重复序列，亮氨酸富集序列，可结合细胞色素c，可以有助于细胞存活，同时，它是急性期蛋白，可由白细胞介素IL-6和IL-1β和肿瘤坏死因子TNFα等诱导表达。通过内皮细胞的转化生长因子β(TGFβ)信号通路促进血管生成。LRG1所属的亮氨酸富集重复家族，涉及蛋白质相互作用、信号传导、细胞黏附、发育等众多功能。2013年，Yih-HueiUen等人发现LRG1在胃癌患者中相对于正常人显著上调，表明LRG1高表达可能对肿瘤细胞浸润有促进作用[15]。APOC3(apolipoproteinC-III)，早在2006，Hong-LeiHuang等人发现在乳腺癌中出现了下调[16]。2009年,YuxiaFan等人发现在乳头状甲状腺癌(PTC)中也下调，并且随着癌症发展，下调更多[17]。这些研究表明脂蛋白在多种癌肿中代谢异常。TTR，Transthyretin，以及RBP4，Retinolbindingprotein4。TTR是同源四聚体，55kDa，主要由肝脏、胰岛A和B细胞等合成，主要作用是转运血液中的甲状腺素和三碘甲状腺氨酸，以及通过与RBP蛋白结合转运视黄醇。RBP4是21kDa的脂质运载蛋白，由肝脏、脂肪细胞、巨噬细胞核一些上皮细胞产生，因为RBP4相对较小，为了避免肾小球过滤作用，它与TTR蛋白结合，其最主要的功能是转运视黄醇(维生素A)，涉及造血、生殖、细胞增殖等多方面的生理功能。2004、2007、2008年分别发现TTR在卵巢癌、肺癌和胆管癌中都有下调[18-20]。2012年，研究发现上皮卵巢癌病患者中RBP4显著下调，RBP4的变化反映了视黄醇代谢变化与卵巢产生之间的关系，也可能反映了一些能量代谢相关的生理功能和机体系统性的变化[21]。AHSG，Alpha-2-HS-glycoprotein，α2巯基糖蛋白，又称为胎球蛋白A(Fetuin-A)，63kDa,是肝脏分泌蛋白，糖链修饰，可以被磷酸化，在大脑发育、抑制异常钙化、骨重塑等方面有重要作用。因为存在受体2同源结构域(TRH1)，AHSG作为二型转化生长因子β(II-TGFβ)受体相似物而作为TGF的拮抗剂，因此可潜在的能够与上皮细胞TGFβ竞争结合；也可结合其他受体，如胰岛素受体，可与脂质相互作用，其能结合多种关键细胞受体和生长因子，也表面它可能促进或者抑制生长信号途径。2004年，CarolJ.Swallow等人发现在结直肠癌中，AHSG下调了，且AHSG与TGF受体结合，抑制TGFβ依赖的信号通路，抑制信号转导分子Smad2/3的活性，从而抑制肿瘤发生[22]。2011年，FraserMaxwell等人发现，结直肠癌患者的端粒更短，并且AHSG浓度较低[23]。BTD，Biotinidase，生物素酰胺酶。生物素是很多羧化酶的辅酶，起二氧化碳载体作用，生物素通过赖氨酸与羧化酶相结合，形成的复合物称为生物胞素；而BTD主要功能是水解生物胞素从而释放生物素，以循环利用；羧化全酶合成酶(holocarboxylasesynthetase，HLCS)对食物中生物素有效利用有重要作用，它可以激活很多其他生物素依赖的羧化酶。它涉及三大营养物质合成和代谢等作用，在细胞核内，它还将生物素结合到组蛋白上，从而可以调节染色质结构和影响基因表达，而缺少生物素，羧化全酶合成酶活性将会降低。2010年Un-BeomKang等人发现在乳腺癌患者中BTD显著下调[24]。Afamin主要由肝脏表达，并分泌到血液中的糖蛋白，其主要功能是特异结合维生素E。它涉及很多代谢综合症，如肥胖，妊娠并发症、卵巢癌、血脂异常、糖尿病和高血压等。还参与骨代谢和神经保护等生理功能。2013年，AndreasMelmer发现在术前的卵巢癌病人中Afamin显著下调；且高浓度的afamin与高存活率相关[25]。2014年，JuliaM.Humphries等人发现在早期胃癌中Afamin蛋白质表达下调了[26]。技术实现要素：为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同用于制备或筛选胃癌诊断试剂的用途。本发明中全文，所述C9的UniprotAccession为A0A024R035。本发明中全文，所述LRG1的UniprotAccession为Q68CK4。本发明中全文，所述APOC3的UniprotAccession为A3KPE2。本发明中全文，所述RBP4的UniprotAccession为Q5VY30。本发明中全文，所述TTR的UniprotAccession为E9KL36。本发明中全文，所述AHSD的UniprotAccession为P02765。本发明中全文，所述BTD的UniprotAccession为P43251。本发明中全文，所述Afamin的UniprotAccession为P43652。本发明的另一目的在于提供特异识别C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的用途。本发明的另一目的在于提供一种胃癌诊断试剂盒。本发明的另一目的在于提供C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同作为胃癌标志物的用途。本发明的另一目的在于提供一种胃癌诊断方法。为了实现上述目的及其他相关目的，本发明是采用以下技术方案：本发明的第一方面，提供C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同用于制备或筛选胃癌诊断试剂的用途。较优的，C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同作为生物标志物。更优的，C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同作为血清生物标志物。优选地，C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同用于制备或筛选胃癌诊断试剂，包括两方面的内容：其一，C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同用于制备胃癌诊断试剂，是指将C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同作为胃癌诊断指标应用于胃癌诊断试剂的制备。在一些实施方式中，可将C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同作为标准品或阳性对照，用于样本血清中的C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白水平的检测。其二，C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同用于筛选胃癌诊断试剂，是指将C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同作为胃癌的识别靶标筛选同时或分别特异性识别这八个蛋白的试剂，从而作为胃癌诊断试剂，来检测胃癌。在一些实施方式中，基于所述的C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白共同筛选同时或分别特异性结合C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白共同的抗体或配体，从而作为胃癌诊断试剂。优选地，所述胃癌为浆膜层浸润深度胃癌。本发明的第二方面，提供了同时或分别特异性识别C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的用途。在一些实施方式中，所述的同时或分别特异性识别C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白的试剂选自同时或分别特异性结合C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白的抗体或配体。在一些实施方式中，所述抗体包括包括单克隆抗体和多克隆抗体。优选地，所述胃癌为浆膜层浸润深度胃癌。在本发明的第三方面，提供了一种胃癌诊断试剂盒，所述的试剂盒中至少含有同时或分别特异性识别C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白共同的试剂。在一些实施方式中，所述的同时或分别特异性识别C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白的试剂选自同时或分别特异性结合C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白的抗体或配体。在一些实施方式中，所述抗体包括包括单克隆抗体和多克隆抗体。在一些实施方式中，所述的试剂盒中还含有：免疫结合(如抗原抗体结合)试剂；或酶联免疫检测(ELISA)试剂。优选地，所述胃癌为浆膜层浸润深度胃癌。在本发明的第四方面，提供了C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白联合共同作为胃癌生物标志物的用途。较优的，所述生物标志物为血清生物标志物。在本发明的第五方面，提供了一种诊断胃癌的方法，包括检测样本血清中C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin这八个蛋白的水平。优选地，所述胃癌为浆膜层浸润深度胃癌。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明首次揭示C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin八个蛋白质具有作为能够区分浸润深度为T1和T4的胃癌的标志物(ROC曲线下面积达1，T1N0与T4N0两组比较p值<0.05,而T1N0与T1N+两组比较p值>0.05)，这些蛋白质可对浆膜层浸润深度胃癌的临床诊断提供依据。附图说明图1：蛋白C9在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。图2：蛋白LRG1在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。图3：蛋白APOC3在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。图4：蛋白RBP4在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。图5：蛋白TTR在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。图6：蛋白AHSG在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。图7：蛋白BTD在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。图8：蛋白Afamin在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。图9：C9用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。图10：LRG1用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。图11：APOC3用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。图12：RBP4用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。图13：TTR用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。图14：AHSG用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。图15：BTD用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。图16：Afamin用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。图17：C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin联合共同用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
：技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
：的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
：常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECμLARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECμLARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECμLARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。实施例1试剂与实验流程1.试剂与耗材注：所有缓冲液均用Milli-Q水(Millipore)配制。2.人类血浆样本的收集与制备本章工作共涉及到30例人类血清样本：T1N0M0(10例，浸润深度为粘膜层，无淋巴结转移，无远端转移)，后文简写T1N0；T1N+M0(10例，浸润深度为粘膜层，有淋巴结转移，无远端转移)，后文简写为T1N+；T4aN0M0(10例，浸润深度为浆膜层，无淋巴结转移，无远端转移)，后文简写为T4N0。所有30例样本均来源于复旦大学附属中山医院。人血液样品的获取严格遵照中国法律和伦理委员会的指导方针进行，每个病人都签署了知情同意书。3.高丰度蛋白质的去除采用Agilent公司的MARS(multipleaffinityremovalsystem5188-6408)去除7种人类血浆蛋白质高丰度组分(白蛋白，IgG，IgA，转铁蛋白，结合珠蛋白，抗胰蛋白酶，纤维蛋白)[27]。具体操作为：1)用A液将12μL血清稀释到200μL，再利用0.22μm的超滤管，4℃,1000g,离心15min除去脂类，保存滤液；2)用4mLA液平衡MARS柱子后，取过滤后的滤出液(200μL)于柱子上，4℃，200g，离心1min。保存滤液；3)再加入300μLA液，4℃，200g，离心1min，保存滤液；4)再加入400μLA液，4℃，200g，离心1min，保存滤液；5)将2)、3)、4)三步中得到的滤液合并至新离心管中，即得到除高丰度蛋白质的血清样本；冻干，-80℃保存；6)用1.8mLB液缓缓洗脱下结合在柱子上的高丰度蛋白质组分。再用4mLA液平衡柱子，平衡后的柱子可重复使用。4.蛋白质或肽段荧光定量蛋白质中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸可以吸收270-300nm的紫外光而发出紫外荧光；当用295nm波长作为激发光时，色氨酸在350nm有最大吸收，于是本实验用色氨酸荧光法定量蛋白质浓度[7]。首先，将色氨酸配成0、50、100、200、300、400ng/μL的标准品，以及将除高丰度后冻干的30例血清样本用150ul4MUA缓冲液(4MUrea,0.1MTris-HCl,pH8.5)复溶。再将各浓度标准品和样本分别取2.5μL溶于1.5mLDilutionbuffer(8MUrea，20mMTris-HCl，pH7.6)中，用荧光分光光度计测量。各浓度标准品结果用于绘制标准曲线，测得的样本浓度是色氨酸的浓度，再除以1.3％得到样本蛋白质或肽段的浓度。5.溶液内酶解1)根据荧光定量的结果，取100μg用4MUA缓冲液复溶的样品置于1.5mL离心管，再加入2μL1MDTT(配在4MUA缓冲溶液中)，并置于37℃温箱中2.5h；2)再向体系中加入10μL1MIAA(配在4MUA缓冲溶液中)，室温暗反应40min，由此蛋白质完全变性，二硫键被打开，巯基被封闭；3)再将溶液置于1.5mL10K超滤管，用200μL0.1MTEAB，13000g离心15min，洗涤3次，弃掉滤液；4)加入100μL0.1MTEAB，并按质量比(胰酶：蛋白质＝1:25)向超滤管中加入胰蛋白酶，置于37℃摇床中，酶解16h；5)再按酶：蛋白质＝1:25向超滤管中补加一次胰蛋白酶继续酶解4h；6)酶解后的肽段混合物13000g离心收集滤出液，冻干-80℃保存待用。6.二甲基稳定同位素标记三个通道(轻、中、重)，每一个通道标记一个样品，3个为一组，每组添加Mix内参样本。共30个样本，其中T1N0组为对照组(无淋巴结转移，浸润深度仅为粘膜层)做两次重复，T1N+和T4N0为实验组，分别10个样本，所以共标记20组，具体标记顺序如下表1。每个样本肽段为12μg。具体实验操作步骤为：1)三组样本标记平行操作，将肽段溶解在100μL0.1MTEAB中；2)分别加入4μL4％(v/v)的CH2O(轻)，CD2O(中)或13CD2O(重)，混匀；3)加4μL0.6MNaBH3CN到轻标和中标样本，4μL0.6MNaBD3CN到重标样本，混匀；4)在混匀器上常温孵育1h；5)加16μL1％(v/v)氨水，振荡混匀，终止标记反应；6)加8μL5％甲酸(v/v)进一步终止反应并酸化样本；7)再将每组的三种标记样本混合在一起，冻干-80℃保存待用。方法参考文献[101]。表1.样品标记信息LMHGC1MixZG163_T1N0ZG177_T1N+GC2MixZG527_T1N0ZG174_T1N+GC3MixZG130_T1N0ZG233_T1N+GC4MixZG304_T1N0ZG175_T4N0GC5MixZG480_T1N0ZG94_T4N0GC6MixZG293_T1N0ZG443_T4N0GC7MixZG352_T1N0ZG257_T4N0GC8ZG581_T1N+MixZG366_T1N0GC9ZG103_T1N+MixZG275_T1N0GC10ZG224_T1N+MixZG297_T1N0GC11ZG81_T4N0MixZG163_T1N0GC12ZG343_T4N0MixZG527_T1N0GC13ZG450_T4N0MixZG130_T1N0GC14ZG304_T1N0ZG504_T1N+MixGC15ZG480_T1N0ZG364_T1N+MixGC16ZG293_T1N0ZG351_T1N+MixGC17ZG352_T1N0ZG386_T1N+MixGC18ZG366_T1N0ZG105_T4N0MixGC19ZG275_T1N0ZG479_T4N0MixGC20ZG297_T1N0ZG277_T4N0Mix注：GC：gastriccancer；L：“light”；M：“intermediate”；H：“heavy。7.肽段C18StageTip脱盐因为是小体积脱盐(<20ug),于是将每一标记组冻干后样品用600μL0.2％TFA的水溶液充分溶解，并平行操作3份。1)2层C18Disk填料填于200μL枪头中，200μL甲醇活化，室温2000g离心至少量液体剩余，去掉滤液；2)加200μL0.2％TFAin80％ACN洗填料，以最大限度去除污染物，2500g离心，重复一次；3)加200μL0.2％TFA的水溶液平衡填料3次，2500g离心，去滤液；4)每个样品取200μL结合到stage-tip上，1000g离心5min，以保证样品与C18填料充分结合；5)加200μL含0.2％TFA的水溶液洗涤3次，2500g离心，以去除盐类等不能与C18填料结合的亲水成分；6)最后，用50μL含0.2％TFAin90％ACN洗脱2次，2500g离心，收集滤液；7)将同一标记组的3份脱盐样本合并，冻干-80℃保存待用；方法参考文献[170]。8.肽段分级利用PierceTMHighpHReversed-PhasePetideFractionKit试剂盒进行肽段分级，具体步骤：1)配制0.1％的三氟乙酸(TFAinH2O)和分级洗脱溶液(ACNinTriethylamine)，洗脱液见table1；2)去掉底部白色保护套，放置于2mL离心管(sampletube)，5000g离心2min除去内置溶液，以及压紧树脂材料；3)去掉上端螺丝帽，再加入300μLACN，盖好盖子，5000g离心2min，弃ACN，重复洗涤一次；4)再用300μL0.1％TFA，5000g离心2min，洗涤两次，由此柱子准备完毕即可用于分级；5)将脱盐冻干的样品溶于300μL0.1％的TFA(注:肽段样品需要充分溶解，并且不含有ACN、DSMO等有机溶剂，含尿素的样品，其尿素终浓度<1M)；6)换新的2mL离心管，将300μL样品溶液加入柱子中，盖上盖子，3000g离心2min，得到组分Ft(flow-throughfraction)；7)换新的2mL离心管，加入300μL水，3000g离心2min，得到组分Fw(washfraction)；8)依次换新的2mL离心管，按梯度加入300μL洗脱液(Table1)，3000g离心2min，收集各组分(F1,F2,F3…F8)；9)将同一个标记组的分级组分Ft、Fw、F8合并到F1，最后共计7个组分；并冻干-80℃保存待用。9.多维液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析LC-MS/MS分析用的液相是Ultimate300(ThermoFisher)，质谱仪是LTQ-Orbitrap-Velos(ThermoFisherScientific,SanJose,CA),C18反相色谱柱为实验室自制喷针反相柱75μm×150mm，3μm填料，流动相A液是0.1％甲酸的水溶液(0.1％FAinH2O)，B液是0.1％甲酸的乙腈溶液(0.1％FAinACN)。首先，色谱梯度设置(％B:时间)具体如下：5％2min；5％-27％68min；27％-40％5min；40％-90％5min；90％-90％3min；90％-1％0.1min；1％-1％0.69min；分离总时间90min，流速是250nL/min。其次，数据采集模式是“高-低”模式，利用Orbitrap做一级全扫，范围是300-2000m/z，分辨率为60000@m/z200，AGC为1E6；二级扫描则用IonTrap、正离子模式检测，数据依赖性采集模式(DDA)，其中取强度top20，CID碎裂，扫描范围200-2000m/z,35.0％NCE，AGC为1E4。最后，按按照重复次数为1、重复时间30s、排除时间120s标准设置动态排除。10.数据库搜索质谱仪采集的原始RAW文件用Maxquant1.5.2.8软件进行分析，采用的数据库是2016年3月9号下载的Uniprothomosapiens数据库。固定修饰设置为半胱氨酸羧甲基化(CystineCarbamidomethyl)；可变修饰为蛋白质N段乙酰化(N-acetylation)和甲硫氨酸氧化(oxidizedmethionine)，酶解模式选择Trypsin/P，酶切损失位点最大为2个，每条肽段最多5个修饰，肽段Firstsearch和Mainsearch的质量容忍度分别为20ppm和4.5ppm，Decoy模式选择Revert，肽段最大质量是4600Da，肽段和蛋白质的假阳性率FDR(falsediscoveryrate)均为0.01，勾选Secondpeptidesidentification，提高肽段的鉴定数。11.统计学及生物信息学分析将数据用中位数归一化，然后除以Mix组内参样品数据，对数据做校正，再以Log2取对数。所有数据分析和统计学检验都使用R安装包或者Excel完成。实施例2差异蛋白质分析与标志物寻找差异蛋白质分析基于统计数值p值(pvalue)，它是当原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率。根据小概率原理，如果原假设发生的概率很小，我们就有理由拒绝原假设，当p值越小，我们拒绝原假设的理由越充分。总之，p值越小，表明结果越显著。本研究中，选定当p<0.05时表示有差异。同时，为了进一步确定差异蛋白质，在p值的基础上，我们还通过蛋白质在不同组间表达量变化差异倍数(Fc，fold-change)来衡量差异蛋白质，我们选取的倍数是上调1.3倍，或者下调0.77倍。标志物的诊断价值可以通过ROC曲线(受试者工作特征曲线)的曲线下面积判断，ROC曲线指受试者工作特征曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标,是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感性和特异性，再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积越大，诊断准确性越高。一般认为，曲线下面积高于0.9时诊断价值较高。表2.T1N0与T4N0两组差异蛋白具体信息T1N0组、T1N+组、T4N0组两两比较时，胃癌浸润深度不同两组(T1N0和T4N0)中，随着浸润深度加深达到浆膜层状态时，利用独立样本T检验(t-test)，其p值小于0.05，且Fc大于1.3或小于0.77，发现C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin八个蛋白质表达显著差异。其中C9和LRG1两个蛋白质在T4N0组中表达上调，其他6个蛋白质在T4N0组中表达下调。具体信息见表2。与此同时，在T1N0与T0N+两组比较中，该8个蛋白质没有显著差异，其p值都大于0.05。利用这8个蛋白质分别做受试者工作特征曲线(ROC曲线)，它们的曲线下面积(AUC)最小为0.73，最大也只有0.89。而当我们将上述八种蛋白质结合在一起为指标来做受试者工作特征曲线，发现ROC曲线下面积达到1，表明将它们共同作为标志物，对于鉴定浆膜层浸润深度的胃癌有非常高的诊断指标价值。2.八种蛋白质在不同组内的定量展示如图1～8一系列图展示了C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin八个蛋白质在不同组内的定量情况，其中纵坐标为质谱鉴定强度值，星号表示显著性。3.八种蛋白质用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线如图9～17系列图表示C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin各个蛋白质及其整合结果用于鉴定浆膜层浸润深度胃癌的ROC曲线。综上所述，胃癌作为世界上发病率第五高和致死率第三高的癌症，已经严重威胁到人类的健康。肿瘤的分期(staging)的实质是反映肿瘤的侵袭转移程度，精确的肿瘤分期不仅是准确预测恶性肿瘤生物学行为及预后的可靠指标。因此，对于胃癌浸润深度不同的特异生物标志物的发现，有助于快速方便地区分不同浸润深度的胃癌，以此为医师提供准确的患者分层管理依据，并选择适宜的治疗方案，以减少病患者痛苦和提高治疗效果。本工作基于稳定同位素二甲基标记策略精确定量分析了对临床胃癌血清样本的蛋白质组，揭示C9,LRG1,APOC3,RBP4,TTR,AHSG,TTR,AHSD,BTD和Afamin八个蛋白质具有作为能够区分浸润深度为T1和T4的胃癌的标志物(ROC曲线下面积达1，T1N0与T4N0两组比较p值<0.05,而T1N0与T1N+两组比较p值>0.05)，这些蛋白质可对浆膜层浸润深度胃癌的临床诊断提供依据。参考文献1.Torre,L.A.,etal.,Globalcancerstatistics,2012.CACancerJClin,2015.65(2):p.87-108.2.Tan,P.andK.G.Yeoh,GeneticsandMolecularPathogenesisofGastricAdenocarcinoma.Gastroenterology,2015.149(5):p.1153-1162.3.Jemal,A.,etal.,Cancerstatistics,2010.CACancerJClin,2010.60(5):p.277-300.4.Jemal,A.,etal.,Cancerstatistics,2009.CACancerJClin,2009.59(4):p.225-249.5.Jemal,A.,etal.,Cancerstatistics,2008.CACancerJClin,2008.58(2):p.71-96.6.Chen,W.,etal.,CancerstatisticsinChina,2015.CACancerJClin,2016.66(2):p.115-132.7.PF.,D.,Nomenclaturedescancer.BullInstNatHyg(Paris),1944.1944:p.69-73.8.TNMClassificationofMalignantTumors,2ndedition.InternationalUnionAgainstCancer(UICC).Geneva:,1974.Geneva:UICC,.9.Graziosi,L.,etal.,PrognosticvalueoftheseventhAJCC/UICCTNMclassificationofnon-cardiagastriccancer.WorldJSurgOncol,2013.11:p.103.10.Dunn,W.B.,etal.,AGC-TOF-MSstudyofthestabilityofserumandurinemetabolomesduringtheUKBiobanksamplecollectionandpreparationprotocols.IntJEpidemiol,2008.37Suppl1:p.i23-30.11.Issaq,H.J.,Z.Xiao,andT.D.Veenstra,Serumandplasmaproteomics.ChemRev,2007.107(8):p.3601-3620.12.Lathrop,J.T.,etal.,Raritygivesacharm:evaluationoftraceproteinsinplasmaandserum.ExpertRevProteomics,2005.2(3):p.393-406.13.Chong,P.K.,etal.,UpregulationofplasmaC9proteiningastriccancerpatients.Proteomics,2010.10(18):p.3210-3221.14.Narayanasamy,A.,etal.,Fucosylatedglycoproteomicapproachtoidentifyacomplementcomponent9associatedwithsquamouscelllungcancer(SQLC).JProteomics,2011.74(12):p.2948-2958.15.Uen,Y.H.,etal.,Comparativeproteomics,networkanalysisandpost-translationalmodificationidentificationrevealdifferentialprofilesofplasmaConA-boundglycoproteinbiomarkersingastriccancer.JProteomics,2013.83:p.197-213.16.Huang,H.L.,etal.,Biomarkerdiscoveryinbreastcancerserumusing2-Ddifferentialgelelectrophoresis/MALDI-TOF/TOFanddatavalidationbyroutineclinicalassays.Electrophoresis,2006.27(8):p.1641-1650.17.Fan,Y.X.,etal.,Discoveryandidentificationofpotentialbiomarkersofpapillarythyroidcarcinoma.MolecularCancer,2009.8(1):p.79.18.Zhang,Z.,etal.,Threebiomarkersidentifiedfromserumproteomicanalysisforthedetectionofearlystageovariancancer.CancerRes,2004.64(16):p.5882-5890.19.Liu,L.,etal.,Reducedtransthyretinexpressioninseraoflungcancer.CancerSci,2007.98(10):p.1617-1624.20.Liu,L.,etal.,Serumlevelsofvariantsoftransthyretindown-regulationincholangiocarcinoma.JCellBiochem,2008.104(3):p.745-755.21.Lorkova,L.,etal.,Decreasedconcentrationsofretinol-bindingprotein4inseraofepithelialovariancancerpatients:apotentialbiomarkeridentifiedbyproteomics.OncolRep,2012.27(2):p.318-324.22.Swallow,C.J.,etal.,alpha2HS-glycoprotein,anantagonistoftransforminggrowthfactorbetainvivo,inhibitsintestinaltumorprogression.CancerResearch,2004.64(18):p.6402-6409.23.Maxwell,F.,etal.,Telomereattritionanddecreasedfetuin-Alevelsindicateacceleratedbiologicalagingandareimplicatedinthepathogenesisofcolorectalcancer.ClinCancerRes,2011.17(17):p.5573-5581.24.Kang,U.B.,etal.,Differentialprofilingofbreastcancerplasmaproteomebyisotope-codedaffinitytaggingmethodrevealsbiotinidaseasabreastcancerbiomarker.BMCCancer,2010.10:p.114.25.Melmer,A.,etal.,PlasmaconcentrationsofthevitaminE-bindingproteinafaminareassociatedwithoverallandprogression-freesurvivalandplatinumsensitivityinserousovariancancer--astudybytheOVCADconsortium.GynecolOncol,2013.128(1):p.38-43.26.Humphries,J.M.,etal.,Identificationandvalidationofnovelcandidateproteinbiomarkersforthedetectionofhumangastriccancer.BiochimBiophysActa,2014.1844(5):p.1051-1058.27.Wil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