本发明属于病毒疫病诊断技术领域，涉及一种中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条。
背景技术：
中华蜜蜂囊状幼虫病是由中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus，CSBV)引起的一种对中蜂危害严重的病毒病。其症状主要见于中蜂幼虫，病毒在幼虫体内大量复制，导致中蜂幼虫很快死亡，虫体皮下渗出液增多，用镊子夹出时呈典型的囊状。中蜂囊状幼虫病发病快、传播广、死亡率高，蜂群患病后轻者影响蜂群的繁殖和采集，重者会造成全场蜂群覆灭。该病目前尚无特效药物治疗，是中蜂现代饲养中迫切需要解决的重大问题。我国于1972年冬首先在广东省佛冈、从化、增城等地发生该病，翌年起迅速蔓延到福建、广西等12个省、区造成近百万群中蜂死亡，目前在我国中蜂养殖区基本都有流行，常造成80%-90%的损失。
中蜂囊状幼虫病病毒属于小RNA病毒科的昆虫类小RNA病毒，直径为28-30nm，沉降系数为154s，基因组是一条正链ssRNA，只有一个大的开放阅读框，翻译出多聚蛋白后剪切成结构蛋白和非结构蛋白。CSBV病毒衣壳由3种结构蛋白vp1、vp2、vp3组成，没有囊膜。
传统的对CSBV的检测主要是症状诊断、电镜观察和血清学检测等方法，而症状诊断不够确切，电镜观察和血清学检测耗时费力，而且需要繁琐的步骤和较高的试验条件，尤其是CSBV标准阳性血清难于获得，极大地限制了该病的临床检测。随着分子生物学的发展，虽然RT-PCR方法能够用于临床上CSBV的检测。但是研究表明不同地区种群的中蜂囊状幼虫病病毒核苷酸序列存在较大差异。这为设计适宜的RT-PCR引物检测不同地理种群中囊病病毒带来了很大的麻烦。但是中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的氨基酸序列高度一致，这为利用免疫学方法鉴定CSBV病毒提供了可能。而且，无论是传统的电镜观察、血清学检测方法还是RT-PCR方法，它们都要求检测者具备较高的实验条件和仪器设备，而这些正是养蜂的农户所不具备的。而基于免疫层析技术的胶体金检测试纸使用起来方便快捷，完全可以满足生产上蜂农对中蜂囊状幼虫病病毒进行检测的需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速检测中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)的免疫胶体金试纸条，采用该试纸条检测中华蜜蜂囊状幼虫病病毒，检测时间短、成本低、结果易判断，实用性强，非常适合中华蜜蜂养蜂生产中使用。
本发明的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条，包括PVC底板，依次固定于 PVC 板上的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，以及位于硝酸纤维素膜上且相互分开的检测线和质控线，其中胶体金垫标记有一种鼠抗CSBV衣壳蛋白vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测线包被另一种鼠抗vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的质控线包被羊抗鼠IgG。
所述中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1、首先对中华蜜蜂囊状幼虫病病毒衣壳蛋白vp3基因（GenBank登录号：KM232613）进行克隆、蛋白表达及纯化，获得外源vp3蛋白。
2、鼠抗vp3单克隆抗体的制备：
（a）小鼠免疫：将等体积的vp3蛋白与福氏佐剂混合乳化后，在小鼠背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，剂量为每只～50μg，以后每间隔3周免疫一次，剂量同第一次，连续免疫2次，第二次免疫加福氏不完全佐剂，第三次免疫不加佐剂，第三次免疫2-3周后通过腹腔注射进行加强免疫，剂量50-500μg，不加佐剂，3天后取脾细胞融合；
（b）细胞融合与单抗筛选：无菌条件下取小鼠脾脏，研碎，过细胞筛，离心，细胞用培养液洗2次，计数 ，取脾淋巴细胞悬液备用；取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次 ，计数，取得1×107个细胞备用；将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，1200rpm离心8min，弃上清；37℃水浴下缓慢加入预热的45% PEG4000，加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，800rpm离心6min； 弃上清，加入HAT选择培养液重悬液，以100µl/每孔的标准加入到事先加有饲养细胞的96孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。7-10天后换用HT培养液，再过2周后，改用一般培养液；当杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，用间接ELISA检测杂交瘤细胞上清液，筛选抗体阳性孔，以有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行单克隆化培养，筛选出分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；腹腔注射0.5ml 降植烷于BALB/c鼠，1-2周后腹腔接种1×106个杂交瘤细胞，7-10天后产生腹水，收集腹水，12000 rpm离心20min后，取上清液即为腹水抗体，-80℃下冻存，用间接ELISA测定腹水单抗效价。
3、制备中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条：
（1）标记vp3单克隆抗体的胶体金垫制备：采用柠檬酸三钠作为还原剂来制备胶体金，对上述步骤（b）中制备的vp3单克隆抗体中的一种进行胶体金标记，先确定单抗与胶体金结合的最佳标记浓度和最适pH值；随后以最适蛋白浓度将鼠抗vp3单克隆抗体在搅拌状态下加入胶体金，并搅拌30min；再加入10%的BSA使其终浓度为1%，搅拌30min后于4℃ 2000rpm条件下离心10min；去除沉淀取上清后再于4℃ 、12000rpm条件离心45min；沉淀用1/10原体积的金标保存液（含1%BSA、2%蔗糖、0.1%Tween-20的PBS溶液）重悬；将制备的胶体金标记抗体按1ml铺15cm2的比例铺在玻璃纤维膜上，室温干燥后，制成胶体金垫；
（2）试纸条组装：将另一种鼠抗vp3单克隆抗体划线于硝酸纤维素膜作为检测线，距离检测线5mm处以羊抗鼠IgG抗体划线作为质控线；将PVC底板的粘面暴露，将准备好的硝酸纤维素膜粘在中间位置，接着粘贴金标垫并使其压在硝酸纤维素膜前端0.2cm处，然后以聚酯纤维膜为样品垫，粘贴样品垫压在金标垫的另一端，最后粘贴吸水纸；将组装好的试纸条剪成0.3-0.4cm宽的窄条状。
本发明的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条具有如下的优点：
（1）操作简便、快速，使用时，只需将试纸条的测试端插入待检样品液中，在5-15min内即可显出条带，根据条带判定检测结果，大大节省了检测时间，提高了工作效率；
（2）结果判定简单明了、准确，当在硝酸纤维素膜上显示两条红色条带，即检测线和质控线时，表示在被检测样品中检出CSBV病毒，结果为阳性；当在硝酸纤维素膜上只显示一条红色的质控线时，表示在被检测样品中未检出CSBV病毒，结果为阴性；
（3）检测方便，不需要昂贵的仪器设备，避免了采用传统PCR检测法、电镜鉴定法等方法所涉及的仪器设备、试剂等较为昂贵的问题；
（4）试纸条稳定性强、易于保存，试纸条可在4℃冰箱长期放置后再使用，而且检测效果良好，有利于蜂农购买后长期使用。
附图说明
图1为本发明中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条的结构示意图；
1、PVC底板，2、样品垫，3、胶体金垫，4、检测线，5、质控线，6、吸水 ，7、硝酸纤维素膜。
具体实施方式
1、材料
感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的中蜂样品由本实验室采集并保存。鼠抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒衣壳蛋白vp3单克隆抗体委托上海文渊阁生物科技有限公司制备，经筛选获得两个不同的杂交瘤细胞株并由本实验室保存。羊抗鼠IgG抗体、柠檬酸三钠、氯金酸(HAuCl4·4H2O)及牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司；硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板、玻璃纤维膜购于上海杰一生物技术有限公司。其它试剂均为国产分析纯试剂。
2、中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条的制备
（1）首先对中华蜜蜂囊状幼虫病病毒衣壳蛋白vp3基因（GenBank登录号：KM232613）进行克隆获得编码区序列，对编码区序列用pET28载体进行原核表达并进行蛋白纯化，获得外源vp3蛋白。
（2）鼠抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒vp3单克隆抗体的制备：
ⅰ. 小鼠免疫：将等体积的vp3蛋白与福氏佐剂混合乳化后，在小鼠背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，剂量为每只～50μg。以后每间隔3周免疫一次，剂量同第一次，连续免疫2次，第二次免疫加福氏不完全佐剂，第三次免疫不加佐剂。第三次免疫2-3周后通过腹腔注射进行加强免疫，剂量50-500μg，不加佐剂；3天后取脾细胞融合。
ⅱ.细胞融合与单抗筛选：无菌条件下取小鼠脾脏，研碎，过细胞筛，离心，细胞用培养液洗2次，计数 ，取脾淋巴细胞悬液备用。取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次 ，计数，取得1×107个细胞备用。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，1200rpm离心8min，弃上清；37℃水浴下缓慢加入预热的45% PEG4000，加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，800rpm离心6min。 弃上清，加入HAT选择培养液重悬液，以100µl/每孔的标准加入到事先加有饲养细胞的96孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。7-10天后换用HT培养液，再过2周后，改用一般培养液。当杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，用间接ELISA检测杂交瘤细胞上清液，筛选抗体阳性孔，以有限稀释法对阳性孔杂交瘤细胞进行单克隆化培养，筛选出分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。腹腔注射0.5ml 降植烷于BALB/c鼠，1-2周后腹腔接种1×106个杂交瘤细胞，7-10天后产生腹水，收集腹水，12000 rpm离心20min后，取上清液即为腹水抗体，-80℃下冻存，用间接ELISA测定腹水单抗效价。
（3）试纸条的制备：
ⅰ. 胶体金的制备：采用柠檬酸三钠作为还原剂来制备胶体金。具体步骤为：将0.01%氯金酸溶液加热至沸腾，不断搅动过程中加入终浓度为1%的柠檬酸三钠，轻轻摇匀，继续煮沸 15min，煮沸过程中胶体金溶液的颜色由蓝变紫，待由紫再变红后使其冷却，并用蒸馏水定容至初始体积。所制备的胶体金粒径为15-40nm 。
ⅱ. vp3单抗与胶体金结合的最佳标记浓度的确定：对上述步骤（2）中制备的vp3单克隆抗体中的一种进行胶体金标记，将vp3单抗作以下梯度稀释：18 μg/ml、24 μg/ml、36 μg/ml、42 μg/ml、54 μg/ml、68 μg/ml。每个浓度各取0.1ml于1ml胶体金溶液之中，并混匀。5min后，向每管加入0.1ml 10%的NaCl溶液，混匀，室温静置2h。观察胶体金溶液颜色的变化，以颜色不发生改变的vp3单抗浓度为准，在此基础上再增加20%即为最佳标记浓度。经测定鼠抗vp3单克隆抗体与胶体金结合的标记浓度范围为38μg/ml-60μg/ml，最佳标记浓度为50.4μg/ml。
ⅲ. vp3单抗与胶体金结合最适PH值的确定: 准备6支EP管，各取胶体金溶液1ml，用0.1mol/L K2CO3 溶液分别调整金溶液的pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.3。按照确定的最佳标记浓度向EP管中分别加入vp3单抗。加入5% BSA至终浓度为1%，室温下再搅拌5-15min。观察胶体金溶液颜色的变化，以颜色不发生改变时的PH值为最适结合PH值。经测定鼠抗vp3单克隆抗体与胶体金结合的最适PH值为8.0。
ⅳ. vp3单抗的胶体金标记: 用0.1mol/L的K2CO3 溶液将胶体金溶液调到最适pH，此时PH的测量应使用精密PH试纸。根据最佳标记浓度，在搅拌状态下加入纯化的vp3单抗，并搅拌30min。再加入10%的BSA使其终浓度为1%，搅拌30min后于4℃ 2000rpm条件下离心10min。去除沉淀取上清后再于4℃ 12000rpm条件离心45min。沉淀用1/10原体积的金标保存液（含1%BSA、2%蔗糖、0.1%Tween-20的PBS溶液）重悬，4℃保存备用。将制备的胶体金标记抗体按1ml铺15cm2的比例铺在玻璃纤维膜上，室温干燥后，制成胶体金垫。
ⅴ.胶体金免疫层析试纸条的组装：
试纸条的结构包括：PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜（上面划有检测线与质控线）及吸水纸，如图1。
具体制作如下：将步骤（2）中制备的另一种鼠抗vp3单克隆抗体划线于硝酸纤维素膜作为检测线，距离检测线5mm处以羊抗鼠IgG抗体划线作为质控线。将PVC底板的粘面暴露，将准备好的硝酸纤维素膜粘在中间位置，接着粘贴金标垫并使其压在硝酸纤维素膜前端0.2cm处，然后以聚酯纤维膜为样品垫，粘贴样品垫压在金标垫的另一端，最后粘贴吸水纸。将组装好的试纸条剪成0.3-0.4cm宽的窄条状。
3、CSBV免疫胶体金检测试纸条的使用步骤
（1）取感病的中华蜜蜂幼虫，置于EP管中，用玻璃棒捣碎，加入1ml的PBS，匀浆，8000rpm离心30min，用吸管吸取上清液即为阳性样品。以健康的中华蜜蜂幼虫为阴性对照组，处理方法与阳性样品相同，再设置PBS为空白组。
（2）将试纸条的样品垫一端浸入样品液中，避免金标垫与样品液直接接触。样品液会因层析作用向硝酸纤维素膜流动，当样品液全部浸湿硝酸纤维素膜后。将试纸条取出平放，5-15min内观察结果。当检测线和质控线都出现清晰可见的红色线，则判定为阳性；只有质控线出现红色线，则为阴性；而若质控线不显现红色，则认定试纸条无效。