一种H7亚型禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种H7亚型禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒。

背景技术：

甲型流感病毒属于正黏病毒科，可以感染禽类、哺乳动物和人类。甲型流感病毒根据血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为不同的亚型。目前已知的有18种不同HA亚型(H1～H18)和11种NA亚型(N1～N11)。

H7亚型的禽流感病毒为高致病性禽流感病毒(HPAIV)，对家禽表现为发病迅速、临床症状严重和高死亡率。一般情况下，禽流感病毒不会突破种间屏障感染人，然而2013年2月H7N9亚型流感病毒在我国首次发生了感染人的事件，并引发了从2013年3月至2016年8月的4次发病高峰。截至2016年11月，实验室确诊H7N9感染病例800例，死亡率约为35％～40％。生物信息学分析显示H7N9流感病毒感染人是通过活禽市场受感染的活禽传播的。同时，虽然之前的研究表明H7N9禽流感病毒感染鸡群后表现为低致病性或者不致病，但是最近的研究显示变异的H7N9禽流感病毒的感染会对鸡致死。H7亚型禽流感病毒不仅影响了人类的生命健康，同时严重影响畜禽养殖业的持续稳定发展。因此，建立一种高灵敏度的H7亚型禽流感病毒的抗体检测方法对鸡群进行血清学监测十分必要，对其诊断具有非常重要意义。

目前H7亚型禽流感病毒抗体的血清学检测方法主要为血凝抑制试验(HI试验)，但是HI试验灵敏度较低，而间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法具有灵敏度高、特异性好等优点。因此，开发一种特异的、敏感的、操作简便的H7亚型禽流感病毒抗体检测试剂盒对鸡只H7亚型流感病毒抗体水平进行实时监测具有重要意义。而以往的禽流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒通常是基于原核表达的HA蛋白的HA1段，这种截短蛋白通常不具备天然构象，没有生物学功能，对检测的灵敏度方面可能有一定欠缺。因此，需要研发一种高灵敏性的H7亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒。

技术实现要素：

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种H7亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒以真核表达的具有生物学功能的全长HA蛋白为抗原，使得其具有高灵敏性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种H7亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒，包含抗体检测板，抗体检测板以H7N9亚型禽流感病毒全长HA蛋白为抗原包被。

优选地，所述H7N9亚型禽流感病毒全长HA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1-3所示。

优选地，所述H7N9亚型禽流感病毒全长HA蛋白的制备，包括以下步骤：

S1、HA蛋白的表达和细胞的收集；

S2、裂解细胞并收集裂解液；

S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析。

优选地，步骤S1包括如下具体步骤：通过Bac-to-Bac系统构建包含H7亚型血凝素基因全长片段的重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养后离心收集沉淀。

优选地，步骤S1中构建重组杆状病毒的方法为：利用RT-PCR技术扩增H7亚型流感病毒血凝素蛋白全长基因序列，获得血凝素基因全长片段；将血凝素基因全长片段插入pFastBac系列载体中，并用热激法转化含有杆状病毒基因组的感受态细胞，使血凝素基因全长片段通过同源重组插入杆状病毒基因组中，获得重组杆状病毒基因组(rBacmid)；将rBacmid转染昆虫细胞，培养后离心收集上清即为重组杆状病毒(rBV)种毒。

优选地，步骤S2具体包括如下步骤：用裂解缓冲液以8毫升每克悬浮细胞沉淀，200rpm搅拌30min，将悬浮液以10000g离心25min，离心后收集上清，即为包含HA蛋白的裂解液；所述裂解缓冲液配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，2％v/v Triton X-100，5％v/v甘油，pH 5.9。

优选地，步骤S3具体包括如下步骤：

S31、层析柱的再生和组装：分别将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱进行再生后，将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱按顺序连接起来；

S32、裂解液上柱：将裂解液以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，上样体积不超过10个柱体积；

S33、柱平衡：将5倍柱体积平衡缓冲液A以1～2ml/min流速过连接的阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱，之后将阴离子交换层析柱和阳离子交换层析柱分离；

S34、洗脱HA蛋白：将2倍柱体积洗脱缓冲液以1～2ml/min流速过阳离子交换层析柱，收集流出液即为纯化的HA蛋白；

所述平衡缓冲液A的配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，0.01％v/v Triton X-100，5％v/v甘油，pH 5.9；

所述平衡缓冲液B的配方为：20mM磷酸三钠，0.05％v/v Triton X-100，5％v/v甘油，pH 7.03；

所述洗脱缓冲液的配方为：20mM磷酸三钠，10～100mM NaCl，0.05％v/v Triton X-100，5％v/v甘油，pH 7.03。

优选地，步骤S33还包含用5倍柱体积平衡缓冲液B以1～2ml/min流速过分离后阳离子交换层析柱的步骤。

优选地，所述H7N9亚型禽流感病毒全长HA蛋白的制备还包含S4浓缩步骤，将纯化的HA蛋白用10倍于洗脱液体积的PBS缓冲液稀释，稀释液通过截留100kDa分子量的超滤膜，浓缩10～100倍，重复一次，浓缩后的血凝素蛋白通过0.22μm的滤膜过滤。

优选地，所述抗体检测板为包被H7N9亚型流感病毒全长HA蛋白的96孔酶标板，所述抗体检测板通过以下方法制备：用pH 9.5，0.05M碳酸盐缓冲液作包被缓冲液，将全长HA蛋白稀释为0.5μg/ml，按100μl/孔加入96孔聚苯乙烯酶标板中，4℃包被过夜，甩干，按200μl/孔加入1×洗涤缓冲液，室温洗涤3min后甩干，洗涤三次，按200μl/孔加入含1％w/v牛血清白蛋白(BSA)的1×洗涤缓冲液，37℃封闭1h，甩干，按200μl/孔加入1×洗涤缓冲液，洗涤三次，每次间隔3min，再加入20％w/v蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h，干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存，即为抗体检测板。

优选地，所述H7亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒还包含酶结合二抗储存液、阳性对照、阴性对照、10×样品稀释缓冲液、50×洗涤缓冲液、显色液A、显色液B和终止液；酶结合二抗储存液为辣根过氧化物酶标记的驴抗鸡IgY抗体，阳性对照为H7N9亚型流感病毒标准阳性鸡血清，阴性对照为标准阴性鸡血清。

优选地，所述50×洗涤缓冲液为0.5M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。使用时需配置为1×洗涤缓冲液，其配置方法为将试剂盒中50×洗涤缓冲液与灭菌去离子水以体积比为1：50稀释后加入0.05％v/v吐温-20。

优选地，所述10×样品稀释缓冲液为含1％w/v BSA、0.5％v/v吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。使用时需配置为1×样品稀释缓冲液，其配置方法为：将试剂盒中10×样品稀释缓冲液与灭菌去离子水以体积比为1：10稀释。

优选地，所述显色液A为1mg/ml四甲基联苯胺(TMB)溶于二甲基亚砜(DMSO)中；显色液B为含0.1‰v/v过氧化氢(H₂O₂)的磷酸-柠檬酸缓冲液，pH 5.0；终止液为2M硫酸溶液。

优选地，所述阳性对照为经H7N9亚型流感病毒灭活疫苗免疫鸡产生的标准阳性血清(OD₄₅₀≥1.0)并按100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素浓度加入青霉素和链霉素，过滤除菌；所述阴性对照为未经免疫或感染的SPF鸡采集的标准阴性血清(OD₄₅₀≤0.15)，同样按100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素浓度加入青霉素和链霉素，过滤除菌。

优选地，所述酶结合二抗储存液购自Proteintech公司，使用时用1×样品稀释缓冲液以1：5000倍稀释。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)特异性强，敏感度高，安全性好。本发明的试剂盒基于昆虫细胞杆状病毒表达系统表达的全长HA蛋白，该蛋白为非流感病毒来源，因此安全性好，经过连续阴-阳离子交换层析纯化方法纯化后杂蛋白含量小于5％，只与H7亚型禽流感病毒阳性血清特异结合，与其他亚型禽流感病毒或其他禽疫病阳性血清无交叉反应。在敏感度方面，本发明的ELISA方法比HI试验高约1000～2000倍。

(2)H7-53WT、H7-HZ13和H7-MCX三种H7HA蛋白作为包被抗原建立的ELISA检测试剂盒中，在最佳包被浓度和最佳稀释度、敏感性上均表现一致，并且具有非常好的敏感性。相较于H7-HZ13和H7-MCX，H7-53WT的特异性和重复性更好。因此H7-53WT更适合作为H7亚型禽流感抗体间接ELISA检测试剂盒的包被抗原。

(3)操作简单，方法快速有效。本发明的试剂盒适合不同层次人群使用，易于大范围推广应用。按照本发明试剂盒检测H7亚型禽流感病毒抗体时，无需另外配置其他试剂，样品无需无菌处理，按照试剂盒说明在1.5～2.5h内即可判定检测结果。

(4)结果判定准确、可靠。本发明的试剂盒根据酶标仪读数判定结果，减少主观性，方法准确可靠。并且以H7-53WT HA蛋白作为包被抗原的ELISA检测试剂盒检测精准性极高。

附图说明

图1是表达和纯化的全长HA蛋白SDS-PAGE鉴定结果。图中1泳道为H7-53WT，2泳道为H7-MCX，3泳道为H7-HZ13。

图2是表达和纯化的全长HA蛋白Western-blot鉴定结果。图中1泳道为H7-53WT，2泳道为H7-MCX，3泳道为H7-HZ13。

图3为全长HA蛋白的血凝实验结果。图中第1行为H7-53WT，第2行为H7-MCX，第3行为H7-HZ13。

图4为以H7-53WT为包被抗原的ELISA检测试剂盒的受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析。横坐标为非特异性，纵坐标为敏感性。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

实施例1

一种H7亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒，包含抗体检测板、酶结合二抗储存液、阳性对照、阴性对照、10×样品稀释缓冲液、50×洗涤缓冲液、显色液A、显色液B和终止液；抗体检测板以基因序列如SEQ ID NO.1所示的H7N9亚型禽流感病毒全长HA蛋白为抗原包被，酶结合二抗储存液为辣根过氧化物酶标记的驴抗鸡IgY抗体，阳性对照为H7N9亚型流感病毒标准阳性鸡血清，阴性对照为标准阴性鸡血清。

优选地，所述抗体检测板为包被H7N9亚型流感病毒全长HA蛋白的96孔酶标板，所述抗体检测板通过以下方法制备：用pH 9.5，0.05M碳酸盐缓冲液作包被缓冲液，将全长HA蛋白稀释为0.5μg/ml，按100μl/孔加入96孔聚苯乙烯酶标板中，4℃包被过夜，甩干，按200μl/孔加入1×洗涤缓冲液，室温洗涤3min后甩干，洗涤三次，按200μl/孔加入含1％w/v牛血清白蛋白(BSA)的1×洗涤缓冲液，37℃封闭1h，甩干，按200μl/孔加入1×洗涤缓冲液，洗涤三次，每次间隔3min，再加入20％w/v蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3h，干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存，即为抗体检测板。

优选地，所述50×洗涤缓冲液为0.5M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。使用时需配置为1×洗涤缓冲液，其配置方法为将试剂盒中50×洗涤缓冲液与灭菌去离子水以体积比为1：50稀释后加入0.05％v/v吐温-20。所述10×样品稀释缓冲液为含1％w/v BSA、0.5％v/v吐温-20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。使用时需配置为1×样品稀释缓冲液，其配置方法为：将试剂盒中10×样品稀释缓冲液与灭菌去离子水以体积比为1：10稀释。所述显色液A为1mg/ml四甲基联苯胺(TMB)溶于二甲基亚砜(DMSO)中；显色液B为含0.1‰v/v过氧化氢(H₂O₂)的磷酸-柠檬酸缓冲液，pH 5.0；终止液为2M硫酸溶液。

优选地，所述阳性对照为经H7N9亚型流感病毒灭活疫苗免疫鸡产生的标准阳性血清(OD₄₅₀≥1.0)并按100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素浓度加入青霉素和链霉素，过滤除菌；所述阴性对照为未经免疫或感染的SPF鸡采集的标准阴性血清(OD₄₅₀≤0.15)，同样按100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素浓度加入青霉素和链霉素，过滤除菌。所述酶结合二抗储存液购自Proteintech公司，使用时用1×样品稀释缓冲液以1：5000倍稀释。

优选地，所述H7N9亚型禽流感病毒全长HA蛋白的制备，包括以下步骤：

S1、血凝素蛋白的表达和细胞的收集。

本实施例中使用的重组杆状病毒为能够表达H7N9亚型流感病毒毒株A/Chicken/Guangdong/53/2014(H7N9)全长HA蛋白(称为H7-53WT)的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)，按照常规方法由本实验室构建并保存。所述A/Chicken/Guangdong/53/2014(H7N9)毒株GenBank登录号为KY221841，属于W2-B分支，其全长HA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本实施例中是利用RT-PCR技术扩增H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白全长基因序列来获得血凝素基因全长片段，也可以根据SEQ ID NO.1所示序列直接人工合成血凝素基因全长片段。

本实施例中重组杆状病毒的具体构建方法为：利用RT-PCR技术扩增H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白全长基因序列，获得血凝素基因全长片段。将血凝素基因全长片段插入载体pFastBac1中，构建pFastBac1-H7-53WT重组表达载体，并用热激法转化大肠杆菌DH10Bac感受态，在DH10Bac中pFastBac1-H7-53WT重组表达载体中含有HA片段的一段序列会与感受态细胞中杆状病毒基因组进行重组，并使HA片段插入杆状病毒基因组，获得重组杆状病毒基因组(rBacmid)中，并将rBacmid用脂质体法转染昆虫细胞Sf9，培养后收集上清获得重组杆状病毒。

将Sf9细胞在Sf900II培养基(购自Thermo Fisher公司)中悬浮培养至细胞浓度为2×10⁶cells/ml时，将重组杆状病毒以感染复数(MOI)为0.5～1接种Sf9细胞。感染的Sf9细胞28℃培养箱中培养60～65h后，3000g离心，收集细胞沉淀。

S2、裂解细胞并收集裂解液。

用裂解缓冲液以8ml/g悬浮细胞沉淀，裂解液中包含2％v/v Triton X-100非离子表面活性剂，可以裂解细胞膜，悬浮液可通过磁力搅拌或者震荡的方式加速细胞膜的裂解，如200rpm搅拌30min，之后将悬浮液以10000g离心25min，离心后收集上清，即为包含HA蛋白的裂解液；所述裂解缓冲液配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，2％v/v TritonX-100，5％v/v甘油，pH 5.9。

S3、裂解液进行连续的阴-阳离子交换层析。所有的层析都在常温下进行。

S31、层析柱的再生和组装：分别将阴离子交换层析柱(简写为Q柱：Macro-Prep Q(Bio-rad)，Vt＝5ml)和阳离子交换层析柱(简写为S柱：Macro-Prep High S(Bio-rad)，Vt＝5ml)进行再生后，将Q柱和S柱按顺序连接起来。Q柱和S柱的再生方法为：首先用5倍柱体积再生缓冲液洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；其次用5倍柱体积灭菌的去离子水洗涤层析柱，流速控制为5ml/min；最后用5倍柱体积平衡缓冲液A平衡层析柱，流速控制为5ml/min；所述再生缓冲液配方为：0.5M NaOH，1M NaCl。

S32、裂解液上柱：将裂解液以1～2ml/min流速过连接的Q柱和S柱，上样体积不超过10个柱体积。

S33、柱平衡：将5倍柱体积平衡缓冲液A以1～2ml/min流速过连接的Q柱和S柱，之后将Q柱和S柱分离；将5倍柱体积平衡缓冲液B以1～2ml/min流速过S柱。

S34、洗脱HA蛋白：将2倍柱体积洗脱缓冲液以1～2ml/min流速过S柱，收集流出液即为纯化的HA蛋白H7-53WT蛋白。

所述平衡缓冲液A的配方为：20mM磷酸三钠，1.0mM EDTA二钠，0.01％v/v Triton X-100，5％v/v甘油，pH 5.9；所述平衡缓冲液B的配方为：20mM磷酸三钠，0.05％v/v Triton X-100，5％v/v甘油，pH 7.03；所述洗脱缓冲液的配方为：20mM磷酸三钠，100mM NaCl，0.05％v/v Triton X-100，5％v/v甘油，pH 7.03。

S4、浓缩。

将纯化的血凝素蛋白用10倍于洗脱液体积的PBS缓冲液稀释，稀释液通过截留100kDa分子量的超滤膜，浓缩10～100倍，重复一次，浓缩后的血凝素蛋白通过0.22μm的滤膜过滤。PBS缓冲液的配方为：8g NaCl，3.58g Na₂HPO₄，0.2g KCl，0.27g KH₂PO₄，定容至1L，调节pH至7.4

纯化的全长HA蛋白用SDS-PAGE、Western-blot实验检测纯化效果，血凝试验检测全长HA蛋白的血凝活性，结果见图1-3。纯化的HA蛋白大约为70kDa，通过个条带灰度扫描HA蛋白纯度可达95％。HA蛋白可以凝集红细胞，2μg HA蛋白血凝效价≥2¹¹。纯化后的HA蛋白具备生物学活性，这就暗示着其具备天然构象。

使用上述试剂盒检测的操作程序为：

1)将50×洗涤缓冲液与灭菌去离子水以体积比为1：50稀释后加入0.05％v/v吐温-20配置为1×洗涤缓冲液；

2)将10×样品稀释缓冲液与灭菌去离子水以体积比为1：10稀释配置为1×样品稀释缓冲液；

3)将待检血清样品或其他样品用1×样品稀释缓冲液作1:200倍稀释，按100μl/孔加入抗体检测板中，同时设只加100μl 1×样品稀释缓冲液作为空白，标准阴性血清作为阴性对照，标准阳性血清做阳性对照，37℃孵育30-60min，甩干；

4)每孔加入200μl 1×洗涤缓冲液，洗涤3次，每次间隔3min，甩干；

5)用1×样品稀释缓冲液以1：5000倍稀释酶结合二抗储存液，配置为二抗工作液；

6)每孔加二抗工作液100μl，空白不加，37℃孵育30～60min，甩干；

7)每孔加入200μl 1×洗涤缓冲液，洗涤3次，每次间隔3min，甩干；

8)以显色液A：显色液B为1:9配置显色液，以100μl/孔加入显色液，37℃避光孵育10min；

9)迅速加入50μl/孔终止液，用酶标仪在450nm波长下读取每孔吸光值(OD₄₅₀值)；

本发明检测样品的判定标准为：以被测样品OD₄₅₀值大于0.2685判定为阳性，小于或等于0.2685判定为阴性。如果阳性对照无明显显色反应，或阴性对照出现显色反应，说明试剂盒失效或者操作有误，需重新检测。

实施例2

本实施例中的H7亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒与实施例1基本相同，但其抗体检测板以H7N9亚型禽流感病毒毒株A/Chicken/Guangdong/MCX/2014(H7N9)全长HA蛋白(H7-MCX)包被。A/Chicken/Guangdong/MCX/2014(H7N9)毒株GenBank登录号为KY221844，属于W2-A分支，其全长HA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

。本发明的其他内容与实施例1相同。

实施例3

本实施例中的H7亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测试剂盒与实施例1基本相同，但其抗体检测板以H7N9亚型禽流感病毒毒株A/Hangzhou/1/2013(H7N9)全长HA蛋白(H7-HZ13)包被。A/Hangzhou/1/2013(H7N9)毒株GenBank登录号为KC853766.1，属于W1分支，其全长HA蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。本实施例中是根据SEQ ID NO.3所示序列直接人工合成血凝素基因全长片段。本发明的其他内容与实施例1相同。

效果实施例1、试剂盒的特异性

为检测本发明试剂盒的特异性，分别以不同分支H7N9毒株HA蛋白H7-53WT、H7-MCX和H7-HZ13蛋白作为包被抗原，通过本发明试剂盒方法分别检测其与H1N1、H5N1、H7N9、H9N2亚型流感病毒阳性血清、新城疫病毒(NDV)和禽传染性支气管炎病毒(IBV)SPF鸡阳性血清的反应情况，测定OD₄₅₀值，并根据本检测试剂盒的判定标准对结果进行判定，结果如表1。

表1、三种H7HA蛋白作为ELISA包被抗原的特异性检测结果

由表1结果可知，以H7-53WT和H7-MCX蛋白作为包被抗原的试剂盒仅能与H7N9亚型流感病毒阳性血清抗体反应，而不能与H1N1、H5N1、H9N2亚型流感病毒、新城疫病毒和禽传染性支气管炎病毒抗体反应，具有良好的特异性；而H7-HZ13蛋白作为包被抗原不仅能与H7N9亚型流感病毒阳性血清抗体反应，还能与H1N1和H5N1亚型流感病毒阳性血清抗体反应，因此特异性稍差。

效果实施例2、试剂盒的灵敏性

为检测本发明试剂盒的灵敏性，分别以H7-53WT、H7-HZ13和H7-MCX作为包被抗原，取3份H7N9阳性血清进行梯度稀释，梯度稀释的血清分别用本发明试剂盒进行检测，以OD₄₅₀>0.2685的最大血清稀释度为ELISA滴度；同时检测各份血清的血凝抑制试验滴度(HI滴度)。结果如表2。

表2、三种H7HA蛋白作为ELISA包被抗原的灵敏性检测结果

由表2可知，H7-53WT、H7-HZ13和H7-MCX作为包被抗原的ELISA方法均比HI试验灵敏度高1424～2136倍，说明本发明试剂盒的灵敏度高。

效果实施例3、试剂盒的重复性

为检测本发明试剂盒的重复性，采用本发明试剂盒所建立的ELISA方法，取H7N9阳性血清和阴性血清各3份，对三个不同时间制备的H7-53WT、H7-HZ13和H7-MCX进行3次检测，计算批内、批间变异系数。结果如表3～4所示。

表3、三种H7HA蛋白作为ELISA包被抗原的批内重复性检测结果

表4、三种H7HA蛋白作为ELISA包被抗原的批间重复性检测结果

由表3和表4可知，仅H7-53WT批间、批内变异系数均小于等于10％，重复性良好，而H7-HZ13、H7-MCX均有个别组批间或批内变异系数大于10％，说明重复性稍差。

综上，H7-53WT、H7-HZ13和H7-MCX三种H7HA蛋白作为包被抗原建立的ELISA检测试剂盒中，在最佳包被浓度和最佳稀释度、敏感性上均表现一致，并且具有非常好的敏感性。但是H7-HZ13特异性稍差，H7-HZ13和H7-MCX重复性稍差，而H7-53WT具备良好的特异性和重复性。因此H7-53WT更适合作为H7亚型禽流感抗体间接ELISA检测试剂盒的包被抗原。

效果实施例4、试剂盒的精准性

由于以H7-53WT蛋白作为包被抗原建立的ELISA检测试剂盒具有更好的特异性和重复性，因此对以H7-53WT蛋白作为包被抗原的ELISA检测试剂盒对44份H7亚型禽流感病毒阴性鸡血清和90份H7亚型禽流感病毒高免阳性鸡血清进行检测，并进行受试者工作特征曲线(ROC曲线分析)，结果如图4。结果显示线下面积(AUC)为1.0，说明以H7-53WT HA蛋白作为包被抗原的ELISA检测试剂盒对具有极高的检测精准性。并且在截断值为0.2685时，其特异性为100％，敏感性为100％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

<110>中山大学

<120>一种H7亚型禽流感病毒血凝素抗体间接ELISA检测试剂盒

<160>3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

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<210>2

<211> 1683

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<213>人工合成

<400>2

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