本发明涉及生物
技术领域：
，具体地指一种高灵敏度胶体金试纸及其制备方法与应用。
背景技术：
：胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。为了提高胶体金检测的灵敏度，研究者采用了各种各样的方法，其中就包括了生物素－亲合素系统(Biotin-Avidin—System，BAS)，它是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。现有技术公开了一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条，采用了生物素标记的金纳米颗粒以及链霉亲和素和甲流抗体标记的金纳米颗粒作为增强探针，进行信号放大，提高了检测甲流抗原的灵敏度。但是该方法在实际操作中可能存在假阳性问题，原因在于其链霉亲和素-金-抗体结合物的制备过程为将抗体与亲和素直接加入到胶体金溶液中进行标记，此标记过程将两种物质同时加入到胶体金进行标记存在一定的技术漏洞，因为不同的物质标记条件是存在一定差异的，该方法的标记方法会产生亲和素-金、抗体-金以及亲和素-金-抗体三种物质，且由于采用的是同一标记条件，因此存在上述标记物中的复合物不稳定，在试纸保存或使用过程中容易出现标记物与金颗粒脱落的情况，从而导致试纸中存在游离的胶体金颗粒，游离的胶体金在检测中会与试纸条NC膜上的检测抗体直接发生反应，因此存在假阳性风险。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述生物素-亲合素系统用于胶体金检测试纸中可能存在的假阳性问题，提供了一种高灵敏度，低假阳性率的高灵敏度胶体金试纸及其制备方法与应用。为实现上述目的，本发明所提供的高灵敏度胶体金试纸，包括底板、样本垫、结合物垫、NC膜、吸收垫，所述结合物垫为含有金标生物素化抗体的结合物垫；所述样本垫为含有亲和素的样本垫。上述技术方案中，所述样本垫是经过添加有亲和素的样本垫处理液处理所得。上述技术方案中，所述样本垫处理液中亲和素含量为1～3μg/ml。上述技术方案中，所述样本垫、结合物垫、NC膜和吸收垫依次相互搭接地贴在底板上。本发明还提供了上述高灵敏度胶体金试纸的制备方法，包括如下步骤：(1)胶体金溶液的制备；(2)抗体通过前预处理去除杂质、调整其pH值；(3)将抗体的生物素化得到生物素化抗体；(4)利用胶体金溶液标记生物素化抗体得到金标生物素化抗体；(5)将金标生物素化抗体添加至结合物垫中；(6)将亲和素添加至样本垫中；(7)在NC膜上包被检测线和质控线；(8)将结合物垫、样本垫、NC膜及其他制作试纸的组件组装、切条制得高灵敏度胶体金试纸。值得说明的是，上述制备步骤并不是唯一的，在不影响最终成品的基本原则上，可以调整顺序，如将步骤(6)作为第一步，为本领域技术人员常用手段，不作为本发明的限制。上述制备方法中，所述胶体金标记生物素化抗体的过程为：调节胶体金溶液的pH值，然后加入生物素化抗体，缓慢混匀、静置充分反应，加入封闭剂封闭多余的位点，反应并离心后，弃上清，沉淀用金标工作液复溶，制得金标生物素化抗体溶液，4℃避光保存备用。上述制备方法中，所述步骤(6)中的亲和素为链霉亲和素。上述制备方法中，所述样本垫是经过含有亲和素的样本垫处理液处理所得；所述样本垫处理液中链霉亲和素的含量为1～3μg/ml。本发明还提供了上述高灵敏度胶体金试纸的制备方法在制备生物素-亲和素胶体金检测试剂、生物素-亲和素胶体金检测试剂盒、胶体金免疫层析试剂中的应用。本发明中生物素化抗体标记条件温和且不会影响抗体的活性，生物素化的抗体稳定，可存放多年而不失活性。因此生物素化抗体的稳定性能避免了因标记条件不合适而引起标记复合物的金颗粒脱落，从而避免出现假阳以及试纸条不稳定等问题。本发明的有益效果：所提供的高灵敏度胶体金试纸适用于各种抗体/抗原的检测，灵敏度高，假阳性率低，相对于传统的胶体金试纸，其检测灵敏度提高了100倍，且制备方法简单，实用性好，具有较好的市场前景。附图说明图1为利用高灵敏度胶体金试纸与普通胶体金试纸分别检测不同浓度质控品的效果比较图。具体实施方式以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细描述。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1高灵敏度胶体金试纸的制备1.胶体金溶液的制备准确量取1000mL纯化水，煮沸后快速加入10mL氯化金溶液；待溶液再次沸腾后，迅速加入10mL的胶体金还原剂，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变成黑色再变成紫色，最后成稳定的酒红色后，计时继续煮沸10min，停止加热，待溶液冷却至室温后，加入纯化水补充至1000mL。2.抗体生物素化前预处理把透析袋剪成10～20cm的小段；在500mL的2％NaHCO3和1mMEDTA·2Na(pH8.0)中将透析袋煮沸10min；用蒸馏水彻底清洗；将透析袋放在500mL的1mMEDTA·2Na(pH8.0)中煮沸10min；冷却后，将透析袋置于蒸馏水中，4℃保存备用。取5mg待生物素化抗体用碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)稀释到1mg/ml，用0.1M的碳酸氢钠缓冲液对抗体充分透析。透析处理完毕的抗体4℃保存备用。3.抗体的生物素化用1mlDMSO溶解NHSB1mg；向1ml待生物素化抗体(即含抗体1mg)加入120μlNHSB(NHSB为N-羟基琥珀酰亚胺生物素)溶液(即含NHSB120μg)；在室温下持续搅拌，保温4小时；加入9.6μl1mol/LNH4Cl(每25μgNHSB加1μl)，在室温下搅拌10分钟；在4℃，用PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，蛋白质在1～3ml之间洗下；最后，样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/LBSA。将结合产物置4℃，避光保存，亦可加入50％重蒸甘油，置-20℃保存。4.生物素化抗体的金标记取10ml烧制好的胶体金溶液，加入0.1M的K2CO3溶液，加入比例为3～5μl/ml，缓慢混匀，静置5分钟；加入生物素化抗体，加入量为10μg/ml，缓慢混匀，静置15分钟；以10μl/ml的量加入封闭剂，缓慢混匀，静置15分钟；7500rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用金标工作液复溶至100ml，制得金标生物素化抗体溶液，4℃避光保存备用。5.结合物垫的制备将结合物垫裁剪为6×300mm大小，完全浸泡于结合物垫处理液中3分钟后取出，沥干多余水分，温度37℃、湿度不高于30％干燥8小时，密封室温保存。将制得的金标生物素化抗体溶液2ml，按每张600μl金标生物素化抗体溶液均匀涂布预处理好的结合物垫，以温度37℃、湿度不高于30％干燥8小时，密封室温保存。6.样本垫预处理将样本垫裁剪为300×300mm大小，完全浸泡于含有链霉亲和素的样本垫处理液中3分钟后取出，沥干多余水分，温度37℃、湿度不高于30％干燥8小时，密封室温保存。本实施例的样本垫处理液中链霉亲和素含量为1μg/ml，经验证样本垫处理液中链霉亲和素含量较佳范围为1～3μg/ml。7.点膜用10mmol/L的PBS溶液稀释捕获抗体至1.0mg/ml，加入连续划膜机的1号杯；用10mmol/L的PBS溶液稀释羊抗鼠多克隆抗体至1mg/ml，加入连续划膜机的2号杯。调试连续划膜机，包被检测线与质控线；包被后的NC膜以温度37℃、湿度不高于30％干燥8小时，密封室温保存。8.试纸板的组装(环境要求：温度20～28度，湿度：≤30％)按照由下至上：样本垫、结合物垫、NC膜、吸收垫、塑料板(底板)的顺序进行组装。结合物垫和样本垫的重叠长度0.5～2mm，结合物垫和NC膜的重叠长度0.5～2mm，吸收垫和NC膜的重叠长度0.5～2mm。样本垫和吸收垫与胶板的上下边沿对齐。9.切条(环境要求：温度20～28度，湿度：≤30％)将组装好的试纸板放入切条机，按试纸宽度4mm，速度100次/分钟进行切条，得到高灵敏度胶体金试纸。铝箔袋密封，室温存放备用。二、高灵敏度胶体金试纸的灵敏度试验1.高灵敏度胶体金试纸的检测检测方法：用磷酸盐缓冲液稀释将待检质控品(CPV抗原)进行10倍系列稀释。然后分别检测高灵敏度胶体金试纸及普通胶体金试纸。并采用目测及胶体金读数仪读取检测线灰度值两种方式记录检测结果。2.试验结果目测结果如图1所示，试纸分为A、B两组，其中A组为高灵敏度胶体金试纸，B组为普通胶体金试纸。质控品稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。图1显示A组灵敏度显著高于B组。胶体金读数仪结果见表1。表1.使用胶体金读数仪分别读取A、B两组试纸的检测结果稀释倍数10-110-210-310-410-510-610-7阴性A组887584325158803300B组35519198410000表1显示A、B两组不同浓度质控品的检测读数结果显示A组(高灵敏度胶体金试纸)可以检测到10-6(读数为33)，B组(普通胶体金试纸)可以检测到10-4(读数为41)；以及根据分析其他不同浓度质控品的检测读数，表明A组(高灵敏度胶体金试纸)的检测灵敏度约为B组(普通胶体金试纸)的100倍。上述实验结果表明生物素亲和素体系应用于胶体金免疫层析中可以显著提高试纸的检测灵敏度。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3