本发明涉及一种野葛柱头可授性的测定方法。
背景技术：
野葛是豆科蝶形花亚科多年生藤本落叶植物，又名干葛、葛藤等，素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美称，它是国家卫生部批准的药食同源植物，野葛药用具有生津止渴、解肌退热、通经活络、升阳止渴、解酒毒等功效，食用可以做成葛根饮料、葛根保健口服液、葛根保健凉粉等产品，具有很高的药用价值和营养价值，是重要的地区经济作物。迄今为止国内对野葛已有很多研究，但主要集中在药理药效、生态表型等方面，而对其花的繁育特性等方面的研究相对较少。
系统地了解植物花的繁育特性，比如：柱头可授性，是研究植物生活史的前提，也是开展相关研究的基础。研究植物花的繁育特性对于深入了解植物繁殖生物学特性以及植物物种的形成具有重要意义。
植物柱头可授性的检测是植物繁育特性中的一个重要环节，在进行野葛杂交授粉或者人工辅助授粉过程中，通常需要进行柱头可授性的测定。现有技术中比较常用的柱头可授性测定方法是联苯胺-过氧化氢法，其原理是过氧化氢在过氧化氢酶作用下产生强氧化性的氧原子将联苯胺氧化变色并伴有气泡产生，有活力的柱头在滴加该测试溶液后会迅速变色并有气泡产生，无活力的则不会变色且没有气泡产生，根据颜色的变化与气泡的多少可以判断柱头可授性是强还是弱。但该法有一些缺陷和不足，由于结果是目测观察，会产生视觉偏差和记数偏差，不同开花时期，柱头可授性的强弱也不一样，加之联苯胺在低温水里的溶解度较低，这些因素都会影响结果的准确性。因此，使用联苯胺-过氧化氢法测定柱头的可授性，会造成实验偏差，实验结果重复性不好，进而影响结果准确性。设法降低消除上述偏差，找到一种利于测定野葛柱头可授性且实验结果重复性好的方法是本发明要解决的任务。到目前为止，关于野葛柱头可授性的测定方法还未见报道。
技术实现要素：
本发明要解决的问题是提供一种野葛柱头可授性的测定方法。
本发明一种野葛柱头可授性的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：
a.制备反应液：将mtt和70.0％-90.0％的混合溶液按1:19比例制成反应液或将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4:11:22比例制成联苯胺-过氧化氢反应液；将150-200微升的反应液转移到0.5毫升离心管中，备用；所述的70.0％-90.0％混合溶液为：浓度为70.0％-90.0％的二甲基亚砜(dmso)或异丙醇或乙醇；所述的mtt为：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；
b.野葛柱头的准备：距柱头1.0-2.0厘米切断野葛柱头，备用；
c.吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色，采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
d.柱头可授性a值的计算：按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，同时比较实验结果重复性的好坏；式中b1-b6表示实验重复六次每一次得到的吸光值，b表示六次吸光值b1+b2+b3+b4+b5+b6得到的总和。
本发明一种野葛柱头可授性的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：a.制备反应液：将mtt和70.0％-90.0％的混合溶液按1:19比例制成反应液或将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4:11:22比例制成联苯胺-过氧化氢反应液；根据柱头的大小将150-200微升的反应液转移到0.5毫升离心管中，备用；所述的70.0％-90.0％混合溶液为：浓度为70.0％-90.0％的二甲基亚砜(dmso)或异丙醇或乙醇；所述的mtt为：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；
b.野葛柱头的准备：采集不同时期的野葛花，在将要准备测定柱头可授性时，距柱头1.0-2.0厘米处切断野葛柱头备用，以保证实验材料的新鲜度和活力度；
c.吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色，采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
d.柱头可授性a值的计算：
按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，同时比较实验结果重复性的好坏；式中b1-b6表示实验重复六次每一次得到的吸光值，b表示六次吸光值b1+b2+b3+b4+b5+b6得到的总和。
柱头可授性是衡量植物繁育特性的主要标志，在进行野葛杂交授粉或者人工辅助授粉过程中，鉴定其柱头可授性能够减少不必要的损失。
本发明一种野葛柱头可授性的测定方法空白对照试验：在试验过程中，对吸光值a的范围进行量化，柱头没有可授性，取值为0，为最小值；另外，我们将甲瓒和85％的乙醇按1:19比例制成对照液，在650纳米波长下测定其吸光值，重复六次，吸光值a分别为6.108，5.879，6.016，5.792，5.875，6.057，得平均值a为5.955，取整数6，为最大值。最终得出吸光值a量化范围：0≤a≤6，a等于零或接近于零时，表示柱头可授性为零或很弱，a等于6或接近于6时，表示柱头可授性很强。
本发明一种野葛柱头可授性的测定方法柱头可授性a值的计算：
按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，0≤a≤6，a等于零或接近于零时，表示柱头可授性为零或很弱，a等于6或接近于6时，表示柱头可授性很强；同时比较实验结果重复性的好坏。式中b1-b6表示实验重复六次每一次得到的吸光值，b表示六次吸光值b1+b2+b3+b4+b5+b6得到的总和。
本发明一种野葛柱头可授性的测定方法具有如下有益效果：
1、采用本发明的野葛柱头可授性的测定方法，只需6分钟即可得到结果，一定程度上缩短了实验时间，该方法操作简单，更适用于实际的生产应用。
2、本发明的野葛柱头可授性的测定方法中，反应液的配制简单易操作，可以解决联苯胺-过氧化氢法出现的实验偏差问题，结果更准确，相比其它人工、酶检测试纸，成本也较低；
3、采用本发明的野葛柱头可授性的测定方法，可以实时观察，提前检测柱头可授性，避免直接人工授粉后由于野葛柱头可授性的不足而造成的经济损失。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：本发明一种野葛柱头可授性的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：a.制备反应液：将mtt和70.0％-90.0％的混合溶液按1:19比例制成反应液或将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4:11:22比例制成联苯胺-过氧化氢反应液；根据柱头的大小将150-200微升的反应液转移到0.5毫升离心管中，备用；所述的70.0％-90.0％混合溶液为：浓度为70.0％-90.0％的二甲基亚砜(dmso)或异丙醇或乙醇；所述的mtt为：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；
b.野葛柱头的准备：采集不同时期的野葛花，在将要准备测定柱头可授性时，距柱头1.0-2.0厘米处切断野葛柱头备用，以保证实验材料的新鲜度和活力度；
c.吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色，采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
d.柱头可授性a值的计算：
按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，同时比较实验结果重复性的好坏；式中b1-b6表示实验重复六次每一次得到的吸光值，b表示六次吸光值b1+b2+b3+b4+b5+b6得到的总和。
本发明一种野葛柱头可授性的测定方法空白对照试验：在试验过程中，对吸光值a的范围进行量化，柱头没有可授性，取值为0，为最小值；另外，我们将甲瓒和85％的乙醇按1:19比例制成对照液，在650纳米波长下测定其吸光值，重复六次，吸光值a分别为6.108，5.879，6.016，5.792，5.875，6.057，得平均值a为5.955，取整数6，为最大值。最终得出吸光值a量化范围：0≤a≤6，a等于零或接近于零时，表示柱头可授性为零或很弱，a等于6或接近于6时，表示柱头可授性很强。
本发明一种野葛柱头可授性的测定方法柱头可授性a值的计算：
按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，0≤a≤6，a等于零或接近于零时，表示柱头可授性为零或很弱，a等于6或接近于6时，表示柱头可授性很强；同时比较实验结果重复性的好坏。式中b1-b6表示实验重复六次每一次得到的吸光值，b表示六次吸光值b1+b2+b3+b4+b5+b6得到的总和。
实施例2：一种野葛柱头可授性的测定方法，包括以下步骤：
(1)制备反应液：将mtt和85.0％的dmso按1:19比例制成反应液，按200微升/支将反应液转移到六个0.5毫升离心管中，备用。
(2)野葛柱头的准备：采集开花后5小时的野葛花，在要准备测定柱头可授性时，距柱头1.0-2.0厘米处切断野葛柱头，备用；
(3)吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色。采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
(4)柱头可授性a值的计算：六次重复实验得到的吸光值分别为：3.875，3.902，3.865，3.792，3.913，3.859；按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，得出柱头可授性a值为3.868。结果可以看出六次重复实验得到的吸光值数值比较接近，实验重复性好。
实施例3：一种野葛柱头可授性的测定方法，包括以下步骤：
(1)制备反应液：将mtt和90.0％的乙醇按1:19比例制成反应液，按180微升/支将反应液转移到六个0.5毫升离心管中，备用。
(2)野葛柱头的准备：采集开花后3小时的野葛花，在要准备测定柱头可授性时，距柱头1.0-2.0厘米处切断野葛柱头，备用；
(3)吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色。采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
(4)柱头可授性a值的计算：六次重复试验得到的吸光值分别为：3.726，3.589，3.691，3.773，3.802，3.562；按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，得出柱头可授性a值为3.691。结果可以看出六次重复实验得到的吸光值数值比较接近，实验重复性好。
实施例4：一种野葛柱头可授性的测定方法，包括以下步骤：
(1)制备反应液：将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4:11:22比例制成联苯胺-过氧化氢反应液；按200微升/支将反应液转移到六个0.5毫升离心管中，备用。
(2)野葛柱头的准备：采集开花后5小时的野葛花，在要准备测定柱头可授性时，距柱头1.0-2.0厘米处切断野葛柱头，备用；
(3)吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色。采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
(4)柱头可授性a值的计算：六次重复试验得到的吸光值分别为：3.591，3.056，2.972，1.981，3.769，2.539；按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，得出柱头可授性a值为2.985。结果可以看出六次重复实验得到的吸光值数值差异较大，实验重复性不好。
实施例5：一种野葛柱头可授性的测定方法，包括以下步骤：
(1)制备反应液：将mtt和75.0％的异丙醇按1:19比例制成反应液，按200微升/支将反应液转移到六个0.5毫升离心管中，备用。
(2)野葛柱头的准备：采集开花后8小时的野葛花，在要准备测定柱头可授性时，距柱头1.0-2.0厘米处切断野葛柱头，备用；
(3)吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色。采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
(4)柱头可授性a值的计算：六次重复试验得到的吸光值分别为：3.452，3.379，3.611，3.603，3.397，3.562；按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，得出柱头可授性a值为3.501，结果可以看出六次重复实验得到的吸光值数值比较接近，实验重复性好。
实施例6：一种野葛柱头可授性的测定方法，包括以下步骤：
(1)制备反应液：将mtt和70.0％的乙醇按1:19比例制成反应液，按150微升/支将反应液转移到六个0.5毫升离心管中，备用。
(2)野葛柱头的准备：采集开花后24小时的野葛花，在要准备测定柱头可授性时，距柱头1.0-2.0厘米处切断野葛柱头，备用；
(3)吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色。采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
(4)柱头可授性a值的计算：六次重复试验得到的吸光值分别为：0.673，0.815，0.762，0.901，0.659，0.793；按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，得出柱头可授性a值为0.767，结果可以看出，虽然吸光值较低，但是六次重复实验得到的数值比较接近，实验重复性好。
验证试验
为了验证本发明野葛柱头可授性的测定方法的效果，设计以下试验进行验证。
试验例1：不同取样时间里不同反应液配方对野葛柱头可授性测定的影响。试验步骤如下：
1、制备反应液：将mtt和70.0％-90.0％的dmso，异丙醇或乙醇按1:19比例制成反应液或将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4:11:22比例制成联苯胺-过氧化氢反应液；按200微升/支将反应液转移到0.5毫升离心管中，备用。
2、野葛柱头的准备：采集开花后3小时、开花后5小时、开花后8小时、开花后24小时和开花后48小时的野葛花，在要准备测定柱头可授性时，距柱头1.0-2.0厘米处切断野葛柱头，备用；
3、吸光值a的测定：将切断的野葛柱头按柱头朝下，倒置放入离心管中，柱头在反应液中浸渍6分钟后，反应液显示出颜色。采用紫外分光光度计对反应液在650纳米波长下进行检测得吸光值a；
4、柱头可授性a值的计算：按照公式：a＝(b1+b2+b3+b4+b5+b6)/6＝b/6计算，比较试验重复性的好坏。
具体取样时间参数，反应液参数，六次重复吸光值数值b1-b6，可授性结果a值和重复性好坏如表1所示。
表1野葛柱头可授性测定对比试验
从表1中可以看出，野葛柱头在不同开花时期和不同反应液里的可授性结果有较大差异，从开花后的3小时到8小时内，野葛柱头的可授性较高，其中在5小时时最高，开花后24小时，野葛柱头的可授性明显降低，在开花后48小时，野葛柱头的可授性为零。同时可以看出，在5个取样时间里测得的野葛柱头可授性a值均高于传统的联苯胺-过氧化氢法测定的结果，且试验结果重复性也较好。总之，从整体趋势上比较来看，本发明方法和传统的联苯胺-过氧化氢法测定所得的可授性结果比较一致，均是在开花后3小时到8小时内，野葛柱头的可授性高，开花后24小时和48小时，野葛柱头的可授性明显降低甚至为零，但是，本发明方法和传统的联苯胺-过氧化氢法相比，本发明方法操作简便，快速，测定结果准确，重复性好，是一种适合野葛柱头可授性的测定方法。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。