一种鳞翅目幼虫中肠的快速获取方法与流程

本发明涉及昆虫解剖学技术领域，尤其涉及一种鳞翅目幼虫中肠的快速获取的方法。

背景技术：

随着化学农药的长期广泛使用，许多害虫也随之产生了不同程度的抗药性。害虫抗药性的升高，既导致农业生产成本的增加，同时又对环境及公众健康产生巨大影响。

昆虫中肠是分泌消化酶，消化食物和吸收养分的主要部位。一般昆虫的中肠呈管状，前端紧接前胃，后端以马氏管着生处与后肠分界。其结构自内向外分别为：围食膜，肠壁细胞层，底膜，环肌，纵肌和围膜。围食膜由中肠壁细胞分泌形成多层重叠的管状膜，或由中肠前端特殊的细胞分泌出黏液，通过食道內褶与中肠之间环状裂缝的挤压，形成单层管状膜。围食膜的作用是保护肠壁细胞，它包围食物，保护肠壁细胞不被坚硬，尖锐的固体颗粒擦伤或微生物的损害，围食膜对蛋白质分子具有渗透性，消化酶类和消化产物很容易透过围食膜。肠壁细胞有柱状细胞、杯状细胞、再生细胞和内分泌细胞。具有分泌消化酶吸收消化产物，调节血淋巴中钾离子浓度，更新细胞等功能。

由于昆虫中肠具有以上的功能，因此，研究害虫抗药性便集中在研究害虫中肠结构，解毒酶系及功能上。其中重点研究的解毒酶分为3类：p450氧化酶系(p450s)、非专一性酯酶系(ests)、谷胱甘肽-s-转移酶(gsts)。近年来，转bt基因作物的大量种植，能够较好控制鳞翅目害虫的危害，但长期广泛地种植转bt基因作物，害虫在持续的选择压力下，势必会造成鳞翅目害虫抗性的增长。害虫对bt毒素的抗药性机理的研究也一直是热门问题。

了解昆虫中肠的结构，研究中肠酶及其他分泌物的种类和功能，探讨农药、毒素及病原微生物与中肠内部酶类，组织结构的关系和作用方式，能够更好的处理昆虫抗药性的问题，控制害虫的危害，为作物生产安全以及公众健康提供良好的保障。

传统的鳞翅目幼虫中肠解剖方法，是将幼虫两端固定，利用手术剪将幼虫从腹面剪开，固定剪开的表皮后，再将中肠剪开，清除食物残渣并清洗中肠，之后将昆虫中肠剪下放入无菌ep管中。此方法操作相对繁琐，解剖效率低，且只适用于虫龄和体型相对较大的幼虫(4-5龄幼虫)。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足，本发明提供一种适用于三龄以上鳞翅目幼虫的中肠快速获取方法。

在对鳞翅目幼虫解剖中肠位置及结构组成进行观察后，从第三腹节到第六腹节直接剪下，将中肠及其包裹的内含物与表皮分开，之后在预冷的生理盐水中将围食膜包裹的内含物取出，冲洗完之后放入ep管中。此方法方便，快捷，可快速获得幼虫中肠组织，解剖效率高，适用三龄及以上鳞翅目昆虫幼虫。

因此，本发明提供一种鳞翅目幼虫中肠的快速获取方法，将无生命体征的鳞翅目昆虫的第三腹节到第六腹节之间的组织剪下，将中肠从剪下的腹节中拉出，取出中肠置于生理盐水中，将围食膜包裹的食物残渣与中肠分离，洗净，即得。

本发明方法还包括将洗净后的中肠吸干水分，液氮速冻后，低温保存。

所述低温为-80℃。保存以备后续实验使用。

本发明方法整个操作在无菌条件下进行。

本发明方法中，所述生理盐水浓度为0.7％。为高压灭菌后的生理盐水。

所述鳞翅目幼虫为三龄及以上的鳞翅目幼虫。

所述鳞翅目幼虫包括棉铃虫，甜菜夜蛾，斜纹夜蛾，烟青虫。

本发明提供了上述方法在昆虫抗药性研究中的应用。

本发明提供了上述方法在昆虫对转bt基因植物抗性研究中的应用。

附图说明

图1为鳞翅目幼虫第三腹节至第六腹节示意图。

图2为将中肠从剪下腹节中取出示意图。

图3为将围食膜包裹的食物残渣与中肠分离的操作示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

以解剖棉铃虫获取中肠为例。选取5龄中期棉铃虫。解剖前先将解剖工具用75％无水乙醇消毒处理，整个操作过程均为无菌状态，且器具使用前均作无菌处理。具体实施步骤如下：

将无生命体征的棉铃虫置于无菌操作台面，用手术剪将第三腹节与第六腹节之间剪下。如图1。小心地将中肠从剪下的腹节中拉出。如图2。将拉出的中肠放置于预冷的生理盐水(0.7％)中，将围食膜包裹食物残渣与中肠分离，并冲洗干净。如图3。将解剖获得的中肠组织置于滤纸上吸干水分，迅速放入无菌的ep管中，用液氮速冻后，置于-80℃保存。供后续试验使用。

实施例2

以解剖5龄中期棉铃虫中肠为例，分别比较本方法获得的中肠以及

本技术：
背景技术提及的传统解剖方法获取的中肠总蛋白酶、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、羧酸脂酶(cares)活力。每5头幼虫为一组，重复三次。将1.2ml0.1mol/lph7.6的磷酸缓冲液加入上述两种不同方法获得的中肠，在冰浴状态下匀浆。匀浆液在12000g、4℃离心15min，取上清液作待测粗酶液。谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、羧酸脂酶(cares)、中肠总蛋白酶活力测定方法参照相关文献。结果如下表1所示。

表1

结果表明，两种棉铃虫中肠获取方法获得的中肠总蛋白酶活性无显著性差异，表明本方法获取的中肠与传统方法获取的中肠相比，不影响其生物学状态。谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、羧酸脂酶(cares)两种解毒酶活性同样无显著性差异，表明本中肠获取方法不影响两种解毒酶活性，并适用于后续的抗药性研究。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：

技术总结
本发明提供了一种鳞翅目幼虫中肠的快速获取方法，属于昆虫解剖学技术领域。本发明是将已无生命体征的鳞翅目昆虫的第三腹节到第六腹节之间剪下，将中肠从剪下的腹节中拉出，取出中肠置于生理盐水中，将围食膜包裹的食物残渣与中肠分离，洗净，即得。本发明方法能够得到完整的中肠组织，整个操作过程短，比传统操作方法时间节省50％时间，适用于三龄及以上的鳞翅目幼虫。

技术研发人员：崔金杰;楚博;张帅;雒珺瑜;吕丽敏;王丽
受保护的技术使用者：中国农业科学院棉花研究所
技术研发日：2017.04.24
技术公布日：2017.08.18