本发明涉及一种头孢菌素发酵液中还原糖的测定方法。
背景技术
头孢菌素抗菌活性弱，基本无临床价值，但以头孢菌素为起始原料，可以得到7-aca与7-adca两大β-内酰胺类头孢母核，进而经化学修饰可生产数十种临床常用的头孢类药物，该类药物毒性远低于青霉素类药物，不易水解，稳定性也较好，是目前世界用量较大的一类抗生素。
目前，头孢母核可以通过生物发酵法、6-apa扩环、直接用青霉素扩环生产，而生物发酵法是得到头孢母核的最环保的生产方式。
头孢菌素c的结构与青霉素相似，具有一内酞胺环，母核均为一氨基头抱烷酸，其结构式如下：
头孢菌素的发酵过程是一个复杂的多因素控制过程，而糖的代谢调控是工艺控制过程的主要控制因素，糖浓度的波动要控制在一定范围内，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。所以头孢发酵需对发酵过程中还原糖含量准确监控，以保证发酵生产平稳运行，而且在提高发酵单位和降低成本方面也具有重要意义。
目前普遍采用的检测还原糖含量方法是菲林试剂法。但是由于头孢菌素也能与菲林试剂发生反应，对检测结果产生较大干扰。所以检测方法不能真实反应发酵液中还原糖的真实水平。
技术实现要素：
本发明研发了一种改良的斐林试剂测定头孢菌素发酵液中还原糖的方法。
本发明头孢菌素发酵液中还原糖的测定方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取头孢菌素发酵液，过滤，离心，得上清，采用菲林试剂测定，得到还原糖数值测定值x1；
(2)计算影响值，影响值x2＝0.4335×头孢菌素效价+0.0181；
(3)(x1-x2)的值即为头孢菌素发酵液中还原糖的实际值。
步骤(1)中，过滤的条件是，离心得条件是。
步骤(1)中，所述菲林试剂包括cuso4溶液、酒石酸钾钠和氢氧化钠混合液和30％碘化钾溶液。
优选地，cuso4溶液按照如下方法制备：称取cuso4·5h2o62.5g，用水溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得；
酒石酸钾钠和氢氧化钠混合液按照如下方法制备：称取188g酒石酸钾钠(c4h4knao6·4h2o)和125g氢氧化钠(naoh)，用水溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得。
30％碘化钾溶液按照如下方法制备：称取150g碘化钾，用水溶解并稀释至500ml，摇匀，即得。
步骤(1)中，所述测定的方法是：
取上清每0.5ml，加入10ml菲林试剂中，摇匀后100℃条件下水浴加热10分钟；取出，迅速冷却，加入hcl溶液5ml，立即用na2s2o3滴定液滴定至淡黄色时，加入1ml0.5％淀粉指示液，使溶液显蓝色，继续用na2s2o3滴定至蓝色消失为终点。
优选地，所述hcl溶液的浓度为6mol/l。
优选地，所述na2s2o3浓度为0.1mol/l。
步骤(1)中，还原糖数值测定值x1的计算方法是：
x1＝c×(v01—v样1)×6
上式中：
c：na2s2o3滴定液实际浓度，mol/l；
v样1：样品消耗na2s2o3滴定液的体积，ml；
v01：空白消耗na2s2o3滴定液的体积，ml。
本方法能够准确测定头孢发酵液中还原糖含量，避免了因头孢菌素本身消耗斐林试剂对还原糖测定带来的干扰，与现有方法相比，能够提高还原糖测定准确度。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1113罐批新旧糖含量检测数据对比图
图2114罐批新旧糖含量检测数据对比图
图3115罐批新旧糖含量检测数据对比图
具体实施方式
实施例1本发明测定发酵液中还原糖的方法
一、测定方法
1、试剂的配制：
(1)菲林试剂
a液(cuso4溶液)：称取cuso4·5h2o62.5g，用水溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得。
b液(酒石酸钾钠和氢氧化钠混合液)：称取188g酒石酸钾钠(c4h4knao6·4h2o)和125g氢氧化钠(naoh)，用水溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得。
c液(30％碘化钾溶液)：称取150g碘化钾(ki)，用水溶解并稀释至500ml，摇匀，即得。
本试剂临用前准确量取a、b、c三液按a:b:c＝2:2:1的比例混合均匀后使用。(本溶液现配现用)
(2)4mol/l盐酸溶液
配制：量取浓盐酸340ml，缓慢倒入660ml水中，混合均匀，即得。
(3)6mol/lhcl溶液
配制：量取500ml浓盐酸，缓慢倒入500ml水中，混合均匀，即得。
(4)0.5％淀粉指示剂
配制：称取2.5g可溶性淀粉，用少量水调匀，倾入400ml沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水稀释至500ml，存入冰箱备用。
(5)1.0mol/lna2s2o3溶液配制
称取分析纯的naco2.0克溶解于1000ml纯化水中，加入250gna2s2o3，避光放置一周后，过滤，备用。
(6)0.1mol/lna2s2o3溶液配制
量取1.0mol/lna2s2o3溶液100ml，用纯化水稀释至1000ml，标定
2、菲林法测还原糖
精密量取混合均匀的菲林试剂10ml于试管中，准确加入经中速滤纸过滤的发酵滤液在500r/min条件离心(离心时间是1min)后得到的离心液0.5ml，摇匀于100℃条件下水浴加热10分钟。取出，迅速冷却，加入6mol/lhcl溶液5ml，立即用na2s2o3滴定液(0.1mol/l)滴定至淡黄色时，加入1ml0.5％淀粉指示液，使溶液显蓝色，继续用na2s2o3滴定至蓝色消失为终点。同时做空白试验。
公式如下：x1＝c×(v01—v样1)×6
上式中：
c：na2s2o3滴定液实际浓度，mol/l；
v样1：样品消耗na2s2o3滴定液的体积，ml；
v01：空白消耗na2s2o3滴定液的体积，ml。
此方法测定的还原糖数值包括发酵液中还原糖的量、头孢菌素、头孢菌素降解物的干扰产生的量。
3、头孢菌素与菲林试剂发生反应所影响的值
根据高效液相法检测头孢菌素效价，计算影响值
x2＝0.4335×头孢菌素效价(万u/ml)+0.0181
4、计算
还原糖含量％＝x1-x2
5、下面是对三罐批发酵液的每一个周期点还原糖测定结果以及与原方法的数据对照：
结果见表1～表3以及图1～图3：
表1113批糖含量数据
表2114批糖含量数据
表3115批糖含量数据
从以上三幅图中可以明显看出，原方法检测的糖含量波动范围大，但在发酵过程中，糖含量的波动应该是稳定在一个小区间范围内的，准确的糖含量数据可以正确的指导生产，本检测方法得到的糖含量数据较车间原有检测方法准确度大大提高。
综上，本发明方法可以有效测定头孢菌素发酵液中的还原糖，而且检测方法操作简便，应用前景优良。