专利名称：一种测定还原糖浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定还原糖浓度的方法。
背景技术：
目前，还原糖的测定方法多采用斐林氏容量法、高锰酸钾滴定法、二硝基水扬酸比色法以及色谱法等，这些方法各具特点，如1)食品中还原糖测定通常采用的斐林氏容量法、高锰酸钾滴定法属化学法，这类方法要求食品中还原糖含量较高，需达1％以上，样品还需水解和转化糖的计算，测量过程中样品的浓度、温度、杂质含量及颜色都会影响测量结果，测定时间长、步骤繁杂，因此滴定误差大，灵敏度较低；2)二硝基水扬酸比色法需先对样品去除杂质，高淀粉、高蛋白类样品及色素类含量高的样品结果重现性差，该类方法检测灵敏度只有0.1mg左右。这些方法主要用于常量分析，并易受样品中还原性杂质及色素的干扰，而且由于二糖及多糖的水解，会干扰测定结果，或不能同时测定酮式及醛式还原糖。而且，这些方法检测灵敏度低，对食品中含量低于0.01mg左右微量还原糖无法实现定量检测(如低糖食品、饮品等)，需要借助特殊分析手段才能实现微量组分检测；3)采用色谱法测定还原糖，灵敏、准确，但测定费时，成本高，属特殊分析技术，不便于常规条件下的通用检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便快速、准确灵敏的测定还原糖浓度的方法。
本发明所提供的测定还原糖浓度的方法，包括如下步骤1)将样品溶液与过量氯化四氮唑蓝在pH为7.5-8.5条件下反应；2)反应后的溶液经脱水，振荡下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液测定吸光度，得样品溶液中还原糖浓度。
其中，步骤1)所述反应是将反应液煮沸后反应1-3min；所述pH优选为8.0。
步骤2)所述反应后的溶液脱水可采用多种方式进行，通常可用无水Na2SO4进行脱水。
步骤2)所述测定吸光度是在570-600nm波长进行测定的；优选为586nm。
在进行具体测定时，通常可按如下过程进行将样品溶液2.5ml，质量百分浓度为0.2％的氯化四氮唑蓝溶液0.5ml(氯化四氮唑蓝反应灵敏度很高，0.2％氯化四氮唑蓝0.5ml已过量约30％)，0.1mol/L的NaOH溶液1.0ml混匀，加热至沸腾1min，冷却至室温；然后向其中加入无水Na2SO41.0g，乙酸乙酯5.0ml，振荡取上清液在586nm下测定吸光值，根据标准曲线即可得到溶液中还原糖的浓度。
在进行样品测定时，一般使样品溶液中还原糖的浓度范围含量在1.0-10.0μg/ml为好。
氯化四氮唑蓝(TTB)为无色或柠檬黄色结晶，分子量(C40H32Cl2N8O2)为727.67，与还原糖作用可生成不溶水的深蓝色甲月替(Diformazan)，该反应不受乙醛、肼、胲，柠檬酸、酒石酸、亚硫酸盐等还原性物质干扰，检出限量可达0.2μg；所得的甲月替能溶于乙酸乙酯。本发明应用上述原理来测定还原糖的浓度，具有如下优点1)方便快速，准确灵敏，还原糖最小检出量可达0.2μg；2)对于还原糖含量较高的样品，可以进行大倍数稀释，不必除去杂质即可分析，各种色素(如水溶性的花青素及脂溶性的叶绿素等)不干扰分析测定；对于还原糖含量少，且体积小的样品(如各种生理体液)则可以采用本发明方法直接测定，测定简便、快捷；3)在测定时，样品与TTB在pH值偏碱性的条件下进行煮沸反应，能钝化样品中有生物活性的物质，可以排除这些物质对测定结果的影响；4)蔗糖测定实验证实，氯化四氮唑蓝(TTB)与之不反应，说明本发明测定条件下二糖及多糖等不发生水解，避免了二糖及多糖等的水解对测定结果的干扰。本发明测定还原糖浓度的方法，灵敏度高，操作简便，样品溶液一般不必除去色素及其它杂质，可广泛用于各种样品，特别是适合于样品量小、还原糖含量低(微量)、样品“杂质”多、色素深的各种生物样品中还原糖的测定。
具体实施例方式
实施例1、氯化四氮唑蓝法测定还原糖浓度1、主要仪器、材料分光光度计、水浴锅、具塞试管(10～15ml)、0.2％氯化四氮唑蓝(TTB)水溶液(质量百分浓度)、0.1mol/L氢氧化钠、乙酸乙酯、无水硫酸钠、标准葡萄糖、果糖。
2、建立标准曲线用标准葡萄糖、果糖各半配制标准糖溶液，浓度为10.0μg/ml，按表1所列步骤加入各种反应试剂，并进行反应，反应结束后取上清液。
将所得上清液进行全波长扫描，确定在586nm波长下为分析微量还原糖的最佳吸收波长。在586nm波长下测定不同标准糖浓度的吸光值，吸光值与糖浓度的线性回归方程为y＝0.103x-0.0016，相关系数r＝0.9994；其中y为吸光值，x为糖浓度(μg/ml)。
表1.建立标准曲线的反应步骤及加入不同试剂量(具塞试管10～15ml中)
3、样品测定将样品提取液2.5ml，TTB溶液0.5ml，NaOH溶液1.0ml加入到具塞试管中，混匀后，加热至沸腾1min，冷却至室温；然后向其中加入无水Na2SO41.0g，乙酸乙酯5.0ml，振荡2min，取上清液以表1的0号样品为空白在586nm下测定吸光值，由回归方程得到样品提取液中还原糖的浓度。
给出二种不同的样品提取液采用本发明方法测定结果及采用对照方法测定的结果见表2，结果表明，本发明方法与斐林氏法相比，检测灵敏度高；检测结果准确，与毛细管电泳法、色谱法等方法的测定值相当。
表2.几种方法测定微量还原糖结果比较(μg/ml)
权利要求
1.一种测定还原糖浓度的方法，包括如下步骤1)将样品溶液与过量氯化四氮唑蓝在pH为7.5-8.5条件下反应；2)反应后的溶液经脱水，振荡下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液测定吸光度，得样品溶液中还原糖浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述反应是将反应液煮沸后反应1-3min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述pH为8.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述反应后的溶液脱水用无水Na2SO4进行。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于步骤2)所述测定吸光度是在570-600nm波长进行测定的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述测定波长为586nm。
全文摘要
本发明公开了一种测定还原糖浓度的方法。本发明所提供的测定还原糖浓度的方法，包括如下步骤1)将样品溶液与过量氯化四氮唑蓝在pH为7.5－8.5条件下反应；2)反应后的溶液经脱水，振荡下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液测定吸光度，得样品溶液中还原糖浓度。本发明方法操作简便，灵敏度高，样品溶液一般不必除去色素及其它杂质，可广泛用于各种样品中还原糖的测定。
文档编号G01N31/00GK1614393SQ20041009633
公开日2005年5月11日 申请日期2004年11月30日 优先权日2004年11月30日
发明者王世平, 王增利 申请人:中国农业大学