一种梨果实表皮蜡质含量快速测定的方法与流程

本发明属于植物表皮蜡质含量测定技术领域，具体涉及梨果实表皮蜡质含量快速测定的方法。

背景技术：

蜡质层是覆盖在植物表面的一层疏水性保护物质，作为植物与外界接触的第一道屏障，具有维持植物表面清洁、抵御不良环境、阻止病虫害以及植物非气孔性失水等功能，对植物叶片、果实的形态以及花粉发育也有重要影响。此外，蜡质还可作为油漆、润滑剂、医药、化妆品和生物燃料的重要原料，包含的一些萜类化合物含有对人体健康有利的成分，具有消炎抗肿瘤等功能。因此，对植物蜡质的研究具有潜在的保健效益和经济价值，蜡质也正成为植物研究的重要内容之一。我国梨树栽培历史悠久，资源丰富，栽培面积和产量一直居世界首位，在国内位居全国水果栽培总面积和总产量的第三位，对梨果实蜡质研究有着必要的意义。

目前研究者大多是通过将植物组织器官浸泡在有机溶剂中提取蜡质。所选用的有机溶剂包括三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、正己烷等。在实际操作中为防止植物内部细胞中的脂溶性物质被提取，通常需要把完整的植物器官浸泡在提取液中。蜡质含量通过单位面积蜡含量表示，在实际操作过程中由于各植物组织形态不同，导致对一些植物器官表皮蜡质含量进行准确快速测定的难度较大。植物叶片因为体积小，表面积容易计算，蜡质容易提取，含量计算较为准确。柑橘、葡萄等水果果形较正，蜡质含量可以按球体进行估算。但是对于果形不规则、果个大的梨果实表皮蜡质含量进行准确快速的测定，难度较大。目前对果形不规则的果实表皮蜡质含量进行快速测定主要存在以下问题：

(1)目前梨表面积计算大多是参考yuankejun等(2000)研究者报道的方法，通过测量纵横径等数据进行估算。而梨不同品种果形差异较大，有椭圆形、圆形、葫芦形等，利用同一个公式去估算所有的梨表面积，实验误差较大；

(2)三氯甲烷用量过多蒸发难，过少会影响蜡质提取的完全性。一般梨果实果个较大，一个500g的梨果实提取蜡质就需要大约500ml的有机溶剂。所以对梨果实表皮蜡质含量进行测定需要消耗大量的有机溶剂，而大量的有机溶剂进行蒸馏吹干需要较长时间，并且溶剂过多需要借用旋转蒸发仪等仪器进行快速蒸馏，这就导致在提取过程中需要对蜡质提取液进行多次转移，造成药剂浪费、时间增加，试验成本增加，实验误差增大。三氯甲烷提取植物表皮蜡质，虽然效果较好，但是属于有毒试剂，试验过程中长时间接触三氯甲烷易对试验人员健康和环境产生较大危害。

这些因素都制约研究者们对梨果实蜡质含量进行快速测定。

技术实现要素：

针对上述问题，申请人结合目前的蜡质测定方法，经过探索和实践后，特提出一种快速测定梨果实蜡质含量的方法，能够利用少量的三氯甲烷对梨果实表皮蜡质含量进行快速测定。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

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一种梨果实表皮蜡质含量快速测定的方法，该方法包括以下步骤：

(1)在梨果实表面截取若干厚度为0.5～1mm的果皮；；

(2)取步骤(1)的果皮浸入装有三氯甲烷、质量为w1的容器中进行浸泡30～90秒；

(3)浸泡后，将容器中的三氯甲烷蒸发至干，称量此时的容器的质量为w2；

(4)按下述公式计算梨果实蜡质含量；

m(mg/cm²)＝(w2-w1)/(s×k)×10³

其中，果皮的总表面积为s；m：提取的蜡质含量(mg/cm²)；k值为3.8～4.2。

本发明技术方案中：步骤(1)中在梨果实表面截取总表面积s为5～15cm²的果皮。作为优选：步骤(1)在梨果实表面截取总表面积s为9cm²的果皮。

本发明技术方案中：步骤(2)三氯甲烷的用量为5～15ml。作为优选：步骤(2)三氯甲烷的用量为8ml。

本发明技术方案中：步骤(3)三氯甲烷在40℃环境下对三氯甲烷进行蒸发。

本发明技术方案中：步骤(4)的k值为4。

本发明技术方案的蜡质提取方法中“全果浸泡”变为“果皮浸泡”：现有梨果实蜡质提取方法是通过将梨果实完全浸泡在三氯甲烷里，改变后的方法是利用手术刀在梨果实表面取一定面积果皮进行测定。

本发明技术方案的梨表面积计算方法中“整体估算”变为“准确计算”：现有梨果实表皮蜡质测定是对梨整个果实进行表面积估算，改变后的方法是直接可以得到梨果实表面积大小。

本发明技术方案的用果皮提取蜡质，梨果皮内侧细胞中脂溶性的一些物质会被提取，但是应该与全果浸泡提取的蜡质含量具有相关性。通过对梨全果浸泡后测定的表皮蜡质含量以及取一定面积果皮提取的蜡质含量两组数据进行相关性分析，判断两组数据之间的关联性。

有益效果

本发明中梨果实蜡质含量测定不需要进行全果浸泡，直接在梨果实表面取果皮进行测定，化繁为简，表面积计算准确。全果浸泡一个果实需要500ml的三氯甲烷，而采用本方法只需要8ml，过多的三氯甲烷完全蒸发干净时间很长，并且整个过程中不需要进行液体转移，最大程度的节省了药品，节省了时间，减少了工作量和有毒试剂对实验人员的伤害。

附图说明

图1是全果浸泡和果皮浸泡两种方法提取梨果实蜡质含量的线性相关图；

图2是全果浸泡和果皮浸泡两种方法提取梨果实蜡质含量比值的箱形图；

图3是全果浸泡和果皮浸泡两种方法提取梨果实蜡质流程图。

其中，a：全果浸泡全果浸泡提取梨果实蜡质流程图；b：果皮浸泡全果浸泡提取梨果实蜡质流程图；a：旋转蒸发仪；b：氮吹仪；c：三氯甲烷试剂；d：提取出来的蜡质；a-1：将整个梨果实浸泡在有机溶剂；a-2：通过旋转蒸发仪进行蒸发；3：通过氮吹仪进行蒸发、吹干；4：获得蜡质；b-1：用手术刀截取规格的梨果皮若干块；b-2：用三氯甲烷浸泡截取下来的果皮

具体实施方式

下面以本发明方法在梨果实表皮蜡质含量测定上的应用为例，说明其具体实施过程。

(1)取梨果实用清水洗净，用手术刀在梨上部、中部、下部各取三块1×1cm²的果皮。为了保证结果尽量准确，果皮尽量少含果肉，可以提前准备1×1cm²的硬纸片贴在梨果实表面进行截取；

(2)取下的果皮快速浸入装有8ml三氯甲烷，质量为w1的螺口试剂瓶(容积10ml)中，轻轻摇晃1分钟后，取出果皮；

(3)螺口试剂瓶置于jhd-001s氮吹仪上在稳定的氮气流、恒温40℃中将三氯甲烷蒸发至干，称量此时的容器的质量为w2；

(4)按下列公式计算梨果实蜡质含量：

m2(mg/cm²)＝m1/4＝(w2-w1)/9×10³

其中，m2：全果浸泡提取的蜡质含量(mg/cm²)；m1：9块果皮浸泡提取的蜡质含量(mg/cm²)；w2：螺口试剂瓶和蜡质总重量(g)；w1：螺口试剂瓶重量(g)。

申请人通过对35个不同梨果实样品分别进行全果浸泡以及取果皮浸泡两种方法进行表皮蜡质含量测定，然后对两组数据进行相关性分析(图1)，结果表明两组数据显著正相关(r²＝0.9853)。并且通过箱形图分析发现果皮浸泡提取的蜡质含量是全果浸泡提取蜡质含量的4倍，因此，本方法适用于梨表皮蜡质含量的快速测定。

在实验过程中我们可以根据果皮和全果浸泡两种方法提取的蜡质含量之间的线性关系进行换算，灵活变通，实现对大量梨果实蜡质含量进行快速测定。

全果浸泡和果皮浸泡两种方法提取梨果实蜡质含量结果

注：m1代表的是9块1×1cm²果皮浸泡提取的蜡质含量，m2代表是全果浸泡提取的蜡质含量。表中m1和m2数值取三次重复后的平均值。其中k＝m2/m1。

(5)本发明方法也可运用于其他果实蜡质含量的快速测定。