一种应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术的制作方法

本发明属于木材解剖构造领域，具体涉及一种应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术。

背景技术：

树木在生长过程中若受到环境因素的影响会产生倾斜生长。应拉木形成于阔叶材倾斜或弯曲树干的上方，即受拉部分的木质部。由于应拉木的形成，树木内部生长应力分布不均匀，出现起毛、翘曲等缺陷，阻碍木材的高附加值利用。为解决这个问题，应拉木及高生长应力的成因是当前的研究热点。

胶质纤维是应拉木特有的细胞类型，其细胞壁内层的胶质层为重要特征。胶质层存在于应拉木胶质纤维中，对应拉木的产生及高生长应力的形成具有重要影响。目前，国内外研究主要针对应拉木完整的细胞结构，未涉及对独立胶质层的研究。而胶质层作为应拉木的特殊细胞壁层，与应拉木异常的材性直接相关。

因此，研究独立胶质层的微观结构和化学成分对探索应拉木高生长应力的形成机理具有重要意义，但将胶质层这一特殊的细胞壁层从胶质纤维细胞壁中分离出来的技术手段目前仍未被提及。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可较彻底地分离出独立胶质层、提高胶质层得率、且不影响胶质层的微观结构和化学成分的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术，包括以下步骤：

(1)选取阔叶材倾斜的树干或大枝条，将树干或大枝条锯成圆盘，确定应拉木区域；

(2)从应拉木区域切取横切面切片，将切取的切片存放于乙醇溶液中并冷藏，得到切片溶液；

(3)将步骤(2)得到的切片溶液采用超声振荡处理，得到含独立胶质层和杂质的混合液；

(4)将步骤(3)得到的含独立胶质层和杂质的混合液过滤，去除粗杂质，得到含独立胶质层和细杂质的混合液；

(5)将步骤(4)得到的含独立胶质层和细杂质的混合液过滤，去除细杂质，得到含独立胶质层的悬浮液；

(6)将步骤(5)得到的含独立胶质层的悬浮液进行离心分离，再冷藏静置至胶质层完全沉淀，经吸取或分离，得到独立胶质层。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(2)中，所述切片采用滑走式切片机或瑞士便捷切片机进行切取；和/或，所述切片的厚度为10μm～30μm；和/或，所述乙醇溶液的质量浓度为93％～96％。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(3)中，所述超声振荡处理时，超声波功率为80w～110w，超声波频率为20khz～40khz，震荡时间为5min～30min。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(2)中，所述冷藏的温度为2～5℃；所述步骤(3)中，所述超声振荡处理中切片溶液的温度保持2～5℃；所述步骤(6)中，所述冷藏的温度为2～5℃。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(4)中，采用过滤器进行过滤，所述过滤器的孔径为1mm～1.5mm。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(5)中，采用过滤器进行抽滤，所述过滤器的孔径为30μm～60μm。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(5)中，所述过滤器为millipore公司生产。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(6)中，所述离心分离的时间为5min～7min，所述离心分离的转速为2500r/min～2800r/min。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(1)中，所述圆盘的厚度为20mm～40mm。

上述的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术中，优选的，所述步骤(1)中，确定应拉木区域采用氯锌碘涂刷法：先将氯化锌和水配制成第一液，然后将碘化钾、碘和水配制成第二液，再将第一液和第二液混合，避光放置，并冷却至室温，得到氯锌碘溶液；

所述第一液中，所述氯化锌与水的质量比为2～3∶1；所述第二液中，所述碘化钾、碘与水的质量比为8.4～10∶0.4～0.5∶20；

或者，所述步骤(1)中，确定应拉木区域采用观察法：先将所述圆盘的端面砂光，出现年轮偏宽和起毛现象的区域为应拉木区域。

本发明中，应拉木圆盘样品需存放于质量浓度为60～70％的酒精中保存，从取样至切片的一系列步骤，需连贯迅速进行，防止胶质层受空气影响而干燥收缩。应拉木切片应完整，以保证胶质层的顺利分离。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明的技术可较为彻底地将独立的胶质层从应拉木胶质纤维细胞中分离出来，提高胶质层的得率和纯度，并且在后续研究胶质层时，减少其他壁层对研究结果的影响。

(2)本发明的技术在分离胶质层时不影响胶质层的微观结构，保证后续研究结果的准确性，减少误差。

(3)除乙醇溶液外，未使用其他化学试剂，因此分离过程不影响胶质层的化学成分，从而在分析胶质层化学成分与应拉木高生长应力形成的关系时，提供可行性。

附图说明

图1为本发明实施例1中得到的杨木胶质层在光学显微镜下的照片。

图2为本发明实施例2中得到的青皮桐胶质层在光学显微镜下的照片。

图3为本发明实施例3中得到的香樟胶质层在光学显微镜下的照片。

图4为本发明实施例4中得到的枫香胶质层在光学显微镜下的照片。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例：

一种本发明的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术，包括以下步骤：

(1)选取阔叶材倾斜的树干或大枝条，将其锯成圆盘，确定应拉木区域。其中，圆盘厚度为20mm～40mm。确定应拉木区域可采用氯锌碘涂刷法或观察法；氯锌碘溶液的配置方法为先将氯化锌和水配制成第一液，然后将碘化钾、碘和水配制成第二液，再将第一液和第二液混合，避光放置，并冷却至室温，得到氯锌碘溶液，第一液中氯化锌与水的质量比为2～3∶1，第二液中碘化钾、碘与水的质量比为8.4～10∶0.4～0.5∶20；观察应拉木区域时，先将圆盘端面砂光，应拉木区域会出现年轮偏宽和起毛现象。

(2)从新鲜应拉木区域快速切取大量横切面切片，并将切取的切片立即存放于乙醇溶液中并冷藏，冷藏的温度为2～5℃。其中，切片可采用滑走式切片机或瑞士便捷切片机，切片厚度为10μm～30μm，乙醇溶液浓度为93％～96％。

(3)将步骤(2)得到的切片溶液采用超声振荡处理后，得到含有独立胶质层和杂质的混合液。其中，超声波功率为80w～110w，超声波频率为20khz～40khz，震荡时间为5min～30min。

(4)将步骤(3)得到的混合液过滤，去除粗杂质，得到含有独立胶质层和少量细杂质的混合液。其中，过滤可采用millipore公司生产的过滤器进行，过滤器孔径为1～1.5mm。

(5)步骤(4)中的少量杂质通过过滤去除，从而得到含纯净的独立胶质层的乙醇悬浮液。其中，过滤可采用过滤器进行，过滤器一端(非出口端)接有真空泵，过滤的同时抽真空，过滤器为millipore公司生产，过滤器孔径为30μm～60μm。

(6)将步骤(5)得到的悬浮液通过离心机离心分离，分离时间为5～7min，转速为2500～2800r/min，再冷藏静置至胶质层完全沉淀，冷藏的温度为2～5℃，可用滴管吸取得到大量独立胶质层。

实施例1：

一种本发明的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术，包括以下步骤：

(1)选取杨木倾斜树干木段，将木段锯成厚度为20mm的圆盘，并将圆盘端面砂光。将80g氯化锌、40g水配制成第一液，将8.4g碘化钾、0.4g碘、20g水配制成第二液，将第一液和第二液混合，避光放置，冷却至室温，得到混合液。将混合液涂刷在杨木圆盘端面，呈现深褐色为应拉木区，呈现浅黄色为正常木区。

(2)立即从圆盘显示的应拉木区中选取适量木材，制成尺寸为10mm×10mm×10mm的小木块，通过滑走式切片机快速切取大量厚度为20μm的横切面切片，切片要求完整、平滑，并将切取的切片立即存放于质量浓度为96％的乙醇溶液中，并冷藏，冷藏温度为2～5℃，得到切片溶液。

步骤(1)和步骤(2)中，从涂刷、取材、切片到存放在乙醇溶液中均要连贯和立即实施，需要非常迅速，尽可能地快，其它实施例同此说明。

(3)将步骤(2)的切片溶液用功率110w和频率25khz的超声波振荡处理5min，振荡过程中溶液需保持2～5℃，得到含有独立胶质层和杂质的混合液。

(4)将步骤(3)得到的混合液经1mm的过滤器过滤，得到含有独立胶质层和少量细杂质的混合液。

(5)步骤(4)中的含有独立胶质层和少量细杂质的混合液通过30μm的millipore过滤器过滤，过滤器一端(非出口端)接真空泵，过滤的同时抽真空，从而得到含独立胶质层的悬浮液。

(6)将步骤(5)得到的悬浮液通过离心机离心分离，分离时间为5min，转速为2500r/min，再冷藏静置1夜，冷藏的温度为2～5℃，胶质层完全沉淀，即可用滴管吸取得到大量独立胶质层，并在显微镜下观察其纯度，如图1所示。图1为光学显微镜下观察到的杨木胶质层，可以看出，此分离方法可较彻底地分离出独立胶质层，可保证胶质层的独立性与完整性，而且纯净透明，不含有其他杂质，有效地提高了胶质层的得率，且对胶质层的微观结构和化学成分影响较弱。

实施例2：

一种本发明的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术，包括以下步骤：

(1)选取青皮桐倾斜树干木段，将木段锯成厚度为40mm的圆盘，并将圆盘端面砂光。将80g氯化锌、40g水配制成第一液，将8.4g碘化钾、0.4g碘、20g水配制成第二液，将第一液和第二液混合，避光放置，冷却至室温。将混合液涂刷在青皮桐圆盘端面，应拉木区域呈现深褐色，正常木区域呈现浅黄色。

(2)立即在圆盘显示的应拉木区中选取适量木材，制成尺寸为10×10×10mm的小木块，通过瑞士便捷切片机快速切取大量厚度为15μm的横切面切片，并将切取的切片存放于质量浓度为95％的乙醇溶液中，并冷藏，冷藏温度为2～5℃，得到切片溶液。

(3)将步骤(2)的切片溶液用80w功率和频率40khz的超声振荡处理20min，振荡过程中溶液需保持2～5℃，得到含有独立胶质层和杂质的混合液。

(4)将步骤(3)得到的混合液经1.5mm的过滤器过滤，得到含独立胶质层和细杂质的混合液的胶质层滤液。

(5)步骤(4)中的含独立胶质层和细杂质的混合液通过40μm的millipore过滤器过滤，过滤器一端接真空泵，过滤的同时抽真空，从而得到含独立胶质层的悬浮液。

(6)将步骤(5)得到的悬浮液通过离心机离心分离，分离时间为6min，转速为2700r/min，再冷藏静置1夜，冷藏的温度为2～5℃，胶质层完全沉淀，即可用滴管吸取得到大量独立胶质层，并在显微镜下观察其纯度，如图2所示。图2为光学显微镜下观察到的青皮桐胶质层，可以看出，此分离方法可保证胶质层的独立性与完整性，而且纯净透明，不含有其他杂质。

实施例3：

一种本发明的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术，包括以下步骤：

(1)选取香樟倾斜树干木段，将木段锯成厚度为30mm的圆盘，并将圆盘端面砂光。将80g氯化锌、40g水配制成第一液，将8.4g碘化钾、0.4g碘、20g水配制成第二液，将第一液和第二液混合，避光放置，冷却至室温。将混合液涂刷在香樟圆盘端面，应拉木区域呈现深褐色，正常木区域呈现浅黄色。

(2)在圆盘显示的应拉木区中选取适量木材，制成尺寸为10×10×10mm的小木块，通过瑞士便捷切片机切取厚度为20μm的横切面切片，并将切取的切片存放于质量浓度为95％的乙醇溶液中，并冷藏，冷藏温度为2～5℃，得到切片溶液。

(3)将步骤(2)的切片溶液用100w功率和频率20khz的超声振荡处理15min，振荡过程中溶液需保持2～5℃，得到含有独立胶质层和杂质的混合液。

(4)将步骤(3)得到的混合液经1mm的过滤器过滤，得到含独立胶质层和细杂质的混合液。

(5)步骤(4)中的含独立胶质层和细杂质的混合液通过60μm的millipore过滤器过滤，过滤器一端接真空泵，过滤的同时抽真空，从而得到胶质层的乙醇悬浮液。

(6)将步骤(5)得到的悬浮液通过离心机离心分离，分离时间为7min，转速为2800r/min，再冷藏静置1夜，冷藏的温度为2～5℃，胶质层完全沉淀，即可用滴管吸取得到大量独立胶质层，并在显微镜下观察其纯度，如图3所示。图3为光学显微镜下观察到的香樟胶质层，可以看出，此分离方法可保证胶质层的独立性与完整性，而且纯净透明，不含有其他杂质。

实施例4：

一种本发明的应拉木胶质纤维细胞壁中胶质层的分离技术，包括以下步骤：

(1)选取枫香倾斜树干木段，将木段锯成厚度为20mm的圆盘，并将圆盘端面砂光。通过肉眼观察，确认年轮偏宽，并出现起毛现象的区域为应拉木区域。

(2)在圆盘显示的应拉木区域中选取适量木材，制成尺寸为10×10×10mm的小木块，通过滑走式切片机切取厚度为20μm的横切面切片，并将切取的切片存放于质量浓度为93％的乙醇溶液中，并冷藏，冷藏温度为2～5℃，得到切片溶液。

(3)将步骤(2)的切片溶液用100w功率和频率25khz的超声振荡处理20min，振荡过程中溶液需保持2～5℃，得到含有独立胶质层和杂质的混合液。

(4)将步骤(3)得到的混合液经1.5mm的过滤器过滤，得到含独立胶质层和细杂质的混合液。

(5)步骤(4)中的含独立胶质层和细杂质的混合液通过40μm的millipore过滤器过滤，过滤器一端接真空泵，过滤的同时抽真空，从而得到含独立胶质层的悬浮液。

(6)将步骤(5)得到的悬浮液通过离心机离心分离，分离时间为5min，转速为2800r/min，再冷藏静置1夜，冷藏的温度为2～5℃，胶质层完全沉淀，即可用滴管吸取得到大量独立胶质层，并在显微镜下观察其纯度，如图4所示。图4为光学显微镜下观察到的枫香胶质层，可以看出，此分离方法可保证胶质层的独立性与完整性，而且纯净透明，不含有其他杂质。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。