本发明涉及一种孢囊线虫卵的收集方法，属植物病原线虫研究领域。
背景技术：
孢囊线虫是一类重要的植物病原线虫，引起包括小麦、水稻、大豆、甜菜和马铃薯等许多重要作物的产量损失。重要的孢囊线虫隶属于孢囊线虫属（heterodera）和球形孢囊线虫属(globodera)，其中，以孢囊线虫属种类最多，我国严重发生的主要有小麦孢囊线虫病和大豆孢囊线虫病。
小麦孢囊线虫病分布范围广，已遍布全世界40多个国家。小麦孢囊线虫病主要危害植物根部，使小麦植株生长受到影响，引起产量的下降。我国从1989发现该病以来，目前已遍布16个省（市、区），发病面积为1700多万亩，造成的产量损失达30%以上，并且危害程度逐年增加。一旦该病害爆发，将会严重影响我国小麦的生产，甚至威胁到我国的粮食和经济安全。大豆孢囊线虫病是大豆上最重要的病害之一，具有分布广、寄主范围宽、传播途径多、危害严重等特点。大豆主要生产国如美国、巴西、中国和日本都有大面积发生。我国仅东北和黄淮海大豆产区每年发生面积就有2000万亩以上，受害大豆一般减产30%～50%，严重的减产70%～90%，甚至绝产。
孢囊线虫的卵成熟后，只有少数被雌虫排出体外，绝大部分卵保留在雌虫体内。当雌虫老熟后，表皮变硬、鞣质化，颜色变褐，可保护其中的卵长期存活。孢囊内的卵具有很强的抗逆性，能在土壤中存活多年。孢囊线虫的卵是重要的试验材料，不论是在孢囊线虫的发生情况调查、基数检测，还是在孢囊线虫致病性测定、生理小种鉴定、品种抗病评价，以及生物测试等科学研究和实践中，都需要收集大量的卵作为试验材料。因此，研发一种简单、易操作，同时可获得大量、高质量的线虫卵的收集技术是开展上述科学研究和实践的基础。
目前，尚缺乏简单、高效地收集孢囊线虫卵的技术，在该类线虫的研究中，多采用橡胶塞研磨或玻璃匀质器手工研磨破碎孢囊，然后通过冲洗杂质获得卵粒。这些方法不易操作，用力轻时，孢囊不能充分破碎，用力过大，则易破损卵粒；且工作效率较低，获得的卵粒混杂较多孢囊壳碎片，质量不高。
技术实现要素：
本发明提供一种孢囊线虫卵的收集方法。由于孢囊线虫卵保存于表皮坚硬、抗逆性很强的褐色孢囊中，本发明首先需要研磨孢囊，使其破碎，将卵从其中释放出来，然后通过冲洗和离心，将卵粒从孢囊碎片和各种杂质中分离出来，获得大量的、完整的、有活性的线虫卵。
本发明提供的技术方案是：一种孢囊线虫卵的收集方法，其包括如下步骤：
第一步，将孢囊线虫的孢囊冲入55-65目的第一筛中，将第一筛放在180-220目第二筛和450-550目第三筛构成的套筛之上，其中450-550目筛在最下面；
第二步，用研磨器低档研磨，并不时用小水冲刷；
第三步，待第一筛上的孢囊被破碎后，经流水冲至其下的180-220目和450-550目的套筛上；
第四步，轻轻冲洗180-220目筛，将卵、孢囊碎片和杂质冲洗到450-550目筛上；
第五步，再将所述卵、孢囊碎片和杂质冲洗到离心管中，离心使卵沉降。
所述的孢囊线虫卵的收集方法，优选地，所述第一筛为60目；所述第二筛为200目；所述第三筛为500目；第五步中的离心是以2100r/min的转速进行。
所述的孢囊线虫卵的收集方法，进一步包括如下步骤：
第六步，在第五步离心后，用吸掉部分水后用抽吸卵悬浮液，将其轻轻覆盖于35-45%的蔗糖溶液上，再次离心，在蔗糖和水面交界处可见一层白色卵液。
所述的孢囊线虫卵的收集方法，进一步包括如下步骤：
第七步，将卵液移至第一步中所述的筛套上，用水冲洗以清除蔗糖溶液；最后，将卵冲入干净的容器中，即得到卵的悬浮液。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明简单，易操作。由于采用电力供能、机械钻头转动研磨破碎线虫孢囊，操作省力、简便。
2、本发明可用于大量收集研究用孢囊线虫的卵，工作效率高。
3、本发明收集到的孢囊线虫卵，杂质含量低，纯度高，卵的破损率低，质量高。
具体实施方式
本发明孢囊线虫卵的收集方法方法的具体操作步骤如下：
一、孢囊的分离和收集：将含有孢囊的土壤样本混合均匀，风干后，倒入塑料桶中，然后将水加入塑料桶中搅拌均匀，静置1-2min后将悬浮液依次倒入26目和60目的筛网过滤，重复2-3次。然后用强水流冲洗26目筛网上的残余物，将孢囊全部冲入60目的筛网中。再用小水流从正面轻轻淋洗60目筛，冲洗干净后，将网上的残余物用洗瓶冲入小盘上的60-80目尼伦纱布上，在体视解剖镜下收集孢囊。
二、60目小筛的制作：截取高分别为5cm、1cm，内径为4cm的pvc管，用木工砂纸将截面打磨平整。裁剪60目的钢丝网，将60目的钢丝网通过pvc胶水粘于5cm×4cmpvc管和1cm×4cmpvc管之间，得到60目小筛。
三、孢囊研磨器的制作：将小型台式钻（bg-5168e微型台钻）的钻头尖端插入3号橡胶塞（26mm×23mm×18mm），将其安装至台式钻床（可从商业途径得到）上备用。
四、用孢囊研磨器收集卵：将孢囊冲入自制的60目小筛中，将60目小筛放在200目和500目套筛（500目在最下面）之上。用制作的孢囊研磨器低档研磨，研磨时不要太用力，并不时用小水冲刷。60目上的孢囊被破碎后，经流水冲至其下的200目和500目套筛上。然后，轻轻冲洗200目筛，将卵、孢囊碎片和杂质冲洗到500目筛上。
五、离心漂浮法纯化卵：用洗瓶将卵从500目筛上冲洗到50ml圆底离心管中，以2100r/min的转速离心5min，使卵沉降。用注射器轻轻吸掉3/4水（离心管中约剩下15-20ml）。向50ml锥形底离心管中加入约25ml的40%蔗糖溶液，然后用注射器抽吸卵悬浮液，将其轻轻覆盖于蔗糖溶液上。以2100r/min的转速离心5min。此时，蔗糖和水面交界处可见一层白色卵液。用注射器将卵液移至200目和500目筛上，用水冲洗15s，以清除蔗糖溶液。最后，将卵冲入干净的锥形底离心管，即得到卵的悬浮液。