本发明属于流式细胞术的样品前处理技术领域，更具体地说，涉及一种基于流式结合icp-ms单细胞蛋白检测的样本前处理方法，特别涉及人外周血样本的前处理方法。
背景技术：
流式细胞术是一种采用激光束激发单行流动的细胞，对它的散射光和携带的荧光进行探测，从而完成对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点，被广泛应用于临床医学、细胞学、生物学、微生物学、制药学、生殖学等领域。作为最普遍使用的单细胞技术之一，流式技术一直在生物学各研究领域都有着广泛的应用。一直以来，流式技术是分析复杂细胞群体的重要手段，它可以实现对细胞进行多参数分析，从而区分不同种类的细胞；其所能检测参数的多少，也决定了我们对于所研究群体异质性的了解程度。
目前流式细胞术的样品前处理方法基本都是进行荧光染料标记，具体前处理方法为：1)收集2×10^6个细胞，用1ml冷的pbs重悬，1500rpm离心5min，弃上清；
2)拍打混匀细胞团块，随后加入1ul荧光直标的cd45抗体，混匀，冰上避光孵育15min；
3)加入1mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
4)加入1ml1％中性多聚甲醛(注：用pbs将4％的多聚甲醛稀释为1％浓度使用即可)重悬细胞，避光固定15min，随后1500rpm离心5min，弃上清；
5)加入1mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
6)用1ml含0.09％皂素的pbs重悬细胞，冰上避光放置10min，1500rpm离心5min，弃上清；
7)加入1mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
8)以200ulpbs重悬细胞，加入hsp70抗体，冰上避光放置30min，再用1ml冷的pbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，洗去未结合的一抗；
9)加入1mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
10)以200ulpbs重悬细胞，加入fitc标记的二抗，冰上避光放置40min后，再用1ml冷的pbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，洗去未结合的二抗；
11)加入1mlpbs重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
12)以200ulpbs重悬细胞，避光备用；上机检测，每样品计数5000-50000个细胞。
荧光染料的标记与金属标签标记细胞的原理不同，处理方法也迥异。故现有标记方法进行前处理的样本无法很好的应用于基于流式结合icp-ms进行人外周血样本单细胞蛋白检测。样本前处理的方法研究阻滞，将严重影响新型检测方法检测技术的发展与应用。
技术实现要素：
1.要解决的问题
针对现有的流式细胞术样品前处理方法无法适用于金属标签标记细胞检测的问题，本发明提供一种基于流式结合icp-ms单细胞蛋白检测的样本前处理方法，将金属元素标签标记的抗体与细胞表面抗原结合，将标记好的细胞与作为内参用于标准化的beads混合，前处理过程中区分死细胞与活细胞，以免出现死细胞数量过多影响实验结果的分析与阐述，区分单细胞与细胞二聚体、三聚体甚至多聚体，能很好的满足流式结合icp-ms单细胞蛋白检测需求。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
基于流式结合icp-ms单细胞蛋白检测的样本前处理方法，包括以下步骤：
(1)全血样本的采集和运输：采集全血样本，样本中添加抗凝剂，常温保存运输；
(2)pbmc细胞分离：采用ficoll淋巴细胞分离液对全血样本中的细胞进行分离；
(3)细胞活性染色：采用顺铂对分离的细胞进行染色，染色时间控制在5-10min，染色结束后离心去上清液，对细胞进行重悬；
(4)细胞刺激：将细胞转移至培养箱中培养15～30min，使细胞恢复“静息”状态，并根据适当的刺激物及刺激方法对细胞进行分组刺激；
(5)细胞固定：对步骤(3)中重悬的细胞进行pfa固定、冻存；
(6)表面抗体染色：将pfa固定、冻存的细胞融化后，重悬，加入细胞染色缓冲液，离心去除上清后，加入blockingmix重悬，常温静置后加入cocktail混匀；
(7)胞内磷酸化蛋白染色：将表面抗体染色后的细胞用pbs和甲醇处理后，用cellstainingbuffer重悬，加入磷酸化抗体cocktail混匀，常温孵育之后用cellstainingbuffer清洗去上清；
(8)单细胞标记：步骤(7)中染色后的细胞用pbs缓冲液重悬，滴加入含有金属元素标记物的cellintercalation溶液进行标记，随后分别用cellstainingbuffer和水进行清洗，最后将细胞重悬于含有eqbeads的水中保存。
更进一步地，所述步骤(1)中全血样本常温保存的温度范围为15-35℃。
更进一步地，步骤(2)中pbmc细胞分离的具体步骤为：用生理盐水/pbs/hanks液将全血样本1：1稀释后，转移至含1倍体积ficoll淋巴细胞分离液的离心管内，离心，吸出中层白色的pbmc细胞转移至新的离心管中，以无血清dmem/1640离心清洗后，再用无血清的dmem/1640重悬细胞沉淀。
更进一步地，步骤(4)中所述的刺激物为任何可以引起细胞蛋白和基因调控变化的药物和激酶，包括但不限制于阿霉素、紫杉醇、干扰素、生长激素，刺激的方式为在细胞悬液中直接加入，目的是要刺激细胞发生变化，并进行后续的刺激物与被刺激细胞蛋白与基因变化的作用关系。
更进一步地，步骤(5)中细胞固定的具体步骤为：将步骤(3)中重悬的细胞加入等体积的2×固定液混匀，孵育后加入冰冷的cellstainingbuffer，然后离心分离，用冻存液重悬细胞。
更进一步地，步骤(6)的blockingmix溶液中包括fcreceptorblockingsolution和cellstaningbuffer，两者的体积比为1:10；cocktail溶液中含有抗体。
更进一步地，步骤(7)中的胞内磷酸化蛋白染色的具体步骤为：将表面抗体染色后的细胞用pbs混匀后放置冰上，然后加上预冷的甲醇混匀，放置冰上15min以上，离心弃上清，用cellstainingbuffer重悬，加入等体积的磷酸化抗体cocktail混匀。
更进一步地，步骤(8)中的金属元素标记物为ir或者rh。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明将金属元素标签标记的抗体与细胞表面抗原结合，将标记好的细胞与作为内参用于标准化的beads混合，以顺铂染色区分死细胞与活细胞，以免出现死细胞数量过多影响实验结果的分析与阐述；
(2)本发明可用于制备基于流式结合icp-ms单细胞蛋白检测的人外周血细胞样本，用于单细胞水平多蛋白信号的检测，本发明的方法处理方便，所用处理方法、试剂皆为常用方法、试剂，操作简便；
(3)本发明采用同位素金属标记法进行标记，克服了传统的荧光标记法存在的荧光信号易猝灭、易漂白，且非特异性背景高等不足之处；
(4)本发明提供的方法可以在一个细胞上标记30-60种金属，而现有技术只能在一个细胞上标记少量的金属；
(5)本发明能够通过金属同时标记细胞表面蛋白、内部蛋白、基因、mrna，而现有技术只能标记表面或者内部蛋白。
附图说明
图1为本发明中前处理方法的流程示意图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
如图1所示，基于流式结合icp-ms单细胞蛋白检测的样本前处理方法的步骤包括以下内容：
(一)人外周血样本的处理与冻存(提取单个核细胞-细胞活性染色-细胞刺激-细胞固定)
1.试剂准备。a.试剂平衡至常温：ficoll淋巴细胞分离液；ca2+/mg2+freepbs；2×fixationsolution(3.2％pfainpbs)；人红细胞裂解液(可选)；cellstainingbuffer(0.5％bsa+0.02％nan3inpbs)。b.需要预热的试剂：fbsfreedmem/1640(37℃)。c.将以下试剂冰上放置：含有10％dmso的cellstainingbuffer；cellstainingbuffer；cisplatin5mm；
2.全血样本的采集和运输。血液标本采集是分析前质量控制的重要环节。推荐用肝素或者柠檬酸盐作为抗凝剂，本实施例中采用肝素作为抗凝剂，按照医院里的标准用量来使用；edta易与金属标签元素螯合影响抗体标记，故而edta抗凝全血中提取出的pbmc样本可能需要额外的洗涤步骤。一般情况下，在4小时内将全血样本需要送达实验室，常温运输；(22摄氏度最佳，不要低于15度或者高于35度)；
3.pbmc细胞分离。用生理盐水/pbs/hanks液(三者的混合液，一般按照1:1:1的体积比混合后使用)将全血样本1：1稀释后，用一次性吸管缓缓将其加入含1倍体积ficoll淋巴细胞分离液的离心管内，注意将离心管倾斜，不要晃动，以免扰动液面影响分层。常温400g，刹车速度设为5，离心20min；吸出中层白色的pbmc细胞转移至新的15ml离心管中。再以预热的无血清dmem/1640，室温下300g，5min离心清洗细胞一遍后，用1ml预热的无血清的dmem/1640重悬细胞沉淀。若红细胞太多，可用红细胞裂解液处理，但对细胞活性影响较大，故若需对胞内蛋白磷酸化检测时谨慎使用。
4.细胞活性(顺铂)染色。短时间(5～10min)的处理过程中，顺铂无法进入活细胞内部，因此胞内顺铂信号很弱。而死细胞内大量蛋白与顺铂共价结合，会呈现较强的信号，可以此来区分细胞活性。细胞密度调至1×107/ml以下，与1ul终浓度为5um的顺铂混匀，37度，孵育5min；加入2～5倍体积(本实施例中采用的是3倍体积)的常温的cellstainingbuffer，混匀中止标记反应，常温300g，离心5min，去上清后用常温的cellstainingbuffer(固定用)重悬或预热的培养基(刺激用)进行重悬。活性染色步骤中用到的所有cellstainingbuffer中都含有0.5％bsa+0.02％nan3。
5.细胞刺激。将细胞转移至培养箱中培养20min(一般根据需要来选择培养的时间，15～30min均可)，使细胞恢复“静息”状态。并根据适当的刺激物及刺激方法对细胞进行分组刺激，本实施例中采用γ-干扰素作为刺激物，加入细胞溶液中混合均匀，然后用于细胞固定实验，一般建议在细胞刺激之后2小时内使用。
6.细胞固定。重悬混匀细胞悬液；加入等倍体积的2×固定液(含3.2％pfa的pbs)后立即用移液器吹打或涡旋振荡混匀，以减少细胞形成二聚体。室温孵育10min。加入4ml冰冷的cellstainingbuffer以减慢pfa固定反应。4℃，600g，离心5min。去上清。加入1ml冻存液(含10％dmso的cellstaningbuffer)重悬细胞，放置在冰上静置用于后续染色或置于冰上静置数分钟后放入-80度冰箱冻存。样本应注意避免反复冻融。在前处理过程中，通过在显微镜下，细胞计数的办法，分析每1000个细胞里有多少二聚体、三聚体等。
(二)金属标签标记的抗体与细胞结合(细胞表面抗体染色-细胞内磷酸化蛋白染色-单细胞标记)
1.表面抗体染色。对于用pfa固定、冻存的细胞，在冰上或者冷水浴中融化后，vortex重悬细胞，取1ml(106个)细胞溶液加入2mlcellstaningbuffer，600g5min离心去上清，加入50ulblockingmix(每份人pbmc(外周血单个核细胞)样本：5ulfcreceptorblockingsolution+50ulcsb，取其中的50ul)重悬，常温放置10min。每管加入50ulcocktail(单个样品的各抗体用量均为1.1ul，总体积55ul，取其中的5ul，见下表)混匀，常温30分钟。加入2mlcellstainingbuffer，常温500g离心5min，去上清并重复一次。
表1cocktail的组成成分
2.胞内磷酸化蛋白染色。经过前面的步骤之后，加入2mlpbs，500g离心5min，去上清。加入100ulpbs，轻轻votex混匀细胞，冰上放置3分钟。加入1ml预冷的甲醇，立即用枪头吹匀，冰上放置15min以上，加入2mlpbs，800g离心5分钟，弃上清。加入2mlcellstainingbuffer，800g离心5min，弃上清。每个样本用50ulcellstainingbuffer重悬，加入50ul磷酸化抗体cocktail(配制方法同表面抗体)，混匀，常温孵育30分钟。加入2mlcellstainingbuffer，800g离心5min，弃上清。
3.cellintercalation单细胞标记。加入2mlcellstainingbuffer，常温500g离心5min，去上清。加入100ulpbs重悬细胞，边振荡边逐滴加入1mlcellintercalation溶液(在fixandpermbuffer里加入终浓度为125nm的ir(铱元素)或者500nm的rh(铑元素)，每个样品用量1ml)。分别用2mlcellstaingbuffe及2ml水，800g离心5min，清洗细胞1次及3次后，加入1ml含有10％eqbeads的水重悬，将样本置于冰上。至此，样本前处理已完成，可用于后续检测。
基于金属同位素标记流式结合icp-ms的单细胞蛋白检测方法，其步骤为：
(1)样品标记：按照前述的方法采用金属元素标记的特异抗体，作为靶标表达水平的报告因子；其中用于标记的金属元素，其原子质量介于88-210da之间，常用于标记的金属元素为镧系金属元素，本实施例中分别采用ir(铱元素)或者rh(铑元素)对细胞进行标记。
(2)雾化处理：用蠕动泵将标记后的样品溶液均匀的送入雾化器进行雾化处理，去除其中的水分；雾化温度为200℃左右，雾化器中的液体流道为氩气环境，氩气流速0.15l/min。
(3)plasma离子化：单细胞雾化悬滴进入plasma后被气化、原子化、离子化，形成离子云；plasma内温度范围为5000k。
(4)去除未离子化物质及光子：利用偏转电场及加速电场的结合去除离子云流中存在的未离子化的物质及光子；
(5)icp-ms检测：用icp-ms观察单个细胞的原子质量谱(icp-ms检测全程在真空状态下进行)，将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据，并通过专业分析软件对获得的数据进行分析，从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。
传统流式细胞仪通过荧光染料标记抗体，继而抗体与抗原结合，在鞘液包绕下，通过流动室，形成单细胞悬液，经激光器，并将前向散射角、侧向散射角、荧光激发信号灯信息经由pmt传递给计算机分析。本实施应用金属元素标签代替荧光染料标签，经过nebulizer形成单细胞悬液，由plasmatorch将单细胞悬液离子化，并有tof进行检测。由于本发明技术的使用，使得单细胞蛋白水平检测结果数据量及数据维度激增，因而分析数据时，可以应用多种降维算法、聚类分析算法。
对于液体样本的分析，在进入plasma离子化之前需要尽可能地除去其中的水分。因此nebulizer的作用即为将样本雾化，随后通过加热至200-250℃左右的雾化室，进入plasma。nebulizer中心有一内置毛细管，为样本液体流道。毛细管管流道为氩气环境。氩气流速0.15-0.35l/min。当样本流出nebulizer尖端时，氩气流的剪切力使得样本流形成微小水珠，即雾化。本发明用流式细胞原理分离单个细胞，即细胞进入单细胞悬浮培养雾化，经由氩等离子体，共价键断裂，产生自由原子，并完成充电过程。icptorch炬管主要有三层结构，外层的叫做外管，其次是内管，中间的是中心管。外管中通的是大流量的氩气，叫做冷却气，冷却气提供给等离子体气体源源不断的ar原子，在等离子体中不断的电离放热，产生的ar离子在射频线圈中振荡碰撞，从而维持了很高的温度，伴随着大量离子留出等离子体，又有很多ar原子流入，从而达到了一种平衡。冷却气的流量大概为18l/min。在内管中流动的气体叫做辅助气，也是氩气，它的作用是给等离子体火焰向前的推力，实现不断的电离，也很好的了中心管，以免过高的温度使其熔化。辅助气的流量为～1l/min。中心管中流出的是从雾室排出的样品溶液的气溶胶。
单细胞雾化水珠流出雾化室后即进入icp。icptorch的原理是当在感应线圈上施加高频电场时，由于某种原因(如电火花等)在等离子体工作气体中部分电离产生的带电粒子在高频交变电磁场的作用下做高速运动，碰撞气体原子，使之迅速、大量电离，形成雪崩式放电，电离的气体在垂直于磁场方向的截面上形成闭合环形的涡流，在感应线圈内形成相当于变压器的次级线圈并同相当于初级线圈的感应线圈耦合，这种高频感应电流产生的高温又将气体加热、电离，并在管口形成一个火炬状的稳定的等离子体焰矩。其特点如下：
(1)工作温度高、同时工作气体为惰性气体(氩气)，因此原子化条件良好，有利于难熔化合物的分解及元素的激发，对大多数元素有很高的灵敏度；
(2)由于趋肤效应的存在，稳定性高，自吸现象小，测定的线性范围宽；
(3)由于电子密度高，所以碱金属的电离引起的干扰较小；
(4)icp属无极放电，不存在电极污染现象；
(5)icp的载气流速较低，有利于试样在中央通道中充分激发，而且耗样量也较少；
(6)采用惰性气体(氩气)作为工作气体，因而光谱背景干扰少
单细胞悬滴进入plasma时，plasma内温度范围为5000-10000k。因此进入plasma的单细胞悬滴被瞬间气化、原子化、离子化，由此单细胞转化为一团离子云。
离子化后的离子云流内包含大量未离子化的物质及光子等，若不滤除，易黏附于仪器结构，引起检测信号漂移。其中光子若抵达检测器将被误以为是待检测离子，引起检测结果准确度下降。因此，在进入tof检测前，需去除其中的未离子化物质及光子。利用偏转电场及加速电场的结合即可实现。采样锥作用是把来自等离子体中心通道的载气流，即离子流大部分吸入锥孔，进入第一级真空室。采样锥通常由ni、al、cu、pt等金属制成。
检测技术全程要求真空状态。因为结合的质谱技术要求离子具有较长的平均自由程，以便离子在通过检测器时与另外的离子、分子、原子碰撞的几率最低，真空度直接影响了离子传输效率、质谱波形及检测器寿命。
本发明应用四极管质量分析器的原理筛选原子质量。四极管的作用是基于在四根电极之间的空间产生一个随时间变化的特殊的电磁场，只有给定荷质比(m/z)的离子才能获得稳定的路径而通过极棒，从另一端出射，其它离子将被过分偏转，与极棒碰撞，并在极棒上被中和而丢失。通过四极管去除常见生物元素后，限定检测的原子量的检测范围(88-210da)，分辨率极高。筛选检测原子质量较大的原子，滤除原子量小的元素，保留较宽的原子量检测范围的同时，由于该类元素在细胞内的含量极低，所以信号的背景极低。金属元素同位素的选择不局限于镧系金属。可以是原子质量介于88-210da之间的且螯合物安全无毒可合成的任意元素。金属标签元素种类丰富，通道数量激增，信息量亦成倍增长。金属标签可以是通过金属螯合物与抗体结合。
基于飞行时间(timeofflight)原理进行检测。用感应耦合等离子质谱(icp-ms)观察单个细胞的原子质量谱，原子的质量与细胞表面和内部的信号分子数据呈现一一对应的关系，即检测到1个原子质量信号就代表有一个细胞表面和内部的信号分子，最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据，并通过专业分析软件对获得的数据进行分析，从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。
信号分子检测通道数量的增加，可实现从单个样本获取更大的信息量，为单细胞蛋白质组学的研究提供了新的手段。然而数据量及数据维度的激增使得原有传统流式的数据分析图无法很好地呈现数据结果。应用多种降维算法、聚类分析算法、分群算法等进行数据分析与可视化。目前已有大量相关算法文献报道。如spade、drevi、accense、xshift、visne以及phenograp。