一种快速检测海水中氮营养盐浓度的方法与流程

本发明涉及化学定量分析领域，具体的说是一种水质监测技术，特别是一种快速检测海水中氮营养盐浓度的方法。

背景技术：

海水中的氮营养盐——亚硝酸盐氮(no2^--n)、硝酸盐氮(no3^--n)、氨氮(nh4⁺-n)(以下简称“三氮”)是海洋监测的必检项目。用于测定海水中“三氮”浓度的方法很多，如紫外分光光度法、离子色谱法、化学发光法、流动注射法等，但这些方法存在灵敏度低、仪器不易携带、难以现场实时测定或操作复杂等问题。

我国对于海水中“三氮”浓度的测定可遵循《gb17378.4-2007海洋监测规范第4部分：海水分析》或《gb/t12763.4-2007海洋调查规范第4部分：海水化学要素调查》中相关方法，即：亚硝酸盐氮的萘乙二胺(重氮-偶氮)分光光度法，硝酸盐氮的镉(镉铜)柱还原法或锌镉还原法，氨氮的靛酚蓝分光光度法或次溴酸盐(钠)氧化法。其中，除测定氨氮的靛酚蓝分光光度法外，海水中“三氮”浓度的测定均基于亚硝酸盐氮的重氮-偶合分光光度法原理，即在酸性介质中，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，反应产物再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色偶氮染料，于一定波长下进行比色测定。硝酸盐氮经过还原，氨氮经过氧化得到亚硝酸盐氮，再通过亚硝酸盐氮的重氮-偶合分光光度法测得。如此，测定海水中“三氮”浓度，亚硝酸盐氮浓度可直接通过标准曲线获得，硝酸盐氮和氨氮的浓度则可通过差减法得到(先由硝酸盐氮或氨氮的标准曲线得到各自与水样中原有亚硝酸盐氮的浓度之和，再减去水样中原有亚硝酸盐氮浓度，得到硝酸盐氮或氨氮浓度)。采用上述方法测定海水中“三氮”可减小因方法原理不一引起的误差，应用最为广泛。

然而在上述方法中，所有亚硝酸盐的显色过程均需将磺胺溶液(盐酸溶液所配)和盐酸萘乙二胺溶液分两步加入到样品中，显色步骤繁琐。由于所用盐酸萘乙二胺溶液浓度较高(1g/l)，盐酸萘乙二胺溶液开始呈金黄色，随着时间推移颜色不断加深至暗棕色，若将其与磺胺溶液混合配制显色剂，则显色剂开始为黄色，随着时间推移颜色不断加深至深棕色。试剂空白的吸光度随时间推移越来越大，不仅带来较大的误差，也使得显色效果难以保证。因此国标方法中未将磺胺、盐酸溶液和盐酸萘乙二胺溶液混合配制显色剂，而是分别配制磺胺溶液(盐酸溶液所配)和盐酸萘乙二胺溶液，盐酸萘乙二胺溶液颜色过深时需重新配制。

另外，镉柱还原法通过镀铜镉柱将水样中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，此过程复杂、操作繁琐。镉柱还原法和次溴酸盐氧化法均涉及多次移取溶液，存在操作过程繁杂冗长、耗时费力的问题，尤其是对大洋海水进行现场测定时，大型自动仪器不宜在船上使用，繁琐的操作也不能适应船上的现场环境。

技术实现要素：

根据上述的不足之处，本发明的目的在于：提供一种快速检测海水中氮营养盐浓度的方法，此方法操作起来非常简单、快捷。

为实现上述目的，本发明的技术方案在于：一种快速检测海水中氮营养盐浓度的方法，包括如下步骤：

步骤1，海水样品的采集和预处理：采集待测海域的海水样品，分三份，其中一份经滤膜过滤后直接作为亚硝酸盐氮待测样品，另外两份加入碱性碳酸钠溶液，混匀、静置、絮凝沉淀，经滤膜过滤除去沉淀，再加入盐酸溶液调节ph至中性，分别作为硝酸盐氮和氨氮的待测样品；

步骤2，亚硝酸盐氮浓度测定：在事先加入1ml显色剂c1的比色瓶b1中加入9ml亚硝酸盐氮待测样品，混匀、静置，将该比色瓶b1放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定亚硝酸盐氮待测样品的吸光度值aw1；以9ml水代替上述亚硝酸盐氮待测样品，按亚硝酸盐氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab1；由aw1减去ab1得到的值通过亚硝酸盐氮标准工作曲线或相应线性回归方程得到待测样品中的亚硝酸盐氮的浓度；

步骤3，硝酸盐氮浓度测定：在事先加入1ml还原剂r1和1ml碱性溶液a1的比色瓶b2中加入7ml硝酸盐氮待测样品，混匀后放入恒温箱中(40±2)℃恒温(60±5)min后取出，立即置于冰水中冷却，然后加入1ml显色剂c2，混匀、静置，将该比色瓶b2放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定硝酸盐氮待测样品的吸光度值aw2，以7ml水代替上述硝酸盐氮待测样品，按硝酸盐氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab2；由aw2减去ab2得到的值通过硝酸盐氮的标准工作曲线或相应线性回归方程得到包含亚硝酸盐氮的硝酸盐氮浓度，将包含亚硝酸盐氮的硝酸盐氮浓度减去步骤2中测得的亚硝酸盐氮的浓度，得到待测样品中的硝酸盐氮浓度；

步骤4，氨氮浓度测定：在事先加入1ml氧化剂r2和1ml碱性溶液a2并混匀的比色瓶b3中加入7ml氨氮待测样品，混匀、静置(15±5)min，再加入1ml显色剂c3，再混匀、静置，将该比色瓶b3放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定氨氮待测样品的吸光度值aw3，以7ml无氨海水代替上述氨氮待测样品，按氨氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab3；由aw3减去ab3得到的值通过氨氮的标准工作曲线或相应线性回归方程得到包含有亚硝酸盐氮的氨氮浓度，将包含有亚硝酸盐氮的氨氮浓度减去步骤2中测得的亚硝酸盐氮的浓度，得到待测样品中氨氮浓度。

优选的是：显色剂c1由浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺和水混合配制而成，其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为(2.0±1.2)％(v/v)、(4±2)g/l、(0.05±0.01)g/l。

优选的是：还原剂r1由硫酸肼、硫酸铜、硫酸锌和水混合配制而成，其中，硫酸肼、硫酸铜、硫酸锌的浓度分别为(0.36±0.04)g/l、(0.22±0.04)g/l、(0.22±0.08)g/l。

优选的是：显色剂c2由浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺和水混合配制而成，其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为(8±2)％(v/v)、(4±2)g/l、(0.05±0.01)g/l。

优选的是：氧化剂r2由溴酸钾、溴化钾、浓盐酸和水混合配制而成，其中，溴酸钾、溴化钾、浓盐酸的浓度分别为(0.25±0.07)g/l、(0.36±0.07)g/l、(1.8±0.2)％(v/v)。

优选的是：显色剂c3由浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺和水混合配制而成，其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为(20±2)％(v/v)、(4±2)g/l、(0.05±0.01)g/l。

优选的是：人工海水，盐度为28‰-35‰。

优选的是：无氨海水的制备方法为：采集与待测水样成分相近的海水，用滤膜过滤后，加入碳酸钠调节ph为10，加入水煮沸至原体积，加入盐酸溶液调节ph值为7，再在无氨海水中加三氯甲烷，混匀，密闭贮存于聚乙烯瓶中。

优选的是：碱性溶液a1为氢氧化钠溶液，其中，氢氧化钠的浓度为(14.4±1.8)g/l。

优选的是：碱性溶液a2为氢氧化钠溶液，其中，氢氧化钠的浓度为(67.5±7.5)g/l。

本发明的有益效果在于：本发明中，前期尝试将浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺和水混合配制成单一显色剂，经优化，显色剂中所需盐酸萘乙二胺浓度较低(＜0.1g/l)，在此条件下混合配制显色剂，不仅显色效果比传统方法更好，且得到的单一显色剂为无色溶液，在密闭、避光、冰箱贮存的条件下，此单一显色剂的颜色和效果均能稳定一个月以上。因此，本发明实现了单一显色剂的配制。

将浓盐酸、磺胺和盐酸萘乙二胺配制得到单一显色剂，使得在测定过程中仅需添加一次显色剂即可完成显色过程，相比于传统方法中先加入磺胺溶液再加入盐酸萘乙二胺溶液分两步完成显色过程，本方法操作简便、快速；且单一显色剂呈无色，显色剂的颜色和效果稳定，确保了试验结果的准确性，同时避免了传统测定方法中盐酸萘乙二胺溶液因颜色逐渐变深而产生误差；本发明通过差减法测定硝酸盐氮和氨氮的浓度，操作方便，快捷；本发明操作简单、快速、省时省力、误差小，尤其适合海水中氮营养盐浓度的现场快速检测。

附图说明

图1是本发明中亚硝酸盐氮显色体系的波长扫描图；

图2是本发明中亚硝酸盐氮的标准工作曲线；

图3是本发明中硝酸盐氮标准工作曲线；

图4是本发明中氨氮标准工作曲线；

图5是本发明中用于测亚硝酸盐氮的显色剂c1的稳定性测试图；

图6是本发明中用于测硝酸盐氮的显色剂c2的稳定性测试图；

图7是本发明中用于测氨氮的显色剂c3的稳定性测试图；

图8是本发明中用于氨氮实验的氧化剂r2的稳定性测试图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

本发明涉及一种快速检测海水中氮营养盐浓度的方法，包括如下步骤：

步骤1，海水样品的采集和预处理：采集待测海域的海水样品，分三份，其中一份经滤膜过滤后直接作为亚硝酸盐氮待测样品，另外两份加入碱性碳酸钠溶液，混匀、静置、絮凝沉淀，经滤膜过滤除去沉淀，再加入盐酸溶液调节ph至中性，分别作为硝酸盐氮和氨氮的待测样品；

其中，所得待测样品均贮于聚乙烯瓶中，待测样品的分析工作原则上应在3h内进行，如需延迟至次日进行，则应尽快将其贮于冰箱中4℃冷藏至次日分析，如需延迟1日以上进行，则需将其快速冷冻至-20℃保存，融化后立即分析；

通过碱性碳酸钠溶液将ca²⁺、mg²⁺以沉淀物形式从海水样品中分离出去，可消除海水样品中ca²⁺、mg²⁺对硝酸盐氮和氨氮测定产生的干扰(硝酸盐还原、氨氧化过程均需在碱性条件下进行，海水样品中ca²⁺、mg²⁺会与碱反应产生絮状物或沉淀，对硝酸盐氮和氨氮测定产生干扰)，再用盐酸将样品ph调至中性，使得待测样品ph同标准系列和样品空白基本一致，避免由于碱性碳酸钠的加入导致待测样品ph变化，使测定结果产生误差。其中，硝酸盐氮和氨氮待测样品制备所用海水样品的量可依情况确定，但需保证碱性碳酸钠溶液和盐酸溶液的加入量之和与其相比时，可忽略不计。

步骤2，亚硝酸盐氮浓度测定：在事先加入1ml显色剂c1的比色瓶b1中加入9ml亚硝酸盐氮待测样品，混匀、静置，将该比色瓶b1放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定亚硝酸盐氮待测样品的吸光度值aw1；以9ml水代替上述亚硝酸盐氮待测样品，按亚硝酸盐氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab1；由aw1减去ab1得到的值通过亚硝酸盐氮标准工作曲线(采用人工海水配制标准系列)或相应线性回归方程得到待测样品中的亚硝酸盐氮的浓度。

步骤3，硝酸盐氮浓度测定：在事先加入1ml还原剂r1和1ml碱性溶液a1的比色瓶b2中加入7ml硝酸盐氮待测样品，混匀后放入恒温箱中(40±2)℃恒温(60±5)min后取出，立即置于冰水中冷却，然后加入1ml显色剂c2，混匀、静置，将该比色瓶b2放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定硝酸盐氮待测样品的吸光度值aw2，以7ml水代替上述硝酸盐氮待测样品，按硝酸盐氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab2；由aw2减去ab2得到的值通过硝酸盐氮的标准工作曲线(采用人工海水配制标准系列)或相应线性回归方程得到包含亚硝酸盐氮的硝酸盐氮浓度，将包含亚硝酸盐氮的硝酸盐氮浓度减去步骤2中测得的亚硝酸盐氮的浓度，得到待测样品中的硝酸盐氮浓度。

步骤4，氨氮浓度测定：在事先加入1ml氧化剂r2和1ml碱性溶液a2并混匀的比色瓶b3中加入7ml氨氮待测样品，混匀、静置(15±5)min，再加入1ml显色剂c3，再混匀、静置，将该比色瓶b3放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定氨氮待测样品的吸光度值aw3，以7ml无氨海水代替上述氨氮待测样品，按氨氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab3；由aw3减去ab3得到的值通过氨氮的标准工作曲线(采用人工海水配制标准系列)或相应线性回归方程得到包含有亚硝酸盐氮的氨氮浓度，将包含有亚硝酸盐氮的氨氮浓度减去步骤2中测得的亚硝酸盐氮的浓度，得到待测样品中氨氮浓度。

氨氮浓度测定过程中无氨海水的使用至关重要，这是因为氨氮测定受水中氨的影响较大，采用无氨海水测定样品空白，可避免其中的氨对实验结果产生误差。

其中，显色剂c1为由浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺和水混合配制而成，其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为(2.0±1.2)％(v/v)、(4±2)g/l、(0.05±0.01)g/l。其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺优选的浓度分别为2％(v/v)、4g/l、0.05g/l。

还原剂r1由硫酸肼、硫酸铜、硫酸锌和水混合配制而成，其中，硫酸肼、硫酸铜、硫酸锌的浓度分别为(0.36±0.04)g/l、(0.22±0.04)g/l、(0.22±0.08)g/l。其中，硫酸肼、硫酸铜、硫酸锌优选的浓度分别为0.36g/l、0.22g/l、0.22g/l。

显色剂c2由浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺和水混合配制而成，其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为(8±2)％(v/v)、(4±2)g/l、(0.05±0.01)g/l。其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺优选的浓度分别为8％(v/v)、4g/l、0.05g/l。

氧化剂r2由溴酸钾、溴化钾、浓盐酸和水混合配制而成，其中，溴酸钾、溴化钾、浓盐酸的浓度分别为(0.25±0.07)g/l、(0.36±0.07)g/l、(1.8±0.2)％(v/v)。其中，溴酸钾、溴化钾、浓盐酸优选的浓度分别为0.25g/l、0.36g/l、1.8％(v/v)。

显色剂c3由浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺和水混合配制而成，其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为(20±2)％(v/v)、(4±2)g/l、(0.05±0.01)g/l。其中，浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺优选的浓度分别为20％(v/v)、4g/l、0.05g/l。

对于显色剂c1/c2/c3来说，浓盐酸含量与显色反应前体系的酸碱度有关。因显色反应需在酸性条件下进行，而硝酸盐还原和氨氧化阶段均需在碱性条件下进行，且其中的碱无法完全反应，因此显色剂c2和c3中的盐酸有一部分用于中和前面剩余的碱，其中浓盐酸含量较高。显色剂c1用于亚硝酸盐测定，体系在显色反应前为中性，因此显色剂c1中的盐酸只需提供显色反应所需的酸性条件，其中浓盐酸含量较低。

人工海水和无氨海水。其中，人工海水以氯化钠和水配制，盐度为28‰-35‰。无氨海水的制备方法为：采集与待测水样成分相近的海水，用滤膜过滤后，加入碳酸钠调节ph为10，加入水煮沸至原体积，加入盐酸溶液调节ph值为7，再在无氨海水中加三氯甲烷，混匀，密闭贮存于聚乙烯瓶中。加入三氯甲烷的作用是抑制水中微生物作用，防止微生物代谢进行氮的转化，使结果产生偏差。

碱性溶液a1为氢氧化钠溶液，其中，氢氧化钠的浓度为(14.4±1.8)g/l。

碱性溶液a2为氢氧化钠溶液，其中，氢氧化钠的浓度为(67.5±7.5)g/l。

操作过程中，氧化剂、还原剂和碱性溶液均需要分别配置。这是因为，例如氨氮的氧化剂r2由溴酸钾、溴化钾和盐酸溶液混合配制而成，三者反应生成溴水，溴水性质稳定，溴水与碱性溶液a2反应生成次溴酸钠，次溴酸钠可在碱性条件下将氨氧化为亚硝酸盐，但次溴酸钠溶液性质不稳定，提前混合配制会影响氧化效果；再例如硝酸盐氮测定中还原剂r1由三种硫酸盐溶液(硫酸肼、硫酸铜、硫酸锌)组成，虽然其性质稳定，但若与碱性溶液a1混合，可能会影响还原效果，因此选择分别配制，现用时混合。

实施例1

1、测试水样：青岛某海域中的海水水样。

2、亚硝酸盐氮显色体系最大吸收波长测定，结果如图1所示，最终选择的波长为(540±3)nm，每次测试选择统一波长即可。

3、配制试剂

3.1、亚硝酸盐氮标准贮备溶液(100mg/l-n)：称取0.4926g经110℃烘干1h并于干燥器中冷却的亚硝酸钠(nano2，优级纯)溶于水、定容至1000ml、再加入1ml三氯甲烷(chcl3，分析纯)配制而成，装于棕色试剂瓶中、冰箱贮存，至少稳定半年。

3.2、亚硝酸盐氮标准系列溶液(人工海水配制)：由100mg/l-n亚硝酸盐氮标准贮备液以人工海水逐级稀释而得，其中亚硝酸盐氮(no2^--n)浓度分别为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/l。

3.3、硝酸盐氮标准贮备溶液(100mg/l-n)：称取0.7215g经110℃烘干1h并于干燥器中冷却的硝酸钾(kno3，优级纯)溶于水、定容至1000ml、再加入1ml三氯甲烷(chcl3，分析纯)配制而成，装于棕色试剂瓶中、冰箱贮存，至少稳定半年。

3.4、硝酸盐氮标准系列溶液(人工海水配制)：由100mg/l-n硝酸盐氮标准贮备液以人工海水逐级稀释而得，其中硝酸盐氮(no3^--n)浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/l。

3.5、氨氮标准贮备溶液(100mg/l-n)：称取0.4716g经110℃烘干1h并于干燥器中冷却的硫酸铵((nh4)2so4，优级纯)溶于水、定容至1000ml、再加入1ml三氯甲烷(chcl3，分析纯)配制而成，装于棕色试剂瓶中、冰箱贮存，至少稳定半年。

3.6、氨氮标准系列溶液(人工海水配制)：由100mg/l-n氨氮标准贮备液以模拟海水逐级稀释而得，其中氨氮(nh4⁺-n)浓度分别为0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08mg/l。

3.7、盐酸萘乙二胺贮备溶液：2g/l，通过称取一定质量的盐酸萘乙二胺(c12h14n2·2hcl，分析纯)溶于水配制而成，避光、冰箱中贮存，约可稳定一个月，颜色过深时需重新配制。

3.8、显色剂c1：由浓盐酸(hcl，分析纯)、磺胺(c6h8o2n2s，分析纯)、盐酸萘乙二胺(c12h14n2·2hcl，分析纯)和水混合配制而成，其中浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为：2％(v/v)、4g/l、0.05g/l。配制显色剂c1时，先于水中加入一定量浓盐酸，再称取一定量的磺胺溶于其中，然后移入一定体积的盐酸萘乙二胺贮备溶液，最后以水定容。或先于少量水中加入称取的磺胺，此时磺胺难溶于水，再加入浓盐酸使磺胺完全溶解，最后移入盐酸萘乙二胺贮备溶液，以水定容，也可。

3.9、显色剂c2：由浓盐酸(hcl，分析纯)、磺胺(c6h8o2n2s，分析纯)、盐酸萘乙二胺(c12h14n2·2hcl，分析纯)和水混合配制而成，其中浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为：8％(v/v)、4g/l、0.05g/l。配制显色剂c2的方法同显色剂c1。

3.10、显色剂c3：由浓盐酸(hcl，分析纯)、磺胺(c6h8o2n2s，分析纯)、盐酸萘乙二胺(c12h14n2·2hcl，分析纯)和水混合配制而成，其中浓盐酸、磺胺、盐酸萘乙二胺的浓度分别为：20％(v/v)、4g/l、0.05g/l。配制显色剂c3的方法同显色剂c1。

3.11、氢氧化钠贮备溶液：约500g/l，通过称取约250g氢氧化钠(naoh，分析纯)溶于700ml左右的水中，加热煮沸至500ml左右，冷却至室温后，贮存于聚乙烯瓶中，得到浓度约为500g/l的氢氧化钠贮备溶液，此溶液需标定。

氢氧化钠贮备溶液的标定：先取一定体积氢氧化钠贮备溶液稀释62.5倍，得到浓度约为8g/l的待标氢氧化钠溶液，称取1g预先经105℃烘干2h并于玻璃干燥器中恒重的邻苯二甲酸氢钾即khp(khc8h4o4，基准试剂)于250ml锥形瓶中，加入80ml左右的水，摇晃至溶解。加入2滴酚酞指示剂(10g/l)，用待标氢氧化钠溶液滴定至微红色，30s不褪色即为终点。平行标定三次，记录所用待标氢氧化钠溶液体积(单位：ml)，取平均值。待标液中氢氧化钠浓度(单位：g/l)通过以下公式计算：

上述待标液是由所配氢氧化钠贮备溶液稀释62.5倍所得，因此氢氧化钠贮备溶液中氢氧化钠浓度(单位：g/l)为：

3.12、酚酞指示剂：10g/l，通过将1g酚酞溶于约60ml乙醇(c2h6o，分析纯)中，再用乙醇定容，得到100ml酚酞指示剂，避光、常温下可保存约3个月。

3.13、碱性碳酸钠溶液：由碳酸钠(na2co3，分析纯)、氢氧化钠贮备溶液(约500g/l)和水混合配制而成，其中碳酸钠和氢氧化钠浓度分别为(30±2)g/l和(112±8)g/l。

3.14、碱性溶液a1：14.4g/l，通过移取一定量氢氧化钠贮备溶液(约500g/l)稀释得到。

3.15、碱性溶液a2：67.5g/l，通过移取一定量氢氧化钠贮备溶液(约500g/l)稀释得到。

3.16、还原剂r1：由硫酸肼(n2h2·h2so4，分析纯)、硫酸铜(cuso4，分析纯)、硫酸锌(znso4，分析纯)和水混合配制而成，其中硫酸肼、硫酸铜、硫酸锌的浓度分别为：0.36g/l、0.22g/l、0.22g/l。

3.17、氧化剂r2：由溴酸钾(kbro3，分析纯)、溴化钾(kbr，分析纯)、浓盐酸(hcl，分析纯)和水混合配制而成，其中溴酸钾、溴化钾、浓盐酸的浓度分别为：0.25g/l、0.36g/l、1.8％(v/v)。

3.18、无氨海水：通过采集与待测水样成分相近的海水，用0.45μm滤膜过滤后，加入少许无水碳酸钠(na2co3，分析纯)调节ph约为10，加入水煮沸至原体积，加入盐酸溶液调节ph值为7，再在每升无氨海水中加1ml三氯甲烷，混匀，密闭贮存于聚乙烯瓶中。

3.19、盐酸溶液为盐酸(1+9)溶液：通过1份体积的浓盐酸(hcl，分析纯)和9份体积的水混合得到。

3.20、水：除另作说明，实验中所述“水”为超纯水，亦可用二次蒸馏水代替。

具体的说，显色剂c1、c2、c3以及还原剂r1为无色溶液，在避光、冰箱贮存的条件下均可稳定至少1个月。对显色剂c1、c2、c3分别进行了显色稳定性的测试，结果显示在35天时，均相对稳定，为了确保试验的准确性，显色剂c1、c2、c3的保存期限为1个月。

氧化剂r2为黄色溴水溶液，经测试，其在避光、冰箱贮存条件下也可稳定1个月以上；碱性溶液a1、a2为无色溶液，在常温下可长期保存。

以上所有溶液均需密闭保存。

4、绘制标准工作曲线

4.1、亚硝酸盐氮标准工作曲线的线性范围为0-0.05mg/l，其绘制遵循如下步骤：于一组6个10ml比色瓶(事先分别加入1ml显色剂c1)中，依次分别加入9ml亚硝酸盐氮标准系列溶液，其中亚硝酸盐氮(no2^--n)浓度分别为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/l，混匀、静置20min后，将该组比色瓶依次放入比色瓶槽中、以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定吸光度值，最后以标准系列中亚硝酸盐氮(no2-n)浓度为横坐标、校正吸光度(扣除0浓度的试剂空白)为纵坐标，绘制亚硝酸盐氮的标准工作曲线，并得到亚硝酸盐氮的线性回归方程。

如图2所示的亚硝酸盐氮标准工作曲线(0-0.05mg/l)为：y＝6.1686x-0.0014，r²＝0.9998。

4.2、硝酸盐氮标准工作曲线的线性范围为0-0.20mg/l，其绘制遵循如下步骤：于一组6个比色瓶(事先分别加入1ml还原剂r1和1ml碱性溶液a1，不必混匀)中，依次分别加入7ml硝酸盐氮标准系列溶液，其中硝酸盐氮(no3^--n)浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/l，混匀后放入恒温箱中40℃恒温1h后取出，立即置于冰水中冷却，2min后取出，然后依次加入1ml显色剂c2，混匀、静置20min，将该组比色瓶依次放入比色瓶槽中、以比色瓶中加入10ml水作参比、在(540±3)nm波长下测定吸光度值，最后以标准系列中硝酸盐氮(no3-n)浓度为横坐标、校正吸光度(扣除0浓度的试剂空白)为纵坐标，绘制硝酸盐氮的标准工作曲线，并得到硝酸盐氮的线性回归方程。

如图3所示的硝酸盐氮标准工作曲线(0-0.20mg/l)为：y＝4.0364x+0.0102，r²＝0.9966。

4.3、氨氮标准工作曲线的线性范围为0-0.08mg/l，其绘制遵循如下步骤：于一组6个比色瓶(事先加入1ml氧化剂r2和1ml碱性溶液a2并混匀)中，分别加入7ml氨氮标准系列溶液，其中氨氮(nh4⁺-n)浓度分别为0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08mg/l，混匀、静置15min后，再依次加入1ml显色剂c3，再混匀、静置20min后，将该组比色瓶依次放入比色瓶槽中、以比色瓶中加入10ml水作参比、在(540±3)nm波长下测定吸光度值，最后以标准系列中氨氮(nh4⁺-n)浓度为横坐标、校正吸光度(扣除0浓度的试剂空白)为纵坐标，绘制氨氮的标准工作曲线，并得到氨氮的线性回归方程。

如图4所示的氨氮标准工作曲线(0-0.08mg/l)为：y＝3.6316x+0.0122，r²＝0.9958。

5、测定“三氮”浓度

5.1、海水样品的采集和预处理：采集待测海域的海水样品，分三份，其中一份经0.45μm滤膜过滤后直接作为亚硝酸盐氮待测样品，另外两份每100ml加入2ml碱性碳酸钠溶液，混匀、静置、絮凝沉淀，经0.45μm滤膜过滤除去沉淀，再加入少量盐酸溶液调节ph至中性，分别作为硝酸盐氮和氨氮的待测样品；所得待测样品均贮于聚乙烯瓶中，待测样品的分析工作在3h内进行。

5.2、亚硝酸盐氮浓度测定：在事先加入1ml显色剂c1的比色瓶b1中加入9ml亚硝酸盐氮待测样品，混匀、静置20min-2h(一般情况下20min后显色即能达到完全，在2h内颜色稳定，为提高操作的效率，可以选择静置20min后测定其吸光度值，以下同)后将该比色瓶b1放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定亚硝酸盐氮待测样品的吸光度值aw1；以9ml水代替上述亚硝酸盐氮待测样品，按亚硝酸盐氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab1；由aw1减去ab1得到的值通过亚硝酸盐氮标准工作曲线或相应线性回归方程得到待测样品中的亚硝酸盐氮的浓度。

经计算得到的青岛某海域的海水样品中的亚硝酸盐氮浓度为：3.5μg/l。

5.3、硝酸盐氮浓度测定：在事先加入1ml还原剂r1和1ml碱性溶液a1(不必混匀)的比色瓶b2中加入7ml硝酸盐氮待测样品，混匀后放入恒温箱中(40±2)℃恒温(60±5)min后取出，立即置于冰水中冷却，1-2min后取出，然后加入1ml显色剂c2，混匀、静置20min-2h后，将该比色瓶b2放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定硝酸盐氮的吸光度值aw2，以7ml水代替上述硝酸盐氮待测样品，按硝酸盐氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab2；由aw2减去ab2得到的值通过硝酸盐氮的标准工作曲线或相应线性回归方程得到包含亚硝酸盐氮的硝酸盐氮浓度，将包含亚硝酸盐氮的硝酸盐氮浓度减去步骤2中测得的亚硝酸盐氮的浓度，得到待测样品中的硝酸盐氮浓度。

经计算得到的青岛某海域的海水样品中的硝酸盐氮浓度为：25.7μg/l

5.4、氨氮浓度测定：在事先加入1ml氧化剂r2和1ml碱性溶液a2并混匀的比色瓶b3中加入7ml氨氮待测样品，混匀、静置(15±5)min，再加入1ml显色剂c3，再混匀、静置20min-2h，将该比色瓶b3放入比色瓶槽中，以比色瓶中加入10ml水作参比，在(540±3)nm波长下测定吸光度值aw3，以7ml无氨海水代替上述氨氮待测样品，按氨氮相同步骤测定分析空白吸光度值ab3；由aw3减去ab3得到的值通过氨氮的标准工作曲线(采用人工海水配制标准系列)或相应线性回归方程得到包含有亚硝酸盐氮的氨氮浓度，将包含有亚硝酸盐氮的氨氮浓度减去步骤2中测得的亚硝酸盐氮的浓度，得到待测样品中氨氮浓度。

经计算得到的青岛某海域的海水样品中的氨氮浓度为：12.8μg/l。

6、检出限

于人工海水中分别加入少量亚硝酸盐氮/硝酸盐氮/氨氮标准溶液，相同条件下分别检测7次浓度值，并计算标准偏差，得到亚硝酸盐氮/氨氮/硝酸盐氮标准偏差。根据三倍标准偏差除以标准曲线斜率的方法计算得出亚硝酸盐氮/硝酸盐氮/氨氮的检出限：

d.l.＝3s/k

式中，s：对同一样本重复测定至少7次的标准偏差，

k：标准工作曲线的斜率。

经计算，亚硝酸盐氮的检出限：s＝0.0037，k＝6.1686，则d.l.(亚硝酸盐氮)＝3s/k＝1.8×10^-3mg/l。

而海洋标准法计算得到的d.l.(亚硝酸盐氮)＝2.9×10^-3mg/l。

硝酸盐氮检出限：s＝0.0032，k＝4.0364，则d.l.(硝酸盐氮)＝3s/k＝2.4×10^-3mg/l。

而海洋标准法计算得到的d.l.(硝酸盐氮)：①镉柱还原法，d.l.(硝酸盐氮)2.5×10^-3mg/l；锌镉还原法，d.l.(硝酸盐氮)＝3.1×10^-3mg/l。

氨氮检出限：s＝0.0040，k＝3.6316，则d.l.(氨氮)＝3s/k＝3.3×10^-3mg/l。

需要说明的是，氨氮检出限在海洋标准法中无此规定，且他人文章中无数据供参考。

通过上述检出限的比较，说明本发明具有检出限低(亦即灵敏度高)的优点，可用于低浓度氮营养盐海域水样检测，适用于对海水中氮营养盐(亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、氨氮)进行现场检测。

与传统方法相比，本发明的方法具体的说有以下优点：

亚硝酸盐氮检测：方法原理与海洋标准法相同，但混合配制了显色剂，实现了一步显色，且显色剂无色(试剂空白低)、稳定时间长；另外方法检出限更低(亦即灵敏度更高)，可用于低浓度氮营养盐海域水样的现场测定。

硝酸盐氮检测：将硫酸肼还原法应用于海水中硝酸盐氮的检测，避免了传统镉还原法中镉柱制备等复杂操作，方法简单、快速；另外方法检出限低(亦即灵敏度高)，可用于低浓度氮营养盐海域水样的现场测定。

氨氮检测：方法原理与海洋标准法相同，但混合配制了溴水(性质稳定)，精简了一个步骤；无需单独配制次溴酸盐溶液再加入到反应容器中，直接在比色瓶中进行氨的氧化过程，操作简单、快速；另外方法检出限低(亦即灵敏度高)，可用于低浓度氮营养盐海域水样的现场测定。

从图5-8可知，用于本发明的显色剂c1、显色剂c2、显色剂c3和氧化剂r2的稳定性好，不需要现配现用，大大节省了现场测定的时间。