本发明涉及一种利用hplc-ms/ms测定草莓果实中花色苷组分及含量的方法，属于液相色谱和质谱分析
技术领域：
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背景技术：
：花色苷属于水溶性类黄酮，广泛存在于水果和蔬菜中，使植物呈现出蓝色、紫色和红色。花色苷对人体具有多种保健功能，具有预防心血管疾病、控制肥胖和抗肿瘤等功能。草莓果实富含花色苷、色泽亮丽、香气浓郁、营养丰富，被誉为“水果皇后”，栽培面积和产量仅次于葡萄，属于第二大浆果。目前主栽草莓品种均为红色，野生草莓资源中果实颜色较为丰富，存在暗红色、红色、鲜红色、黄色、白色等类型。目前育种家们开始关注以果实颜色为选育目标的草莓品种选育，首次培育出了白色和粉色大果草莓品种，具有一定的新奇性，丰富市场需求。花色苷含量决定草莓果实颜色，草莓果实中花色苷成分复杂，存在多种花色苷单体物质，目前的研究表明不同的草莓资源中花色苷的成分和含量有很大差别，明确草莓果实中花色苷种类和含量是果实颜色种质创新的前提。目前花色苷的测定方法主要是分光光度测定法和高效液相色谱法。分光光度测定法存在分辨率较低、误差较大、只能测定总花色苷含量、无法确定具体的花色苷成分和构成等缺点，只适合花色苷总含量的初步测定。高效液相色谱法克服了以上缺点，具有很高的灵敏性，同时对花色苷物质纯化和分离有较高的要求。目前高效液相色谱法测定花色苷还存在很大的不足：花色苷成分复杂，分离难度大，需要建立较为复杂的梯度洗脱条件；花色苷提取前处理繁琐，会造成部分花色苷物质丢失，使得一些含量很低的花色苷组分很难检测出来；高效液相色谱法确定具体物质成分时需要有对应的标准对照品，而标准对照品价格极高。目前通常采用连接质谱的hplc(hplc-ms/ms)分析花色苷成分，质谱仪可以提供相同保留时间的物质结构信息，推测具体的花色苷类型。因此，选择合适的色谱柱和流动相，摸索出合适的梯度洗脱条件和质谱检测条件，建立一套草莓果实中花色苷分离和检测方法具有很重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种有效提取、分析草莓果实中花色苷成分和含量的方法。为达到上述目的，本发明提供一种利用hplc-ms/ms测定草莓果实中花色苷组分及含量的方法，其步骤包括：(1)取成熟期草莓果实，用锡箔纸包埋后液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。(2)取步骤(1)的草莓果实，液氮充分研磨，精确称取样品0.5g，加入1ml1％盐酸-甲醇(v/v)溶液，避光超声波萃取30min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液经0.22um有机滤膜过滤，即配制成样品溶液。(3)取步骤(2)的样品溶液，采用串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，质量分析器为三重四级杆-飞行时间质谱仪(absciextripletof5600+)，hplc为岛津高效液相色谱仪lc20a，色谱条件为：色谱柱：zorbaxsb-c18柱4.6×250mm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样体积5μl，洗脱方式为梯度洗脱，流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为5％(v/v)甲酸水溶液，b为甲醇溶液，检测波长为520nm，记录时间为35min；质谱条件为：电喷雾电离源(esi)，正离子检测，全离子扫描范围(m/z)为200～1500，离子源补偿电压为5.5kv，源温度为500℃，离子源气体1(空气)和气体2(空气)电压为50psi，干燥气压(n2)为35psi，去簇电压为80v，撞击能量为5v，驻留时间为250ms，二级采集模式下撞击能量和驻留时间分别为35±15v和50ms。(4)配制花葵素-3-葡糖苷标准溶液，按照步骤(3)的液相色谱条件高效液相色谱分析绘制标准曲线。(5)按照步骤(3)的液相色谱条件，取草莓果实样品溶液进行高效液相色谱分析，用标准曲线法计算出草莓果实中花葵素-3-葡糖苷含量，同时根据峰面积用花葵素-3-葡糖苷的标准曲线法计算其它花色苷物质含量。步骤(3)中所述的梯度洗脱为：0～5min，流动相b体积比从100～90％；5～10min，流动相b体积比从90～75％；10～15min，流动相b体积比从75～65％；15～20min，流动相b体积比从65～50％；20～25min，流动相b体积比从50～70％；25～30min，流动相b体积比从70～100％。步骤(4)中配制花葵素-3-葡糖苷标准溶液的步骤为：准确称取1mg花葵素-3-葡糖苷标准品，溶于1ml1％盐酸-甲醇(v/v)溶液；取1ml标准溶液逐级稀释制得标准溶液浓度分别为500、250、100、50、25、10mg/l。本发明的有益效果是：(1)本方法采用的花色苷提取方法简单、高效，草莓果实液氮速冻可防止花色苷降解，充分研磨和超声波处理可使组织充分破碎，花色苷物质在酸性甲醇溶液中有较高的溶解度和稳定性。(2)本方法采用的液相色谱和质谱条件特别适合分离和检测花色苷，具有分辨率高、可靠性高、精密度高和重复性高的特点，比较多种c18色谱柱发现zorbaxsb-c18柱4.6×250mm更适合分离花色苷，比较多种流动相发现5％甲酸和甲醇组合效果最佳，通过配制不同的流动相比例优化了梯度洗脱条件，同时也摸索出了适合的检测花色苷物质的质谱条件。本方法通过液质联用从草莓果实中检测出8种花色苷物质、分离度好、峰型完美、无杂质。首次从草莓中检测出了芍药素-3-葡萄苷、芍药素-丙二酰葡糖苷和芍药素-3-甲基丙二酰葡糖苷。(3)本方法通过配制花葵素-3-葡糖苷标准品溶液，用标准曲线法计算出草莓果实中花葵素-3-葡糖苷含量。相关系数、回收率试验、重复性试验表明该方法测定花色苷含量具有稳定性、可靠性和精确性。附图说明图1是森林草莓果实花色苷在520nm处的hplc峰图，其中峰序号为：1、花青素-3-葡糖苷、花葵素-3-葡糖苷、芍药素-3-葡糖苷、花青素-丙二酰葡糖苷、花葵素-丙二酰葡糖苷、芍药素-丙二酰葡糖苷、花葵素-3-甲基丙二酰基葡糖苷、芍药素-3-甲基丙二酰基葡糖苷。图2是栽培草莓果实花色苷在520nm处的hplc峰图，其中峰序号为：1、花青素-3-葡糖苷、花葵素-3-葡糖苷、芍药素-3-葡糖苷、花青素-丙二酰葡糖苷、花葵素-丙二酰葡糖苷、芍药素-丙二酰葡糖苷、花葵素-3-甲基丙二酰基葡糖苷、芍药素-3-甲基丙二酰基葡糖苷。图3是草莓花色苷物质二级质谱图，包括：花青素-3-葡糖苷、花葵素-3-葡糖苷、芍药素-3-葡糖苷、花青素-丙二酰葡糖苷、花葵素-丙二酰葡糖苷、芍药素-丙二酰葡糖苷、花葵素-3-甲基丙二酰基葡糖苷、芍药素-3-甲基丙二酰基葡糖苷。具体实施方式1、仪器与试剂1.1仪器：超声波清洗仪，离心机，三重四级杆-飞行时间质谱仪(absciextripletof5600+)，岛津高效液相色谱仪lc20a，agilent1260高效液相色谱仪，agilentvwd检测器。1.2试剂：标准品花葵素-3-葡糖苷购自sigma公司，甲醇、甲酸均为色谱级。2、方法与结果实施例1hplc条件摸索，包括以下条件：(1)色谱柱选择：花色苷分离通常采用c18色谱柱，本发明考察了zorbaxsb-c18柱4.6×250nm和eclipsexdb-c18柱4.6×250mm，发现zorbaxsb-c18柱适合分离花色苷，分离度高、峰型好。(2)流动相选择：花色苷分离通常选择酸性的甲醇或乙睛，采用梯度洗脱的方式，本发明提取花色苷采用的是甲醇，因此流动相b选择甲醇效果优于乙睛，流动相a选择的是甲酸水溶液，选择不同的甲酸浓度(0.5％、1％、2％、3％、4％、5％)发现5％最为合适，超过5％的甲酸溶液对色谱柱有伤害。(3)梯度洗脱条件：梯度洗脱条件是能否有效分离花色苷的关键，通过多次改变流动相的比例和梯度洗脱时间摸索出了最优的梯度洗脱条件：0～5min，流动相b体积比从100～90％；5～10min，流动相b体积比从90～75％；10～15min，流动相b体积比从75～65％；15～20min，流动相b体积比从65～50％；20～25min，流动相b体积比从50～70％；25～30min，流动相b体积比从70～100％。(4)柱温选择30℃，流速1.0ml/min，进样体积5μl，检测波长为520nm。通过以上最优液相色谱条件，获得了草莓果实(森林草莓和栽培草莓)花色苷色谱图，见图1和图2。实施例2hplc-ms/ms测定森林草莓果实中花色苷组分，包括如下步骤：(1)取成熟期红果森林草莓果实，用锡箔纸包埋后液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。(2)取步骤(1)的草莓果实，液氮充分研磨，精确称取样品0.5g，加入1ml1％盐酸-甲醇(v/v)溶液，避光超声波萃取30min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液经0.22um有机滤膜过滤，即配制成样品溶液。(3)取步骤(2)的样品溶液，采用串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，质量分析器为三重四级杆-飞行时间质谱仪(absciextripletof5600+)，hplc为岛津高效液相色谱仪lc20a，色谱条件为：色谱柱：zorbaxsb-c18柱4.6×250mm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样体积5μl，洗脱方式为梯度洗脱，流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为5％(v/v)甲酸水溶液，b为甲醇溶液，检测波长为520nm，记录时间为35min；质谱条件为：电喷雾电离源(esi)，正离子检测，全离子扫描范围(m/z)为200～1500，离子源补偿电压为5.5kv，源温度为500℃，离子源气体1(空气)和气体2(空气)电压为50psi，干燥气压(n2)为35psi，去簇电压为80v，撞击能量为5v，驻留时间为250ms，二级采集模式下撞击能量和驻留时间分别为35±15v和50ms。梯度洗脱条件为：0～5min，流动相b体积比从100～90％；5～10min，流动相b体积比从90～75％；10～15min，流动相b体积比从75～65％；15～20min，流动相b体积比从65～50％；20～25min，流动相b体积比从50～70％；25～30min，流动相b体积比从70～100％。(4)质谱结果用peakview2.2色谱分析软件进行分析，通过一级和二级分子量推测花色苷色谱图中各个峰对应的具体物质见表1，花青素-3-葡糖苷、花葵素-3-葡糖苷、芍药素-3-葡糖苷、花青素-丙二酰葡糖苷、花葵素-丙二酰葡糖苷、芍药素-丙二酰葡糖苷、花葵素-3-甲基丙二酰基葡糖苷、芍药素-3-甲基丙二酰基葡糖苷的子离子质谱裂解见图3。表1实施例2的hplc-ms/ms分析草莓果实中花色苷物质成分实施例3标准曲线绘制及草莓果实中花色苷含量测定(1)准确称取1mg花葵素-3-葡糖苷标准品，溶于1ml1％盐酸-甲醇(v/v)溶液；取1ml标准溶液逐级稀释制得标准溶液浓度分别为500、250、100、50、25、10mg/l。(2)取花葵素-3-葡糖苷标准溶液，浓度从低到高自动进样，每个浓度重复3次，经高效液相色谱分析，以峰面积对浓度绘制标准曲线，并计算相关系数(见表2)，色谱条件同实施例2。(3)取14个草莓品种，样品处理方法和色谱条件同实施例2，自动进样，每个样品重复三次，测定各花色苷成分的峰面积，根据峰面积用花葵素-3-葡糖苷的标准曲线法计算各花色苷物质含量(见表3)。表2花色苷标样标准曲线的回归分析标准品标准曲线相关系数回收率花葵素-3-葡糖苷y＝16.969x-56.5140.999198.5％表314种草莓品种果实花色苷含量(μg/g)当前第1页12