基于铁(ii)与邻菲罗啉体系和脂质体包裹葡萄糖的免疫分析方法，纳米材料和生物分析技术领域。
背景技术：
在畜牧业和农业中过度使用抗生素使得大量食品存在抗生素残留，并对人们的健康具有潜在威胁。对食品中的抗生素残留物的安全检测的重要性极大地推动了对简便型，高灵敏且低成本的生物分析方法的需求。目前为止，各种各样的基于不同信号产生原理的免疫方法和策略已经报道，比如：基于电化学的方法、基于电化学发光的方法、基于化学发光的方法、比色方法。特别是比色免疫方法由于其所具有的简单、方便、实用、低廉和可用肉眼进行可视化检测的优点，已经得到广泛应用。尽管比色免疫反应在这个领域有一些进展，但仍然对于比色法需要开发一些新的信号转换战略。
邻菲罗啉和它的衍生物具有是双齿杂环的配体，已经成功地引入到构建无机、有机、超分子化学。它具有刚性平面结构和电子共轭的芳香杂环因而对各种过渡金属具有强烈的配位能力。近年来，邻菲罗啉和它的衍生物以及金属复合物已经在分子生物领域有了持续深入的研究，比如，dna/rna结合，有机金属框架，分子识别传感。利用低势的π反键轨道特征，邻菲罗啉对低氧化态的过渡金属，如ru(ii)、cu(i)和co(ii)，展现出卓越的络合能力，因而形成金属复合物，这种物质处于金属到配体的电荷转移的低能量状态，电荷转移能谱出现在可见光光谱区而能够被肉眼识别。基于金属到配体电荷转移的比色方法相比于基于贵重金属纳米材料的比色方法展现出更便携的操作和更高的稳定性。
技术实现要素：
基于以上背景，本发明的目的在于提供一种基于铁(ii)与邻菲罗啉体系和脂质体包裹葡萄糖的免疫分析方法，该分析方法主要用于食品中链霉素残留的检测。利用脂质体负载的大量葡萄糖偶联链霉素-牛血清白蛋白作为信标产生信号增强，由于酶诱导铁(ii)氧化成铁（iii）引发铁(ii)-邻菲罗啉显色体系颜色及吸光度的改变，利用这个特点，可以建立一个简单、低廉、灵敏且信号增强的可视化检测小分子抗生素的竞争型免疫的新方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于铁(ii)与邻菲罗啉体系和脂质体包裹葡萄糖的免疫分析方法包括如下步骤：
（1）制备葡萄糖负载的脂质体；
（2）通过交联剂将链霉素-牛血清白蛋白与葡萄糖负载的脂质体交联制成信标；
（3）将抗体固载在微孔板上，加入待测样品与信标混合孵育；用清洗缓冲溶液除去未参与反应的待测样品和信标；
（4）加入曲拉通x-100溶解脂质体；然后加入葡萄糖氧化酶溶液、氯化亚铁溶液混合孵育后，再加入邻菲罗啉显色剂显色，手机记录下检测液的颜色变化用于可视化半定量检测，紫外可见分光光度计进行定量检测。
步骤（1）所述的葡萄糖负载的脂质体是通过逆向蒸发法得到的，所述的脂质体粒径为199±18nm，zeta电位为-19.0±0.8mv。
步骤（1）所述的葡萄糖负载的脂质体所用葡萄糖的量为10ml，浓度为5mm。
步骤（2）所述葡萄糖负载的脂质体与链霉素-牛血清白蛋白的结合为共价交联。
步骤（3）所述信标的用量为50μl。
步骤（4）所述曲拉通x-100的浓度为10mgml-1，用量为100μl。
步骤（4）所述葡萄糖氧化酶的浓度为1mgml-1，用量为20μl。
步骤（4）所述氯化亚铁的浓度为5mm，用量为100μl。
步骤（4）所述邻菲罗啉的浓度为15mm，用量为100μl。
步骤（4）所述孵育时间为30分钟、温度为37°c。
步骤（4）所述显色剂显色时间为50秒。
本发明的基于铁(ii)与邻菲罗啉体系和脂质体包裹葡萄糖的免疫分析方法的测定原理是：最初，用戊二醛将链霉素-牛血清白蛋白与负载葡萄糖的脂质体共价交联形成信标，单克隆抗链霉素抗体物理吸附在微孔板上。在待测目标物链霉素存在，分析物与信标竞争微板上的包被的抗链霉素抗体。随着免疫复合物形成，所携带的葡萄糖负载的脂质体通过曲拉通x-100溶解，从而导致葡萄糖从脂质体中释放。释放的葡萄糖分子可以被葡萄糖氧化酶氧化成葡糖酸和过氧化氢。生成的过氧化氢将铁（ii）氧化成铁（iii），并降低了铁（ii）与邻菲罗啉的络合，从而使溶液颜色产生变化由为橙红色变成亮黄色，510nm处的吸光度降低。通过肉眼观察智能手机上的颜色的变化或通过紫外可见光谱测定吸光度，我们可以定性/定量地评估样品中目标物链霉素的水平，在最佳条件下，基于该检测方法测定的检测限为0.4pgml-1，线性范围是1.0pgml-1到20ngml-1。
本发明的优点如下：
（1）本发明提供了一种将铁(ii)-邻菲罗啉体系的应用于可视化检测小分子抗生素的免疫分析方法。本方法具有可视化分辨率高、操作简单、价格低廉、使用方便、检测线低、灵敏度和稳定性高等优点。
（2）本发明相对于传统的信号减弱型的竞争型免疫，引入的铁（ii）与邻菲罗啉体系可以产生信号增强的竞争型免疫测定模式。
（3）本发明将葡萄糖负载的脂质体标记和天然酶高效的结合在一起用于信号放大，提高了检测方法的灵敏度。
（4）平均一个样品的整个检测流程所花费时间为1.5小时，过程相对简单和快速。
（4）通过利用铁(ii)-邻菲罗啉显色体系和脂质体包裹葡萄糖作为信号放大应用于抗生素的检测，本方法可以扩展到分析毒素等小分子目标物。
附图说明
图1是基于铁(ii)与邻菲罗啉体系和脂质体包裹葡萄糖的免疫分析方法的示意图；
图2负载葡萄糖的脂质体的磷钨酸负染的透射电镜图，实物照片（右边）和粒径（左边）；
图3基于铁(ii)与邻菲罗啉体系和脂质体包裹葡萄糖的免疫分析方法的可视化照片；
图4基于铁(ii)与邻菲罗啉体系和脂质体包裹葡萄糖的免疫分析方法显色检测链霉素的（a）紫外可见光谱图和（b）标准工作曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。
实施例1
1.制备葡萄糖装载的脂质体(gll）
首先，氢化大豆磷脂、胆固醇和磷酸乙醇胺（摩尔比：50:10:1）共同加入到氯仿和乙醇（5.0ml，3:1，v/v）的混合溶液中溶解。室温下超声5分钟后，混合物在氮气的保护下45oc旋转蒸发直到形成混合均匀的薄膜。接下来，过量的葡萄糖溶液（5mm,10ml）通过注射器注射进入，在45oc下超声5分钟。为了获得粒径均分统一的悬浮液，悬浮液用0.4μm聚碳酸酯薄膜过滤多次。为了除去游离的葡萄糖分子，分散液在透析盒里(mwco,12–14kda)用去离子水透析2小时。最后获得的葡萄糖负载的脂质体（gll）被重新分散在磷酸盐缓冲溶液中（1.0ml,ph7.4）并存储在温度为4oc的空间了以供进一步使用。通过磷钨酸负染的透射电镜图表征所制备的葡萄糖负载的脂质体，如图2所示。从图2可以看出，所制备的负载的脂质体大小分布均匀，具有良好的分散性，直径在199±18nm，溶液散发出淡蓝色特征乳光。
2.链霉素-牛血清白蛋白和葡萄糖负载的脂质体偶联的复合物(str-gll)的制备
首先将上述准备的葡萄糖负载的脂质体分散液（1ml）缓慢滴加到戊二醛过量的溶液中（5.0ml,25wt%）,在室温下孵育2小时并轻微搅拌。接下来用磷酸盐缓冲液（10mm,ph7.4）室温下透析24小时以除去未反应的戊二醛。之后，链霉素-牛血清白蛋白（300μl,1.0mgml-1）加入到上一步的溶液中，在4°c下轻微震摇过夜形成str-gll复合物。超滤过后，str-gll被分散到包含有1.0wt%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液中（1.0ml,10mm,ph7.4）,4oc下存贮以供进一步使用。
3.比色免疫分析方法检测链霉素
图1是本发明的基于酶诱导铁(ii)与邻菲罗啉络合和脂质体包裹葡萄糖作为信号增强战略的竞争型免疫分析过程示意图。首先，在96孔酶标微孔板上每孔加入50μl的单克隆兔抗链霉素抗体（mab）（浓度为10μgml-1，溶入0.05m的碳酸盐缓冲液，ph9.6），微孔板用封口膜封住防止蒸发，在4°c下孵育过夜，然后将上述的微孔板用清洗缓冲液洗涤3次，再每孔加入300μl封闭液（1.0wt%牛血清白蛋白）置于37°c下孵育60min后按照上面的方式清洗。接下来，mab功能化的微孔板用于在竞争型免疫模式下检测链霉素目标物，如下：(i)每个孔同时加入50μlstr标准溶液或者样品和50μl上述步骤准备str-gll溶液，在37°c下轻微震摇孵育40min;(ii)将上述的微孔板用清洗缓冲液洗涤3次后，每个孔注入曲拉通x-100(100μl,10mgml-1)去溶解脂质体，释放出葡萄糖；(iii)每个孔分别加入葡萄糖氧化酶(20μl,1.0mgml-1)、fecl2（100μl，5.0mm），37°c下轻微震摇反应30min。(iv)每个孔加入邻菲罗啉（100μl,15mm），室温下显色50秒。然后，通过手机记录这些溶液的颜色变化，如图3所示；用紫外分光光度计记录这些溶液的紫外可见光光谱，如图4中的a所示；根据510nm处吸光度值和链霉素浓度变化的关系绘制标准工作曲线，如图4中的b所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。