一种测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐重均分子量和含量的方法与流程

本发明属于天然药物化学以及其质量控制领域领域，涉及一种测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐重均分子量和含量的方法。

背景技术：

海藻酸钠经酸解分级后，制备得到聚古罗糖醛酸，聚古罗糖醛酸再经硫酸化，得到聚古罗糖醛酸硫酸酯，其结构为2-oh/3-oh硫酸化的l-古罗糖醛酸(l-guluronicacid,g)通过α-1，4-糖苷键连接组成的线型化合物。目前，国内外有文献报道聚古罗糖醛酸硫酸酯可以用于预防和治疗尿路结石症、还具有抗肿瘤的生物学活性。

聚古罗糖醛酸硫酸酯盐结构式

聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量是研制聚古罗糖醛酸硫酸酯类药物的重要测定参数。目前，中国药典中，高效液相凝胶渗透色谱法(gelpermeationchromatography,gpc)是测定分子量的常规做法，其是按照排阻色谱的原理，不同分子量的多糖按照其大小顺序先后流出色谱柱，通过一系列不同分子量标准多糖与保留时间的相关性测得的校正曲线并计算相应的待测多糖的相对分子量。但该常规方法必须要有相应的多糖标准品而有一定的局限性。

此外，多糖和寡糖含量的测定常用方法为硫酸咔唑法，该方法首先以浓度及单糖标准品的显色做标准曲线，再在标准曲线上读出待测样品的含量。但是酸性糖的单糖并没有标准品出售，若以葡萄糖醛酸为标准品，其与酸性糖的结构及显色效率存在差异，不能对酸性糖进行精确定量。

近年来出现的尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(size-exclusionchromatography/multi-anglelaserlightscattering，sec-mals)测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量在业界引起了广泛的关注。18角度激光光散射仪(mals)工作原理是：激光束通过溶液会产生光散射，散射光强度与样品分子量及溶液浓度成正比，不同散射角度的光强及分子尺寸有关，因此在样品池周围不同位置设立多个检测探头(分子量的测量精度与角度数目的平方根成正比)同时接收不同角度的散射光强度信号。依照光散射方程k*c/r(θ)＝1/mwp(θ)+2a2c作zimm图，即可得到大分子的重均绝对分子量mw，均方旋转半径rg及第二维利系数a2。mals和尺寸排阻色谱(sec)联用，不必依赖泵的流速、校正曲线及其他错误的假设，即可直接求的分子量及分子量分布等数据。mals利用色谱柱分离出的样品在不同角度的光散射量，由示差折光(ri)检测器得到洗脱液浓度及dn/dc值计算得到质量，综合两者即可计算出各个切片的分子量。该方法不需标准品校准，克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的相对分子量测定的误差。已有研究者采用这一方法测定了壳聚糖、透明质酸的平均分子量(monicafee,neilerrington,korneliajumel,etal.correlationofsec/mallswithultracentrifμgeandviscometricdataforchitosans.eurbiophysj(2003)32:457～464；sanyahokputsa,korneliajumel,catherinealexander,etal.comparisonofmolecularmassdeterminationofhyaluronicacidusingsec/mallsandsedimentationequilibrium.eurbiophysj(2003)32:450～456)，还有研究者采用该方法对天然中性多糖进行定量，并预测该方法将成为多糖定量的一种常规技术(kit-leongcheong,dingtaowu,jingzhao,etal.arapidandaccuratemethodforthequantitativeestimationofnaturalpolysaccharidesandtheirfractionsusinghighperformancesizeexclusionchromatographycoupledwithmulti-anglelaserlightscatteringandrefractiveindexdetector.journalofchromatographya(2015)1400:98～106)。目前欧洲药典已经采用此方法作为羟乙基淀粉重均分子量及分子量分布的测定方法(europeanpharmacopoeia8.0,p3307-3308,starcheshydroxyethyl)。

综上，sec-mals可以成功测定中性多糖重均分子量及含量。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够准确、高效、简单、稳定的检测聚古罗糖醛酸硫酸酯盐重均分子量、含量的方法。

本发明的一个方面提供一种测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量的方法，其特征在于，所述测定方法包含以下步骤：

(1)测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐样品中金属离子的重量百分含量a；

(2)使用sec-mals测定重均分子量mw1和含量x；

(3)使用以下公式进行计算，分别得到聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量：

以上公式(1)中：mw1为sec-mals法直接得到的聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量(da)；a为聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中金属离子的含量；

以上公式(2)中：x为图谱处理软件计算得到的质量；y为进样的质量；a为聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中金属离子的含量。

利用本发明提供的测定方法，可以精确测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量，成功解决了聚古罗糖醛酸硫酸酯盐重均分子量测定偏差大、含量定量不准的问题。

附图说明

图1示出了溶剂水(a)和聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐(b)的sec-icp-ms谱图，以及聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐的sec-mals示差谱图(c)

具体实施方式

定义

除非另外说明，否则所有的百分数、比例、比率或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练技术人员所熟知的熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

如本文所用，术语“dn/dc”指折光指数增量，可使用本领域常用的方法进行测定(刘莉莉等.医用透明质酸钠凝胶的绝对分子量及其分布的测定方法[j]药物分析杂志2013，33(8)，1435-1438)；也可从本领域公开的相关技术文献中查询获得。

如本文所用，术语“sec-mals”指尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(size-exclusionchromatography/multi-anglelaserlightscattering)，近年来被广泛应用于测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量，具体测定方法可采用本领域公知的方法(monicafee,neilerrington,korneliajumel,etal.correlationofsec/mallswithultracentrifugeandviscometricdataforchitosans.eurbiophysj(2003)32:457～464；sanyahokputsa,korneliajumel,catherinealexander,etal.comparisonofmolecularmassdeterminationofhyaluronicacidusingsec/mallsandsedimentationequilibrium.eurbiophysj(2003)32:450～456；kit-leongcheong,dingtaowu,jingzhao,etal.arapidandaccuratemethodforthequantitativeestimationofnaturalpolysaccharidesandtheirfractionsusinghighperformancesizeexclusionchromatographycoupledwithmulti-anglelaserlightscatteringandrefractiveindexdetector.journalofchromatographya(2015)1400:98～106)。

如本文所用，术语“icp-ms”指电感耦合等离子体质谱法(inductivelycoupledplasmamassspectrometry)是当代元素组成测定技术中的重大发展，具有高灵敏度，干扰少、超痕量检测限、多元素同时分析等诸多优点，具体测定方法可采用本领域公知的方法，例如冯先进，屈太原.电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)最新应用进展.中国无机化学分析.(2011)1:46～52所记载的方法。

如本文所用，术语“icp-oes”指电感耦合等离子体发射光谱法(inductivelycoupledplasmaopticalemissionspectrometer)，是本领域用于测定金属离子含量的常用方法，具体测定方法可采用本领域公知的方法。

技术问题的发现

本申请的发明人发现，使用现有的sec-mals测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐样品时，样品峰后有未知峰，且计算得到聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的含量不合理，mals在此含量基础上得到的重均分子量亦有偏差。针对上述现象，通常认为是样品在柱子上发生吸附造成含量降低，但是发明人发现，这种情况在使用柱子多次分离后也未得到解决。为探索该问题，发明人对sec-mals测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐时的未知峰进行解析，结果发现该未知峰对于得到聚古罗糖醛酸硫酸酯盐准确重均分子量和含量至关重要。

本发明的发明人发现，未知峰归属于聚古罗糖醛酸硫酸酯盐结构中的金属离子，因此，聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量还应考虑金属离子含量的影响，进行校正，即sec-mals测定的重均分子量和含量除以聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中糖链部分所占的质量分数(1-金属离子含量)得聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量，即采用以下计算公式1、公式2进行校正：

以上公式(1)中：mw1为sec-mals法直接得到重均分子量(da)；a为聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中金属离子的含量；

以上公式(2)中：x为图谱处理软件计算得到的质量(μg)；y为进样的质量(μg)；a为聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中金属离子的含量。

利用本发明提供的测定方法，可以精确测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量，成功解决了聚古罗糖醛酸硫酸酯盐重均分子量测定偏差大、含量定量不准的问题。

在本发明的一些实施方案中，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯盐为碱金属盐。在本发明的另一些实施方案中，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯盐为钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。在本发明的另一些实施方案中，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯盐为钠盐。

金属离子含量的测定

在本发明的实施方案中，所述聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中金属离子含量的测定方法选自：icp-ms、icp-oes、原子吸收或离子色谱法。优选icp-ms、离子色谱法，更优选离子色谱法。这些测定方法如前文所描述。它们通常与sec一起使用。

电感耦合等离子体质谱法(inductivelycoupledplasmamassspectrometry,icp-ms)是当代元素组成测定技术中的重大发展，具有高灵敏度，干扰少、超痕量检测限、多元素同时分析等诸多优点(冯先进，屈太原.电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)最新应用进展.中国无机化学分析.(2011)1:46～52)。发明人首次尝试将sec与icp-ms联用，成功确认了sec-mals测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐样品峰后的未知峰为金属离子，同时能够获得金属离子的种类及含量的相关数据。

在此基础上，通过测定离子的种类及其含量来以期对sec-mals法测定的重均分子量和含量进行校正：通过将测得的重均分子量和含量分别除以聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中糖链部分所占的质量分数，进而分别得到聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量。

sec-mals方法测定分子量和含量

在本发明中，sec-mals方法用于测定酸性糖类的分子量和含量。发明人发现了聚古罗糖醛酸硫酸酯盐样品进入sec柱分析时发生解离，由此可知，sec-mals方法得到是解离后不含金属离子的酸性糖的重均分子量和含量，因此聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量还应考虑金属离子含量的影响，目前的sec-mals方法中尚未见这方面的报道。

在本发明采用的sec-mals方法中，可以使用醇+盐的溶液作为流动相；其流速可能为0.05-0.2ml/min；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自nh4ac、nacl或na2so4，盐溶液的浓度为0.05-0.15mol/l。

在本发明的另一优选实施方案中，sec-mals测定采用20％甲醇+80％80mmol/lnh4ac作为流动相；其流速为0.1ml/min。

在本发明的另一优选实施方案中，sec-mals测定采用能够良好分离2k-30kda多糖的色谱柱；优选包括但不限于如下色谱柱：watersacquitysec1.7um4.6×150mm柱，tskg4000pwxl7.8×300mm(tosoh)shodexohpaksb-803hq7.8×300mm(shodex)advancebiosec2.7μm4.6×150mm柱(agilent)。

在本发明的一些实施方案中，所述的测定方法还包括测定聚古洛糖醛酸硫酸盐折光指数增量(dn/dc)的步骤。

在本发明的一些实施方案中，所述的聚古洛糖醛酸硫酸盐折光指数增量(dn/dc)的测定包含以下步骤：

(1)使用sec-mals测定的流动相溶解聚古洛糖醛酸硫酸盐样品，并将样品稀释，得到0.1mg/ml-2mg/ml浓度区间内的5-6个浓度点的系列溶液；

(2)用示差折光检测器(wyatt，optilabt-rex(wtrex-08)分别依次进样流动相、步骤2中制备的样品溶液，并采集信号；

(3)由astra软件计算得到dn/dc。

在本发明的一个实施方案中，聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量测定方法如下：

步骤1：用icp-ms、icp-oes、原子吸收或离子色谱测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中金属离子的重量百分含量a。

步骤2：测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的dn/dc

(1)称定恒重的样品，加入sec流动相(例如如下步骤3中使用的流动相)溶解，配置成0.1-5mg/ml，优选0.2-2mg/ml的系列溶液，该系列溶液的浓度可以为例如0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml。

(2)用示差折光检测器(例如wyatt，optilabt-rex(wtrex-08)分别依次进样流动相、前一步中配制的系列溶液，并采集信号，

(3)dn/dc由astra软件计算得到dn/dc。

步骤3：sec-mals测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐分子量和含量

(1)根据预估待测聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的分子量范围，选择适合的色谱柱；

(2)配制聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的梯度溶液，其范围为2-500mg/ml，分3-10个梯度；例如约为2、10、50、100、300mg/ml(浓度＝重量/体积)的溶液。

(3)使用醇+盐的溶液作为流动相；其流速可能为0.05-0.2ml/min；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自nh4ac、nacl或na2so4，盐溶液的浓度为0.05-0.15mol/l，检测器使用十八角激光检测器和示差折光检测器；

(4)使用sec-mals法直接得到的聚古罗糖醛酸硫酸酯盐重均分子量mw1；

(5)使用图谱处理软件计算得到的样品中聚古罗糖醛酸硫酸酯盐质量x；

(6)使用以下公式进行计算，分别得到聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的重均分子量和含量：

以上公式(1)中：mw1为sec-mals法直接得到的甘露寡糖二酸可溶性盐的重均分子量(da)；a为聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中金属离子的含量；

以上公式(2)中：x为图谱处理软件计算得到的质量；y为进样的质量；a为聚古罗糖醛酸硫酸酯盐中金属离子的含量。

sec-mals法测定重均分子量和含量的具体操作条件可以根据常规的实验方案进行。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)对聚古罗糖醛酸硫酸酯盐样品sec-mals分析中的未知峰进行解释。

(2)可以精确测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐重均分子量和含量，重复性好。

(3)重均分子量和含量可在一次分析中得到，操作简单。

(4)提高了测量聚古罗糖醛酸硫酸酯盐的准确性，有助于更准确地研究多糖的分子结构。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例部分所使用的仪器包括：

lc：agilent1260液相色谱仪

18角度激光检测器：wyattdawnheleosii

示差折光检测器：wyattoptilabt-rex

icp-ms：agilent7900icp-ms

离子色谱：瑞士万通

icp-oes：美国perkin-elmer公司optima7000dv电感耦合等离子发射光谱仪

火焰原子吸收：北京瑞利wfx-120b型火焰原子吸收光谱仪

实施例1sec与icp-ms揭示酸性糖在尺寸排阻色谱的分离机理，并测定聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐的重均分子量和含量

步骤1：sec-icp-ms测定金属离子出峰位置及含量

(1)使用色谱柱watersacquitysec1.7um4.6×150mm柱，0.08mol/lnh4ac为流动相，流速0.1ml/min。

(2)将sec与icp-ms联用：将样品溶于水中，浓度0.02mg/ml，进样20ul，采集²³na,⁴³ca,⁴⁴ca的信号。分别配置的浓度为0.1ppm,0.5ppm,1.0ppm,5.0ppm和10.0ppm的na离子标准溶液，并以外标法计算样品中金属离子的含量(a值)。a值结果见表1。

步骤2：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱watersacquitysec1.7um4.6×150mm柱0.1mol/lnh4ac为流动相，流速0.1ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。实验结果见附图1和表1。

图1为溶剂水(图1a)和聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐(图1b)的sec-icp-ms谱图，以及聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐的sec-mals示差谱图(图1c)。结果显示，在sec-icp-ms谱图中，相比于阴性对照，聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐在a处有明显na盐峰，比较图1b和图1c可知，聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐在sec-icp-ms谱图a处的na盐峰与示差谱图b处的峰出峰位置一致，说明示差谱图b处的未知峰为钠盐峰，这意味着聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐进入sec柱分析时发生解离，sec-mals方法得到是解离后不含金属离子的聚古罗糖醛酸硫酸酯的重均分子量和含量，提示为了准确计算出聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐的重均分子量和含量，采用sec-mals方法时，必须考虑聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐中的金属离子进行校正，具体计算见公式1、公式2。

以上公式(1)中：mw1为sec-mals法直接得到的重均分子量(da)；a为金属离子的含量。

以上公式(2)中：x为图谱处理软件计算得到的质量(μg)；y为进样的质量(μg)；a为金属离子的含量。

表1：聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用公式校正；a为na％

从表1可知，经过校正后，sec-mals可以准确计算出聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐的重均分子量和含量。

实施例2sec-mals测定聚古罗糖醛酸硫酸酯钾盐的重均分子量和含量

步骤1：离子色谱测定金属离子的比例

k离子标准溶液配置为25、10、12.5、6.25、3.125ppm。样品浓度为2mg/ml。

离子色谱条件：预柱：metrosepc4guard/4.0；分离柱：metrosep

c5-150/4.0；流动相：5mm硝酸的超纯水溶液；流速：0.9ml/min；进样量20ul。以外标法进行金属离子含量的测定。

步骤2：测定dn/dc

(1)称定恒重的样品，用流动相配制浓度为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml的一系列溶液。

(2)用示差折光检测器(wyatt，optilabt-rex(wtrex-08)分别依次手动进样流动相、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml样品溶液，并采集信号，

(3)dn/dc由astra软件计算得到，见表2。

步骤3：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱advancebiosec2.7μm4.6×150mm柱(agilent)0.3mol/lna2so4为流动相，流速0.2ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。实验结果如表2所示。

表2聚古罗糖醛酸硫酸酯钾盐的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用实施例1中的公式校正；a为k％

从表2可以看出，经过校正，sec-mals可以准确计算出聚古罗糖醛酸硫酸酯钾盐的重均分子量和含量。

实施例3sec-mals测定聚古罗糖醛酸硫酸酯钙盐的重均分子量和含量

步骤1：火焰原子吸收法测定金属离子含量：

采集ca的谱线，配制1mg/l、10mg/l、50mg/l、75mg/l和100mg/l的ca标准溶液；样品溶液浓度配制为200mg/l。

步骤2：测定dn/dc

同实施例2步骤2。测定值见表3。

步骤3：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱shodexohpaksb-803hq7.8×300mm(shodex)，0.15mol/lnacl为流动相，流速0.5ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。实验结果如表3所示。

表3聚古罗糖醛酸硫酸酯钙盐的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用实施例1中的公式校正；a为ca％

从表3可以看出，经过校正，sec-mals可以准确计算出聚古罗糖醛酸硫酸酯钙盐的重均分子量和含量。

实施例4sec-mals测定聚古罗糖醛酸硫酸酯镁盐的重均分子量和含量

步骤1：icp-oes测定金属离子含量：

采集mg的分析谱线，配制1mg/l、5mg/l、10mg/l的na标准溶液；

样品溶液浓度配制为20mg/l，由此获得的a值如表4所示。由此步骤2：测定dn/dc

同实施例2步骤2。测定值见表4。

步骤3：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱tskg4000pwxl7.8×300mm(tosoh)，0.5mol/lnano3为流动相，流速0.5ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。实验结果见表4。

表4聚古罗糖醛酸硫酸酯镁盐的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用实施例1中的公式校正；a为mg％

从表4可以看出，经过校正，sec-mals可以准确计算出聚古罗糖醛酸硫酸酯镁盐的重均分子量和含量。