一种使用深共融溶剂提取测定玛咖中5种玛咖酰胺的方法与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种使用深共融溶剂提取测定玛咖中5种玛咖酰胺的方法。

背景技术：

玛咖(lepidiummeyenii)为十字花科独行菜属的一种一年生草本植物，最早生长在海拔超过4000米的秘鲁中央的安第斯山区，具有2000年的食用历史。玛咖的根茎部分比地上部分具有更高的营养价值，根形似小圆萝卜，外形颜色有紫、黑、黄等。研究表明玛咖具有丰富的营养价值和药用价值，玛咖还具有许多传统的疗效，如作为泻药、治疗风湿病、呼吸道疾病、痛经及女性更年期综合征等。另外，玛咖还具有改善性功能、提高人畜生育能力、缓解疲劳及抗氧化等功能。基于以上特点，玛咖被称为“秘鲁人参”。玛咖中的玛咖酰胺被视为主要的活性功能成分，是评价玛咖质量的重要标准。

目前对提取玛咖酰胺的溶剂很多，但都是有机化合物，对人体危害大、对环境污染较严重。而深共融溶剂有较好的化学稳定性、可设计性和可循环使用等优点，与有机溶剂相比还具有原料廉价易得且绿色环保，合成工艺简单并且不需要引入其它有机溶剂就可获得高纯度的产物，原子经济性达100％。目前用深共融溶剂(dess)提取中药中有效成分的方法已有报道，但是用dess提取玛咖中玛咖酰胺的报道还没有出现。

技术实现要素：

为弥补现有技术的不足，本发明提供的采用dess做提取剂提取玛咖中5种玛咖酰胺并用hplc测定其含量的方法，提取含量比石油醚高，并且简便快捷，有较好的化学稳定性、可设计性和可循环使用等优点，是一种分析玛咖酰胺类成分的有效途径，有望替代有机溶剂来提取玛咖中玛咖酰胺。

本发明的技术方案如下：一种使用深共融溶剂提取测定玛咖中5种玛咖酰胺的方法，包括以下步骤：

(1)深共融溶剂的制备

氯化胆碱经真空干燥12h后，按照摩尔比为1:2分别称取氯化胆碱和1,6-己二醇置于圆底烧瓶中，在80℃下加热回流搅拌直到形成均匀的液体，然后再反应4个小时即得到无色透明的深共融溶剂；

(2)待测溶液的制备

将玛咖粉末按照1g:10ml料液比加入含30wt％水的深共融溶剂中，70℃下超声波提取30min，离心后上清液即为提取液；将提取液溶解于甲醇中得到待测溶液，其中提取液的体积浓度为10％；

(3)对照品混合液的制备

分别精密称取n-(间-甲氧基苄基)-亚麻酰胺、n-苄基亚麻酰胺、n-(间甲氧基苄基)-亚油酰胺、n-苄基亚油酰胺、n-苄基十六烷酰胺对照品，用甲醇分别溶解后混合，配制成多组对照品混合液，所述对照品混合液中各对照品的质量浓度介于0.5～2000μg/ml范围内；

(4)标准曲线的建立

分别吸取步骤(3)中多组对照品混合溶液，进行液相色谱测定；

色谱条件如下：色谱柱为xtimatexb-c18色谱柱4.6×250mm，5μm；流动相：流动相a为水，流动相b为乙腈；梯度：0～24min，80vt％流动相b～100vt％流动相b；检测器为g4212-60008二极管阵列检测器，检测波长210nm、280nm；流速0.8ml/min；柱温40℃；进样量10μl；

以步骤(3)中各对照品混合液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线；

(5)待测溶液中玛咖酰胺含量的测定

按步骤(4)的色谱条件对待测溶液进行测定，并利用标准曲线计算待测样品中每种玛咖酰胺的含量。

进一步的，步骤(4)中所述的多组对照品混合溶液中各对照品的浓度范围分别为：n-(间-甲氧基苄基)-亚麻酰胺0.5～85μg/ml、n-苄基亚麻酰胺3～700μg/ml、n-(间甲氧基苄基)-亚油酰胺0.5～100μg/ml、n-苄基亚油酰胺4～2000μg/ml、n-苄基十六烷酰胺1～2000μg/ml。

进一步的，对n-(间甲氧基苄基)-亚麻酰胺的检出限为2.57μg/ml。

进一步的，对n-苄基亚麻酰胺的检出限为1.46μg/ml。

进一步的，对n-(间甲氧基苄基)-亚油酰胺的检出限为2.06μg/ml。

进一步的，对n-苄基亚油酰胺的检出限为1.64μg/ml。

进一步的，对n-苄基十六烷酰胺的检出限为2.82μg/ml。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的提取方法使用的dess有较好的化学稳定性、可设计性和可循环使用，原料廉价易得且绿色环保，合成工艺简单并且不需要引入其它有机溶剂就可获得高纯度的产物，原子经济性达100％，解决了传统提取方法有机溶剂毒性大、提取率低、成本高、提取时间较长、提取次数多的问题；

(2)本发明的检测方法为高效液相色谱(hplc)检测，采用梯度洗脱方法，分离度好，可以同时检测玛咖中5种玛咖酰胺；本发明只用乙腈和水作为流动相，解决了三氟乙酸对色谱柱损耗大、清洗不便等问题，流动相配置方便，简便了操作；

(3)本发明的提取测定方法线性关系良好、精密度高、重复性好、稳定性好、回收率高、简便、快捷并且准确可行，可作为玛咖中玛咖酰胺标准的定量检测方法。

附图说明

图1为dess提取玛咖样品液相色谱图；

图2为石油醚提取玛咖样品液相色谱图。

其中：1为编号c1，2为编号c2，3为编号c3，4为编号c4，5为编号c5。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1

本实施例选择西藏地区黄玛咖作为待测样品进行测定，具体步骤如下：

(1)dess的制备

氯化胆碱经真空干燥12h后，然后按摩尔比为1:2分别称取一定量的氯化胆碱和1,6-己二醇置于100ml的圆底烧瓶中，在80℃下加热回流搅拌直到形成均匀的液体，然后再反应4个小时即得到无色透明的深共融溶剂；

(2)待测溶液的制备

粉碎，过筛，精密称取玛咖粉末，以1g:10ml料液比加入已制备好的含有30％水的dess中，70℃下超声提取30min，离心，取提取液1ml用甲醇定容至10ml的容量瓶中，待hplc定量分析；

(3)对照品混合液的制备

分别精密称取n-(间-甲氧基苄基)-亚麻酰胺、n-苄基亚麻酰胺、n-(间甲氧基苄基)-亚油酰胺、n-苄基亚油酰胺、n-苄基十七烷酰胺对照品，用甲醇分别溶解后混合，配制成多组对照品混合液，所述对照品混合液中各对照品的质量浓度介于0.5～2000μg/ml范围内；

各对照品的浓度具体如下表1：

表1各对照品的浓度

*表1中浓度单位为μg/ml。

(4)标准曲线的建立

分别吸取步骤(3)中多组对照品混合溶液，进行液相色谱测定；

色谱条件为：色谱柱xtimatexb-c18色谱柱4.6×250mm，5μm；流动相：流动相a为水，流动相b为乙腈；梯度：0～24min，80vt％流动相b～100vt％流动相b；检测器g4212-60008二极管阵列检测器，检测波长210nm、280nm；流速0.8ml/min；柱温40℃；进样量10μl；

以步骤(3)中各对照品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线；按信噪比3:1确定检测限，标准曲线方程及检出限见表2；

表25种玛咖酰胺对照品标准曲线方程

(5)待测溶液中5种玛咖酰胺含量的测定

色谱条件为：色谱柱xtimatexb-c18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为a(水)和b(乙腈)，梯度：0～24min，80vt％b～100vt％b；检测器g4212-60008二极管阵列检测器，检测波长210nm、280nm；流速0.8ml/min；柱温40℃；进样量10μl，并利用标准曲线计算待测样品中5种玛咖酰胺的含量。结果如下表3：

表3石油醚与dess提取玛咖中玛咖酰胺的含量对照

通过利用hplc的检测，得出图1和图2，图1为用10ml含有30％水的dess提取1g玛咖样品后，取1ml用甲醇稀释10倍的液相色谱图；图2为10ml石油醚提取5g玛咖样品后旋蒸，所得样品用甲醇溶解的液相色谱图。根据标准曲线方程得出5种玛咖酰胺各自的含量如表3可所示，经过分析得出dess提取的玛咖中5种玛咖酰胺的含量均比石油醚提取的含量高，说明dess的提取效率更高。

实施例2

(1)精密度实验

取玛咖酰胺对照品溶液，上述色谱条件连续进样3次，计算各玛咖酰胺峰面积的相对标准偏差(relativestandarddeviation，rsd)，结果所有玛咖酰胺的rsd值在0.94％～4.73％之间，表明所用仪器精密度良好。结果如表4所示。

表4精密度实验结果(n＝3)

(2)重复性实验

取玛咖样品最终溶液，上述色谱条件连续进样3次，计算各玛咖酰胺含量的相对标准偏差，结果所有玛咖酰胺的rsd值在0.42％～4.42％之间，表明该方法重复性良好。结果如表5所示。

表5重复性实验结果(n＝3)

(3)稳定性实验

取同一玛咖样品提取液，按上述色谱条件，分别在放置0、2、4、8和12h后进样分析，计算含量，计算样品各玛咖酰胺的rsd，结果其rsd值在0.47％～4.40％之间，表明供试品溶液在室温条件下放置12h稳定性良好。结果如表6所示。

表6稳定性实验结果(n＝5)

(4)加样回收率实验

分别取9份相同重量的已知各玛咖酰胺含量的玛咖样品按上述方法制备玛咖酰胺提取液，分别加入不同含量的玛咖酰胺对照品溶液，完全混匀后经过0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl。各玛咖酰胺的平均回收率在98.23％～100.82％之间，表明本发明方法准确率高，结果见表7。

表7加样回收率实验结果(n＝9)

综上所述，dess有较好的化学稳定性、可设计性和可循环使用等优点，与离子液体相比还具有原料廉价易得且绿色环保，合成工艺简单并且不需要引入其它有机溶剂就可获得高纯度的产物，原子经济性达100％。并且结合hplc线性关系良好、精密度高、重复性好、稳定性好、回收率高、简便、快捷并且准确可行，可作为玛咖中玛咖酰胺标准的定量检测方法。