一种纸基双模式检测铅离子的方法与流程

本发明涉及一种纸基双模式检测铅离子的方法，属于铅离子的检测技术领域。

背景技术：

铅离子是环境中重要的有毒重金属离子污染物，其对人体尤其是儿童健康的危害已引起社会的广泛关注。铅离子超标影响智力发育和骨骼发育，导致消化不良、内分泌失调、免疫功能下降等。因此，对铅离子浓度的分析与检测对人体健康和环境保护有着重要意义。

目前检测铅离子的方法主要有离子印记法、电化学生物传感器法、原子吸收光谱法、荧光光谱法等。尽管这些方法选择性强、灵敏度高、分析范围广，但上述方法对铅离子浓度进行检测需要特定的设备，设备本身较为昂贵，不具有经济性；另外，上述方法测定周期长，分析过程较为复杂，无法实现铅离子的实时测定。

微流控纸芯片作为新型设备能够通过毛细作用实现无动力流体运输，网状分布的纤维能够储存试剂，高的表面积与体积比可以提高比色测定的检测限，并且具有制作过程简单、易携带、成本低、生物相容性和生物降解能力好等优点，可以用于环境质量监控、水质分析和疾病检测等领域。

技术实现要素：

针对目前存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种设计合理，成本低廉，操作简便，环境友好且灵敏度高的纸基双模式设备的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1.在计算机上利用adobeillustratorcs4软件设计十字形疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的a4尺寸滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水墙，样式如附图1所示，其中1为通道板，2为检测板，3为参比板，4、5为遮光板；其中通道板用来辅助液体流动，使得检测板工作区域的液体流动到比色条以实现可视化预判，遮光板用来防止外部光源对可视化反应的干扰，检测板与参比板结合可以实现对目标物的精准检测。

2.采用丝网印刷的方法将工作电极印刷到检测板，参比电极和对电极印刷到参比板，将通道板中的由蓝色疏水图案包围的白色圆形区域居中进行打孔，孔直径比圆形区域直径小1mm；将由蓝色疏水图案包围的白色矩形区域b居中进行切割，宽度比矩形区域的宽度小0.5mm。

3.在参比板的矩形连接端口背面通过种子溶液生长法生长花状金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80ml二次水加热至90℃，并加入0.8ml质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96℃保持1min，最后加入2.8ml质量分数为1%的柠檬酸钠，并加热8min得到金种子溶液，将20μl金种子溶液滴加在工作区域，静置晾干，重复三次；其次将100μl200mmol/l的抗坏血酸和100μl质量分数为1%的氯金酸溶液混合，并取20μl滴加到带有种子溶液的工作区域，静置30min，用二次水水冲洗3次。

4.对检测板的白色圆形工作区域进行功能化，首先通过种子溶液生长法生长花状金纳米粒子，参考步骤3，其次将由1-5μmol/mldna链p1,1-5mmol/l三（2-羧乙基）膦和ph8.0的缓冲溶液组成的混合溶液滴加到金纳米粒子修饰的工作区域，自然晾干后继续滴加1-5mmol/l的封闭液，用ph8.0的缓冲溶液多次冲洗工作区域并自然晾干，最后，取适量dna链p2/还原氧化石墨烯/pdau纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物于工作区域，并于37℃保持2小时，将工作区域浸入ph8.0的缓冲溶液中5-10分钟以减少非特异性吸附。

5.取适量15-25mmol/l3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和6-10mmol/lh2o2滴加到比色条，并自然晾干；其次将含有铅离子的待测溶液滴加于工作区域中，将通道板沿虚线对折于检测板上部，样式如附图2所示，将ph8.0的缓冲溶液通过通道板直径为5-8mm的白色圆形区域滴加于检测板的工作区域，液体通过通道ⅰ流入检测板的比色条，10秒后将比色条置于颜色采集窗口，读取颜色灰度值。

6.将参比板沿虚线对折于检测板下部，样式如附图3所示，将葡萄糖和鲁米诺加入到ph8.0的缓冲溶液，完全溶解后取适量所得溶液滴加到检测板的圆形亲水工作区域中，将此纸基双模式设备连接电化学工作站精准检测铅离子浓度。

7.分别绘制电化学发光强度和灰度与铅离子浓度的标准曲线，完成铅离子的测定。

本发明的有益效果：

1.一种纸基双模式设备可对铅离子进行可视化预判和精准检测，可视化预判测定铅离子在允许浓度范围内即无需进行精准检测，降低了实验成本。

2.通过改变离子特异性dna酶，可实现对其他重金属离子的分析与检测。

3.相比于传统的玻碳电极和玻璃电极，纸基材原料丰富、质量轻、廉价、易折叠、可降解。

4.纸基传感器柔韧灵活，携带方便，可以剪裁、弯曲、折叠和可塑，后处理简单，不会对环境造成污染。

5.纸张通常是白色的，背景信号低，有利于进行比色检测。

附图说明：

下面结合附图和具体实施方案对本发明作进一步详细描述：

图1是疏水蜡打印图案上丝网印刷工作电极、参比电极、对电极。

图2是微流控设备可视化检测目标物折叠示意图。

图3是微流控设备精准检测目标物折叠示意图。

具体实施方式

实施例1（自来水中的铅离子）

一种操作简单、检测速度快、成本低廉的纸基双模式检测铅离子的方法，包括以下步骤：

1.在计算机上利用adobeillustratorcs4软件设计十字形疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的a4尺寸滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水墙，样式如附图1所示，其中1为通道板，2为检测板，3为参比板，4、5为遮光板；其中通道板用来辅助液体流动，使得检测板工作区域的液体流动到比色条以实现可视化预判，遮光板用来防止外部光源对可视化反应的干扰，检测板与参比板结合可以实现对目标物的精准检测。

2.采用丝网印刷的方法将碳工作电极印刷到检测板，ag/agcl参比电极和碳对电极印刷到参比板，将通道板中的由蓝色疏水图案包围的白色圆形区域居中进行打孔，孔直径比圆形区域直径小1mm；将由蓝色疏水图案包围的白色矩形区域b居中进行切割，宽度比矩形区域的宽度小0.5mm。

3.在参比板的矩形连接端口背面通过种子溶液生长法生长花状金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80ml二次水加热至90℃，并加入0.8ml质量分数为1%的氯金酸溶液，继续加热至96℃保持1min，最后加入2.8ml质量分数为1%的柠檬酸钠，并加热8min得到金种子溶液，将20μl金种子溶液滴加在工作区域，静置晾干，重复三次；其次将100μl200mmol/l的抗坏血酸和100μl质量分数为1%的氯金酸溶液混合，并取20μl滴加到带有种子溶液的工作区域，静置30min，用二次水水冲洗3次。

4.对检测板的白色圆形工作区域进行功能化，首先通过种子溶液生长法生长花状金纳米粒子，参考步骤3，其次，在生长有金纳米粒子的工作区域修饰dna链p1，具体步骤为：取20μl由30μl1μmol/mlp1,500μl1mmol/l三（2-羧乙基）膦和500μlph8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液组成得混合溶液滴加到金纳米粒子修饰的工作区域，并自然晾干后继续滴加20μl1mmol/l的巯基己醇封闭液，用10mmol/lph8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液多次冲洗工作区域并自然晾干；最后，在工作区域修饰dna链p2/还原氧化石墨烯/pdau纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物，具体步骤为：称取105mg聚乙烯吡咯烷酮，300mg溴化钾,57mg氯钯酸钠分散于10ml二次水中，使其完全溶解；将上述得到的混合溶液置于油浴锅中80℃磁力搅拌下反应3小时，冷却至室温，用乙醇和二次水洗涤出去多余的溴离子；将由1.0ml上述pd种子溶液，5.0ml二次水，5mg聚乙烯吡咯烷酮，3.0mg抗坏血酸组成的混合溶液置于20ml圆底烧瓶中，在油浴锅中95℃磁力搅拌下反应20min，用移液枪取268μl24.3mmol/l的氯金酸溶液加入圆底烧瓶，继续于95℃下加热15min，冷却至室温，用乙醇和二次水洗涤数次得到pdau纳米粒子，4℃保存；将由2.5ml2.0mg/ml氧化石墨烯溶液，7.5ml二次水，10ml聚乙烯亚胺，100μl氨水组成的混合溶液于室温磁力搅拌下反应30min后置于油浴锅中60℃磁力搅拌下反应12小时，加入300μlpdau纳米粒子并于油浴锅中60℃下反应12小时，得到的溶液用乙醇和二次水洗涤数次得到还原氧化石墨烯/pdau复合物；将由1.0ml1.0mg/ml氧化石墨烯/pdau复合物,1.0ml100µg/ml葡萄糖氧化酶组成的混合溶液磁力搅拌下反应2小时，加入5.0ml封闭液超声处理2小时，用乙醇和二次水洗涤数次，得到rgo-pdau-gox纳米复合物，最后，10µl10mmol/lp2用1.5µl10mmol/l的三(2-羧乙基)膦和ph5.2的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液活化以断裂二硫键，向其中加入1.0ml还原氧化石墨烯/pdau纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物于磁力搅拌下反应16小时，将其加入250µl100mmol/l氯化钠溶液和250µlph8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液中过夜，经过数次离心洗涤得到dna链p2/还原氧化石墨烯/pdau纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物；取20μldna链p2/还原氧化石墨烯/pdau纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物工作区域，并于37℃保持2小时，将工作区域浸入ph8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液中5-10分钟以减少非特异性吸附，所述的dna链p1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰上1个巯基和6个亚甲基，所述的dna链p2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰有1个巯基和6个亚甲基，且自左向右第十个碱基a代表腺嘌呤核糖核酸。

5.取20μl20mmol/l3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和10μl5mmol/lh2o2滴加到比色条，并自然晾干；取20μl含有铅离子的待测溶液滴加到工作区域中，将通道板沿虚线对折于检测板上部，取40μlph8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液滴加于检测板的工作区域，液体通过通道ⅰ流入检测板的比色条，10秒后将比色条置于颜色采集窗口，读取颜色灰度值。

6.将参比板沿预留空白区域对折于检测板下部，取0.36g葡萄糖和0.012g鲁米诺加入到40mlph8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，完全溶解后取20μl所得溶液滴加到检测板的圆形亲水工作区域中，将此纸基双模式设备连接到电化学工作站精准检测铅离子浓度。

7.分别绘制电化学发光强度和灰度与铅离子浓度的标准曲线，完成铅离子的测定。

采用本发明方法测得的结果见表1。

从表1中的结果可以看出：本发明一种纸基双模式检测铅离子的方法具有较好的准确性，可用于实际样品的测定。

序列表

<110>济南大学

<120>一种纸基双模式检测铅离子的方法

<130>2017

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tttcatctcttctccgagccggtcgaaatagtgagt36

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

actcactataggaagagatg20