本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
胶原是一种纤维状糖蛋白，它是由三股螺旋体形成的α-肽链网状结构。目前已发现胶原达10种之多，存在于不同组织。ⅳ型胶原蛋白是构成基底膜的重要成分。正常肝内基底膜主要存在于血管、淋巴管、胆管周围，肝窦壁处缺乏。在肝病时随炎症发展，纤维组织增生活跃，纤维组织生成过程中有大量胶原沉积，各种胶原均有所增加，但其中最为重要的就是构成基底膜的ⅳ型胶原蛋白的增加。目前认为，ⅳ型胶原蛋白的测定可作为检查肝纤维化的近代指标。
目前，检测ⅳ型胶原蛋白的方法主要是放射免疫分析方法，但放射免疫分析方法的具体操作相对繁琐，且存在一定的放射污染，投入多等问题。
因此，目前急需一种操作简单、无污染、成本低的ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种操作简单、无污染、成本低的ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒及其使用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂r1：
其溶剂为纯化水；
试剂r2：
其溶剂为纯化水；
所述胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的原料成分为：胶乳微球、ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体和聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在整体试剂r2中的含量为9％-11％。
作为本发明的优选方式之一，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂r1：
其溶剂为纯化水；
试剂r2：
其溶剂为纯化水；
所述胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的原料成分为：胶乳微球、ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体和聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在整体试剂r2中的含量为10％。
作为本发明的优选方式之一，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂r1：
其溶剂为纯化水；
试剂r2：
其溶剂为纯化水；
所述胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的原料成分为：胶乳微球、ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体和聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在整体试剂r2中的含量为10.5％。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1的mopso缓冲液的ph为6.5。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2的mopso缓冲液的ph为6.5。
一种ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品与试剂r1混合，37℃孵育5min；
(2)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度a1；
(3)再与试剂r2混合，37℃反应5min；
(4)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度a2；
(5)根据吸光度变化值计算出样本中ⅳ型胶原蛋白的浓度。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)的试剂r1和步骤(3)的试剂r2的体积比为4:1。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)的待测样品与试剂r1和试剂r2构成的试剂液之间的体积比为1:50。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)和步骤(4)中，在波长660nm处测定吸光度a1和a2。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，吸光度变化值为δa，即a2减去a1后的值。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度和准确度，且使用操作简单、快速，从检测到出结果只需10分钟；
(2)本发明所形成的抗原抗体复合物，稳定性佳，在特定波长下有一定的吸光度，特异性强；
(3)本发明无需配备专用的大型仪器设备，成本低、无污染；
(4)可用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，可大规模的开展和推广。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂r1：
其溶剂为纯化水；
试剂r2：
其溶剂为纯化水；
所述胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的原料成分为：胶乳微球、ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体和聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在整体试剂r2中的含量为9％。
实施例2
本实施例的一种ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂r1：
其溶剂为纯化水；
试剂r2：
其溶剂为纯化水；
所述胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的原料成分为：胶乳微球、ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体和聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在整体试剂r2中的含量为11％。
实施例3
本实施例的一种ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂r1：
其溶剂为纯化水；
试剂r2：
其溶剂为纯化水；
所述胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的原料成分为：胶乳微球、ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体和聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在整体试剂r2中的含量为10％。
实施例4
本实施例的一种ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂r1：
其溶剂为纯化水；
试剂r2：
其溶剂为纯化水；
所述胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体的原料成分为：胶乳微球、ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体和聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，其中，聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物在整体试剂r2中的含量为10.5％。
实施例5
本实施例的一种上述实施例中ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂r1：
①按照上述实施例中试剂r1的组分含量，配制mopso缓冲液，并用稀盐酸或氢氧化钠调节ph至6.5，作为r1缓冲液；
②按照上述实施例中试剂r1的组分含量，将nacl、nan3、阿拉伯胶、tween-80、peg-2000溶于r1缓冲液中，搅拌均匀，待所有原料充分溶解，即制得试剂r1；
(2)配制试剂r2：
①按照上述实施例中试剂r2的组分含量，配制mopso缓冲液，并用稀盐酸或氢氧化钠调节ph至6.5，作为r2缓冲液；
②按照上述实施例中试剂r2的组分含量，将nacl、nan3、bsa、甘油溶于r2缓冲液中，搅拌均匀，即得r2分散液；
③制备胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体：
a.取粒径为80nm(20g/l)和120nm(40g/l)的胶乳微球于100mmmes缓冲液中，加入50g/l的edac溶液，混匀后于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清；再加入50g/l的nhs溶液恢复至原体积后，混匀于37℃环境中孵育混匀1h，离心去上清，得混合微球乳液；
b.在混合微球乳液中加入上述组分含量的聚乙烯对氯甲基苯乙烯共聚物，在37℃温度下反应2h，共聚80nm和120nm粒径的胶乳；离心沉淀，将剩余物质分散于mes缓冲液中，反复3次，最后于mes缓冲液中恢复至原体积，再加入ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体，于37℃下反应3.5h，离心，将沉淀物分散于原体积的pbs缓冲液中，反复3次，最后将沉淀物分散于原体积的nhs缓冲液中，加入bsa30g/l；
c.4℃封存48h，得最终所需的胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体；
④用r2分散液来溶解得到的胶乳包被的ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体，超声分散，最终制得试剂r2。
实施例6
本实施例的一种上述实施例中ⅳ型胶原蛋白检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将5ul待测样品与200ul试剂r1混合，37℃孵育5min；
(2)用全自动生化分析仪在波长660nm处测定反应后的吸光度a1；
(3)再与50ul试剂r2混合，37℃反应5min；
(4)用全自动生化分析仪在波长660nm处测定反应后的吸光度a2；
(5)根据吸光度变化值δa＝a2-a1，计算出样本中ⅳ型胶原蛋白的浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。