一种毛细管电泳的质谱联用定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法及应用与流程

本发明属于定量分析技术领域，更具体涉及一种ce-ms定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，同时还涉及一种毛细管电泳的质谱联用(ce-ms)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法的用途。

背景技术：

阿兹海默病(alzheimerdisease，ad)又称阿尔兹海默病、老年痴呆症、老人失智症、脑退化症等，是一种持续性神经功能障碍，也是失智症中最普遍的成因。早期最显著的症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失，而长期记忆则相对不受病情的影响。随着病情的加重，病人的语言能力、空间辨别能力、认知能力会逐步衰退。阿兹海默病主要分为家族性阿兹海默病与阿兹海默老年痴呆症两种，其中又以后者较常见。在ad病的致病因素中，虽然一些特定的基因突变(如presenilin-1，presenilin-2和app基因)是可以直接造成ad，但由于基因突变引起的ad只占ad病例的极少部分。往往只有当阿兹海默病患者死亡之后才能诊断出他们患有此病，因为只有对大脑中中枢神经细胞的损失情况和衰退情况(脑组织的减少情况或者萎缩情况)进行检查后才能对这种病做出诊断，非常不利于阿兹海默病的早期诊断和有效预防。因此，有必要提出一种能够通过早期检测来诊断阿兹海默病的方法。

有研究显示，胆固醇水平与ad病之间存在某种关联，胆固醇代谢异常、24s-羟基胆固醇水平的改变、脂蛋白a的不同亚型和水平变化、apoe对胆固醇代谢的调节以及apoe自身与aβ的相互作用等已经被证实与痴呆的发生有密不可分的关系。脂类对细胞质膜的结构和功能整体性起着重要的作用，膜脂非随机分布，而是分布在不同部位。这些部位由面朝胞外和面朝胞浆的片层、胆固醇池、环状脂类和脂筏组成。许多流行病学研究表明高血清胆固醇浓度与ad的发病率增加有一定的关联，然而ad患者脑内是否有胆固醇的合成和代谢改变尚不清楚。

磷脂(pl)并非单一的化合物，而是含有磷酸基和多种脂质的一类物质的总称，血清中pl包括：卵磷脂(60％)和溶血卵磷脂(2％-10％)，磷脂酰乙醇胺(2％)，鞘磷脂(20％)。磷脂的主要功能是维持正常完整的细胞膜，在早期的阿兹海默病分子病理学中细胞膜磷脂就会发生变化，并且可以为阿兹海默病染色体丢失提供分子基础。磷脂酰胆碱(pc)是主要的真核细胞膜磷脂，所占磷脂比例接近40％，含有磷脂的胆碱是细胞膜完整性的基本要素。由于氧化作用产生的磷脂病理学故障不可避免的反映出由pc的分解代谢产物如溶血磷脂酰胆碱(lyso-pc，lpc)等的变化，溶血磷脂酰胆碱(lpc)和磷脂酰胆碱(pc)的改变和两者比值的细微变化都会导致细胞消亡。一些研究发现蛋白和脂质的氧化作用直接影响了大脑区域从而诱发阿兹海默病(ad)。然而现有的分析方法中，esi-ms直接定量法前处理简单，所需样品少，用时短，但是灵敏度较低，难以分析丰度较低的脂质，而且加入的不挥发性li⁺作为缓冲盐容易导致离子源污染，缩短质谱仪使用寿命。因此，提出一种新的血清中磷脂酰胆碱的检测方法非常有必要。

毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，被认为是一种高速、高效的物质分离方法，特别在分析复杂的生物样品和样品量极少时，ce具有独特的优越性。但是，ce有限的进样量也对检测器的灵敏度提出了很高的要求，传统的紫外光度检测器灵敏度不高、选择性差，无法给出样品的结构信息。质谱(massspectrometry，ms)即用电场和磁场将运动的离子按其质荷比分离后进行检测的方法。与传统的紫外光度检测器相比，质谱除了可以提供分子质量信息外，还可以提供未知组分的结构信息，具有很高的选择性和灵敏度。将ce和ms联用可以实现高效分离和高灵敏度、多结构信息的检测。

近几年，关于ce-ms方法学研究的报道比较多，主要是关于新接口技术的研究，使得ce-ms的联用更加方便，效率更高；还有的报道集中在ce-ms在各领域的应用，如环境分析、食品药品分析、生物大分子及其相关物质分析、中草药及其他天然产物活性毒性成分分析、代谢组学研究及生物标志物筛选等。

然而，目前还没有一种利用ce-ms联用分析血清中磷脂，进而判断其与阿兹海默病发病关联性的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种毛细管电泳的质谱联用(ce-ms)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，将ce和ms联用可以实现对血清中的不同种类磷脂以及不同碳链长度和不饱和度的磷脂酰胆碱(pc)和溶血磷脂酰胆碱(lpc)的高效分离和高灵敏度、多结构信息的检测。

本发明的另一个目的是在于提供了一种毛细管电泳的质谱联用(ce-ms)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法在检测阿兹海默病中的应用。目前通过遗传基因组学、蛋白质组学、代谢组学、分子生物学等高科技技术手段探阿兹海默病的发病病因机制和通路，寻找脑内小分子生物活性致病因子是研究热门，在阿兹海默病早期发现、早期诊断领域探索小分子活性生物标志物的研究越来越得到重视，磷脂是机体内重要的生物活性物质，是信息分子前体的贮备形式，其代谢产物可以通过影响人体内分泌或神经来调节人体代谢，改善记忆障碍，提高记忆功能。人体内磷脂对脑细胞的再生、活化、衰老起着关键的作用，血清中磷脂代谢异常可能是导致阿兹海默病发生的一个重要因素，所以精确定量分析血清中磷脂酰胆碱是对阿兹海默病早期诊断的一个重要途径之一。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种毛细管电泳的质谱联用(ce-ms)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，包括如下步骤：

s1.血清样品的处理：取血清样品加入磷脂酰胆碱内标物，直接加入甲醇，冰上孵育，离心，转移上清，氮气吹干保存，毛细管电泳的质谱联用(ce-ms)定量检测前用甲醇溶解，离心去上清准备毛细管电泳进样；所述内标物为磷脂酰胆碱17:0/14:1、mw717.996；

s2.毛细管电泳条件：电泳缓冲液中氯仿:甲醇为2:1、含10mm醋酸铵，未涂层熔融二氧化硅毛细管为分离通道，压力0.4-0.6psi进样，分离电压为25kv，分离时间9－11min；

s3.质谱条件：离子源esi源，电喷雾电压+5200v，碰撞气体8，气帘气10，雾化气压力0.15－0.25mpa，辅助气流速0，碰撞气6，离子化温度0，去簇电压130v，射入电压10v，碰撞室射出电压15v；

s4.定量分析：取浓度梯度范围为0.01～1ng/μl的磷脂酰胆碱标准品加入所述内标物，与s1处理后的血清样品在相同的条件下进行ce-ms定量检测，根据标准品溶液的浓度及峰面积，做线性回归，得线性方程；再根据此线性方程及检测所得的峰面积，计算出血清样品中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的浓度；所述标准品为磷脂酰胆碱17:0/14:1、mw717.996，磷脂酰胆碱12:0/13:0、mw635.853，磷脂酰胆碱17:0/20:4、mw796.108。

本发明通过毛细管电泳ce结合电喷射离子化串联质谱ms对不同血清样品中不同分子结构的pc和lpc分别定量。在pc和lpc的提取方法上，比较了氯仿/甲醇提取体系和甲醇直接抽提法，发现甲醇直接抽提法的回收率和检测灵敏度更优。同时，优化了本发明定量分析方法的毛细管电泳及质谱条件，使得检测的准确性更佳。

优选地，本发明ce/esi/ms接口采用同轴液体鞘流接口。

所述接口是一个同心的不锈钢毛细管套在电泳毛细管末端，鞘内充有鞘液；在所述不锈钢套外再套一个同心的钢套，鞘内通鞘气；所述鞘液与毛细管电泳缓冲液液体在尖端混合，同时被鞘气雾化；鞘液流量通常为每分钟纳升至数微升之间，但显著高于ce流速。由于鞘液的稀释作用，雾流稳定性得到改善，所述接口设计可以提供稳定的喷射流。但是与无鞘接口相比，由于被分析物被鞘液稀释，将会导致灵敏度下降。因此，本发明有针对性地优化血清样品的分离条件，包括电泳参数、鞘液组成、鞘液流速、毛细管喷雾头的位置、干燥气温度、雾化器压力和气速等参数，从而形成上述ce-ms定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，所述方法获得较高的质谱信号相应，并得到较低的检测限。

优选地，制作所述线性方程采用的标准品为磷脂酰胆碱17:0/14:1、mw717.996。

优选地，步骤s1包括如下步骤：取2μl血清样品加入50ng标准品作为内标，直接加入1ml甲醇，涡旋振荡后于冰上孵育10min，混合物于10000g室温(20－25℃，以下相同)下离心5min，转移上清液，氮气吹干，-20℃保存；ce-ms定量检测前用100μl甲醇溶解，1000g离心取上清50μl，准备毛细管电泳进样。

优选地，步骤s2的电泳缓冲液在实验前用0.45μm滤膜过滤，并用超声脱气5min；毛细管在使用前，用0.1mol/l氢氧化钠冲洗20min，然后用水和所述电泳缓冲液分别冲洗10min。

优选地，步骤s3所述质谱的定量模式采用多级反应监测模式，对磷脂酰胆碱的定量下限为0.0001ng/μl。

发明人在定量方法上采用多级反应监测模式(multiplereactionmonitoring，mrm)对血清样品的pc和lpc进行相对定量分析，与前体离子扫描模式(precursorscanning，pre)相比，其检测限和回收率等指标更优。

针对多级反应监测模式mrm，本发明首先检测到具有特异性的母离子，然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导(collision-induced)，最后去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。通过反复验证碎片离子和特异性母离子，最终选取15对特征母离子-子离子对同时进行mrm模式扫描，再采用峰面积积分方法进行定量分析。

优选地，步骤s3先用esi-ms直接扫描模式对所述内标物进行全图谱扫描，再用增强子离子扫描模式对母离子m/z718进行ms/ms寻找到特征碎片离子，m/z184.1为其中的一个特征碎片离子，再用多级反应监测模式对内标物中的磷脂酰胆碱进行相对定量。

优选地，步骤s4所述磷脂酰胆碱标准品浓度梯度分别为0.01ng/μl、0.05ng/μl、0.1ng/μl、0.5ng/μl、1ng/μl。

与常用的高效液相色谱－质谱联用(hplc-ms)技术相比，ce-ms技术需要的样品量更少、分离效率更高、分析速度更快，但是由于ce进样量较少、分离的重现性不好、定量分析时线性范围相对较窄等原因，在生物化学分析领域的发展受到限制。与ce-ms中esi-ms正负离子直接扫描定量法相比，本技术方案灵敏度高，重现性好，可以消除q1直接定量存在的基线噪音；与前体离子扫描模式(precursorscanning，pre)定量相比，本技术方案的线性度更好(r＝0.99821＞0.99)，并且定量标准偏差(sd)值相对更小。此方法技术难点是优化碰撞能量的大小和被测脂质分子大小的关系，以得到最低的检测限和最高的检测灵敏度。

本发明还提供上述ce-ms定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法在检测阿兹海默病中的应用。

发明人对血清中的磷脂酰胆碱(pc)、溶血磷脂酰胆碱(lpc)、lpc/pc等数据做了统计，以获得更多的关于阿兹海默病中磷脂代谢的信息。在pc和lpc的定量研究中选用了电喷射离子化串联质谱，不仅是对总的pc和lpc的浓度做统一定量，而是对这些不同分子结构的pc和lpc分别定量。统计四组血清样品的pc和lpc以及lpc/pc比值，发现在摄入高胆固醇食物后，雄性血清中pc含量高于雌性，lpc/pc值升高更缓慢，验证了有关雌性患阿兹海默病的几率高于雄性的报道。由于氧化作用中磷脂酰胆碱不饱和酰基链的敏感性，发明人推测脂质氧化作用导致了高浓度胆固醇诱发的阿兹海默病体内含有磷脂的胆碱浓度发生变化。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：

它采用的甲醇直接抽提法提取血清样品中的磷脂酰胆碱pc和溶血磷脂酰胆碱lpc，回收率和检测灵敏度较高；采用多级反应监测模式mrm对血清中pc/lpc进行相对定量分析，排除大量干扰离子，检测限达0.0001ng/μl，重现性好，检测的灵敏度、准确度较高。通过本发明方法的应用，发现在摄入高胆固醇食物后，雄性血清中pc含量高于雌性，lpc/pc值升高更缓慢，进一步验证了有关雌性患阿兹海默病的几率高于雄性的现象；同时，本发明方法在早期检测阿兹海默病中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为实施例3增强子离子扫描模式寻找pc718母离子的碎片离子。

图2为实施例3前体离子扫描模式的检测限实验；其中a.0.01ng/μl；b.0.05ng/μl；c.0.1ng/μl。

图3为实施例3多级反应监测模式的检测限实验；其中a.0.0001ng/μl；b.0.0005ng/μl；c.0.001ng/μl。

图4为实施例4在esi正离子模式下对3种pc标准品混合物的全扫描质谱图。

图5为实施例4增强子离子扫描模式寻找pc标准品混合物母离子的碎片离子；其中a.m/z636；b.m/z718；c.m/z796。

图6为实施例4前体离子扫描模式下的3种pc标准品混合物。

图7为实施例4最佳碰撞能下对3种pc标准品混合物的mrm扫描图。

图8为实施例5两种提取条件得到的pc和lpc在mrm扫描模式下定量结果比较。

图9为实施例6相对定量方法的线性关系；a为前体离子扫描，b为多级反应监测模式。

图10为应用例前体离子扫描模式下含有pc718内标的血清样品；a.对照组；b.实验组。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

具体的，各试剂及设备可采用市售：熔融二氧化硅毛细管360μmo.d.×50μmi.d.购自polymicrotechnologies公司(phoenix，az，usa)，甲醇、异丙醇、氯仿、购自emscience公司(gibbstown，nj，usa)，醋酸铵购自fisherscientific公司(fairlawn，nj，usa)，甲酸购自bdh公司(toronto，canada)；毛细管电泳仪为princece系统(princetechnologies,thenetherlands)，与api4000qtrap质谱仪(appliedbiosystems/sciex,concord,canada)通过一个微型喷雾接口耦合，一个死体积三通管(250mmi.d.,chromatographicspecialties,brockville,canada)；

本发明采用同轴液体鞘流接口，鞘液(异丙醇：甲醇＝2:1)通过微量注射泵以1μl·min^-1的流速进入所述三通管，血清样品使用10mm醋酸铵(氯仿：甲醇＝2：1)缓冲液在90cm长度的熔融二氧化硅毛细管中实现分离。

脂质标准品包括pc(17:0/14:1，mw717.996)，pc(12:0/13:0，mw635.853)，pc(17:0/20:4，mw796.108)购自avantipolarlipids公司(birmingham,al)。

动物实验：血液样品是从12周(0周，3周，6周，8周，12周)连续人工喂食高胆固醇食物或普通饲料的兔子(非转基因)的静脉抽取，并储存于含有edta抗凝剂的ep管内，4℃、3500rpm、离心20min获得血清样品，使用前储存于-80℃冰箱。将血清样品分为4组并分别标记：965m(对照组，雄性)，962m(实验组，雄性)，1114f(对照组，雌性)，1098f(实验组，雌性)；实验组为喂食高胆固醇食物，对照组为喂食普通饲料，其他培养条件完全相同。

以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。

实施例1：

综合前期研究结果及大量实验，本实施例提出一种毛细管电泳的质谱联用(ce-ms)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法，包括如下步骤：

s1.血清样品的处理及优化：

方法一：氯仿/甲醇溶液提取。

分别从1114f(对照组，雌性)和1098f(实验组，雌性)2组血清样品中各取2μl血清样品加入50ngpc标准品(17:0/14:1，mw717.996)作为内标，用pbs(1×)稀释至500μl，与3ml氯仿/甲醇＝1/2(v/v)混合，涡旋振荡后在冰上孵育10分钟。加入1ml氯仿和1.3ml超纯水，低温涡旋振荡后于1750g，10℃离心10分钟，可见两相之间界面清晰，将下相转移至新的玻璃管内，氮气吹干，-20℃保存，以上所有操作需在玻璃器皿中完成，避免塑料ep管和有机试剂发生反应。提取的pc和lpc用ce-ms定量检测之前用100μl甲醇溶解，1000g离心取上清50μl毛细管电泳进样。

方法二：甲醇直接提取法。

从相同的2组血清样品(1114f、1098f)中各取2μl血清样品加入50ngpc标准品(17:0/14:1，mw717.996)作为内标，直接加入1ml甲醇，涡旋振荡后于冰上孵育10分钟。混合物于10000g室温下离心5分钟，转移上清液于新玻璃管，氮气吹干，-20℃保存。提取的pc和lpc用ce-ms定量检测之前用100μl甲醇溶解，1000g离心取上清50μl毛细管电泳进样。

按照上述方法一或方法二处理相同的血清样品，进行提取条件优化实验。两种方法的提取效果比较如图1所示，图8中对照c/m和实验c/m为血清样品用方法一(pbs稀释之后用氯仿/甲醇体系)离心提取的定量结果，对照m和实验m为血清样品用方法二(直接用甲醇)提取的定量结果。可以看出在对照组1114f和实验组1098f体内pc和lpc的分布总体趋势类似的情况下，甲醇直接提取的结果分辨率更高，尤其是对于m/z818.7pc(38:0)这种在血清中含量相对较低的磷脂酰胆碱的研究，甲醇直接提取法更显优势。

比较两种方法的回收率，计算方法一的回收率如表3，以pc718标准品为目标测算提取体系的回收率。为了将环境误差降到最低，提取步骤和血清样品内pc提取同步进行，pc718和血清用方法一离心提取，pc718的初始加入量为50ng，mrm同步定量后结合标准曲线计算出初始加入量峰面积为327245。计算发现该体系的回收率仅为30％-50％。推测由于方法一氯仿/甲醇体系中用到的溶剂体积比较大，可能会有pc残留在管壁，于是做了直接从2ml溶剂中转移pc至定量小管的操作实验，最终测得回收率仅为21.5％，此结果验证了操作过程pc的丢失推测。

为了将操作过程pc的丢失降至最低值，发明人采用较小体积的溶剂(甲醇)反复多次转移至定量小管的操作方法，从表4的定量结果可以看出，适当降低溶剂体积和反复多次的操作可以更好的提高产品回收率。

表3氯仿/甲醇体系提取pc718的回收率

表4在不同体积的溶剂中pc718的回收率

用反复多次操作的方法分别利用方法一或方法二提取pc718，并对回收率做了比较，如表5，c/m为氯仿/甲醇提取体系，m为甲醇提取。最后测得方法二获得的pc回收率更高。

表5比较氯仿/甲醇体系和甲醇提取pc718的回收率

将两种方法的提取效果及回收率结合发现，方法二甲醇直接提取法对血清样品进行处理，提高萃取效率、简化实验操作，结果分辨率更高，产品的回收率也更高。

s2.毛细管电泳条件：

经大量实验，发明人对毛细管电泳条件优化如下：10mm醋酸铵(氯仿：甲醇＝2：1)为电泳缓冲液；未涂层熔融二氧化硅毛细管为分离通道，压力进样(500mbar×12s)，分离电压为25kv，分离时间10min。

实验前缓冲溶液用0.45μm滤膜过滤，并用超声波脱气5min。

毛细管在使用前，用0.1mol/l氢氧化钠冲洗20min，然后用水和电泳缓冲液分别冲洗10min。每个样品运行之后用缓冲液冲洗5min，同一缓冲溶液运行3～4次后应更换一次。

s3.质谱条件：

经大量实验，发明人对质谱条件的优化如下：

离子源：esi源；

电喷雾电压：+5200v；

碰撞气体(cad)：8；

气帘气(cur)：10；

雾化气(gs1)压力：0.2mpa；

辅助气流速(gs2)：0；

碰撞气(cad)：6；

离子化温度(tem)：0；

去簇电压(dp)：130v；

射入电压(ep)：10v；

碰撞室射出电压(cxp)：15v。

扫描方式采用正离子方式检测、前体离子扫描模式(pre)、多级反应监测模式(mrm)，扫描宽度m/z＝0.5；检测到具有特异性的母离子，对选定的特异性的母离子进行碰撞诱导，去除其他离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集，获得16对特征母离子-子离子对，如表1所示。

表1mrm扫描模式下16对特征母离子-子离子的驻留时间和碰撞能选择

检测离子：pc，lpc(15个母离子和1个内标母离子见表1，子离子184.1，碰撞能30-50ev)；内标物17:0/14:1pc(母离子718.7，子离子184.1，碰撞能45ev)；12:0/13:0pc(母离子635.9，子离子184.1，碰撞能35ev)；17:0/20:4pc(母离子796.1，子离子184.1，碰撞能45ev)。

先用esi-ms直接扫描模式对磷脂酰胆碱pc(17:0/14:1，mw717.996)标准品进行全图谱扫描，再用增强子离子扫描(enhancedproduction，epi)模式对母离子m/z718进行ms/ms寻找到特征碎片离子，如图1所示，m/z184.1为m/z718的一个特征碎片离子。

再用前体离子扫描模式(pre@184.1)和多级反应监测模式(mrm718/184.1)对标准品中的磷脂酰胆碱进行相对定量，图2和图3分别为前体离子扫描模式和多级反应监测模式的检测限实验。由于前体离子扫描模式的灵敏度较低，所以选用了较高浓度的pc718标准品，分别为图2中的三种：a.0.01ng/μl；b.0.05ng/μl；c.0.1ng/μl，以信噪比约等于3为标准，可以看出pre@184.1的定量下限是0.05ng/μl。相比较mrm扫描模式的灵敏度较高，所以选用了较低浓度的pc718标准品，分别为图3中的三种：a.0.0001ng/μl；b.0.0005ng/μl；c.0.001ng/μl，以信噪比约等于3为标准，可以看出mrm模式的定量下限是0.0001ng/μl。

用esi-ms正离子直接扫描模式对磷脂酰胆碱的三种标准品pc(17:0/14:1，mw717.996)，pc(12:0/13:0，mw635.853)，pc(17:0/20:4，mw796.108)进行全图谱扫描，获得图4的全扫描质谱图。m/z658.4，m/z740.5，m/z818.5分别为m/z636.5，m/z718.5，m/z796.6的[m+na]⁺。在进行q1全扫描时，为了使钠盐的含量降低，调节电泳分离的进样压力500mbar到300mbar，同时加大分离电压从25kv到30kv，降低去簇电压(dp)从130v到80v，可以达到最好的状态。

用增强子离子扫描(enhancedproduction，epi)模式对母离子m/z636.5，m/z718.5，m/z796.6进行ms/ms寻找到特征碎片离子，如图5所示，m/z184.1为它们的一个特征碎片离子。再用前体离子扫描模式(pre@184.1)验证母离子-子离子的配对情况如图6所示。

于是找到三组特征配对离子(m/z637/184.1、m/z718/184.1、m/z797/184)进行mrm扫描定量，为了选择最佳碰撞能量，每组特征离子对都在20-55ev的能量梯度下做了表2中的mrm面积积分，其中m/z637/184.1在碰撞能为40ev时获得最大积分面积1.69e+06，m/z718/184.1在碰撞能为45ev时获得最大积分面积3.07e+06，m/z797/184在碰撞能为45ev时获得最大积分面积2.84e+06。

表2mrm扫描模式下3种pc标准品混合物母离子-子离子的碰撞能选择

同时对三组配对离子分别在它们的最佳碰撞能下做mrm扫描定量，得到扫描图7，如果需要对样品进行相对定量，就对此图中的峰面积进行积分计算。从表2中可以看出碰撞能量大小和mrm定量的准确性存在一定的规律，从而推算出表1中含有内标pc的血清样品在mrm扫描模式下16对特征母离子-子离子的碰撞能。

从图7标准品pc718测定结果的线性关系图可以看出，多级反应监测模式比前体离子扫描模式的线性关系更好，并且定量标准偏差(sd)值相对更小。这一结果更说明在相对定量方法的选择上，mrm法具有更好的稳定性和准确性。

s4.定量分析：

为保证定量的准确性，用磷脂酰胆碱pc(17:0/14:1，mw717.996)标准品作为研究对象，对五种浓度梯度用ce-esi-ms分别在前体离子扫描(precursorscanning，pre)模式和多级反应监测(multiplereactionmonitoring,mrm)模式下做了定量分析。考虑到有机溶液的挥发，每种浓度下都连续监测6次之后取均值。以标准pc的浓度为横坐标，pre@184.1和mrm(718/184.1)色谱图的峰面积积分为纵坐标，做线性关系图。图9为标准品pc(17:0/14:1)测定结果的线性关系图，其中a为前体离子扫描模式，b为多级反应监测模式，两者对比后发现b的线性关系更好(r＝0.99821＞0.99)，并且定量标准偏差(sd)值相对更小。综合之前提到的mrm扫描模式相对于pre扫描模式具有更低的检测限和更高的灵敏度，这一结果更说明在相对定量方法的选择上，mrm法具有更好的稳定性和准确性。

表6ce-ms相对定量的前离子扫描重现性和稳定性等参数

表7ce-ms相对定量的mrm扫描重现性和稳定性等参数

从表6～7中可以看出，由于溶剂的挥发性对结果的影响随着标准品浓度的增加而增大，所以导致样品在在高浓度时线性标准偏差增大，实验过程中需要注意的是尽可能快速的重复同一模式扫描，另外需要在检测管口加上一个防止液体挥发的盖子，从而提高实验重现性。

取浓度梯度范围为0.01～1ng/μl的磷脂酰胆碱标准品加入所述内标物，与s1处理后的血清样品在相同的条件下进行ce-ms定量检测，根据标准品溶液的浓度及峰面积，做线性回归，得线性方程y＝5.8006×10⁵x+2116.6401(r＝0.9982)；再根据此方程及检测所得的峰面积，计算出血清样品中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的浓度；所述标准品为磷脂酰胆碱17:0/14:1、mw717.996，磷脂酰胆碱12:0/13:0、mw635.853，磷脂酰胆碱17:0/20:4、mw796.108。

实施例2：

一种毛细管电泳的质谱联用(ce-ms)定量分析血清中磷脂酰胆碱的方法在检测阿兹海默病中的应用，其过程是：(在pc和lpc的定量研究中我们还分析了个体差异水平的磷脂种类)。

先用前体离子扫描模式(pre@184.1)分别在对照组和实验组的血清样品中寻找m/z184.1的特征配对母离子，再用这15对特征配对母离子-子离子对12周内不同时间取样的4组血清样品分别进行多级反应监测扫描(mrm)相对定量。前体离子扫描结果如图10所示，结合lipidmaps数据库，除开同样的结构，可以推测出血清中所含的13种pc和lpc(表8)。

表8前体离子扫描模式鉴定出血清中13种磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱。

结果显示，0-12周内对照组体内的溶血性磷脂酰胆碱含量相对比较稳定，当连续进食高胆固醇含量的食物后，实验组溶血性磷脂酰胆碱含量增加，第8周到达最大值后呈下降趋势；推测兔的胆固醇代谢有一个适应期周期，即为8周。lpc的变化和性别差异不明显，在高胆固醇摄入后，实验组体内的lpc均呈上升趋势，均在对照组水平之上。pc的变化和性别差异有一定关系，在高胆固醇摄入后，实验组雌性的大部分pc量均低于对照组的正常水平，除了pc(28:0)和pc(30:2)的量在摄入高胆固醇后呈持续上升趋势并且在三周后明显高于对照组的正常水平值。实验组雄性的大部分pc量在高胆固醇摄入后均高于对照组的正常水平，除了pc(38:4)一直呈下降趋势，在三周后开始低于对照组的正常水平值。总体上，在摄入高胆固醇后雄性血清pc值高于雌性。

摄入高胆固醇后，pc含量的改变很大一部分是由于自身的氧化作用形成代谢产物lpc。我们选取了lpc(18:2)/pc(36:2)、lpc(18:1)/pc(36:2)、lpc(18:0)/pc(36:2)，可以明显发现在摄入高胆固醇后lpc/pc一直呈上升趋势，在8周适应期后不再上升。性别差异没有本质差别，只是在上升程度和速度略有差别，雌性lpc/pc在三周内可达到最大值1，而雄性则需要6-8周达到最大值。

从4组血清样品pc、lpc和lpc/pc比值的检测结果来看，在摄入高胆固醇食物后，雄性血清中的pc含量高于雌性，lpc/pc值升高更缓慢，进一步验证了雌性患阿兹海默病的几率高于雄性。

磷脂酰胆碱pc本身是动植物细胞的必需组分，是动物细胞膜中含量最丰富的磷脂。它既亲脂又亲水，所以具有乳化功能，可以将体内的水分和油脂充分混合而避免水分大量流失；也可将多余的脂肪化为较小的乳滴排出体外；可将血液中的胆固醇和脂肪酸化为极细的颗粒，从血管中排出，使低密度脂蛋白降低，高密度脂蛋白升高，从而有助于脑动脉硬化的治疗和避免阿兹海默病的发生，所以本发明将通过ce-ms定量分析lpc/pc值作为阿兹海默病早期诊断的一个重要指标。

以上详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。